Заказ лада онлайн: LADA запустила систему онлайн-заказа автомобилей

Содержание

«АвтоВАЗ» запустил систему онлайн-заказов на автомобили

https://ria.ru/20200416/1570126475.html

«АвтоВАЗ» запустил систему онлайн-заказов на автомобили

«АвтоВАЗ» запустил систему онлайн-заказов на автомобили — РИА Новости, 16.04.2020

«АвтоВАЗ» запустил систему онлайн-заказов на автомобили

«АвтоВАЗ» внедрил систему заказа автомобилей через интернет, так можно купить любую модель Lada, говорится в сообщении компании. РИА Новости, 16.04.2020

2020-04-16T12:58

2020-04-16T12:58

2020-04-16T12:58

экономика

московская область (подмосковье)

москва

автоваз

авто

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdnn21.img.ria.ru/images/155951/61/1559516151_0:100:3271:1940_1920x0_80_0_0_29a790a75d6c3d641b230e6a20660da3.jpg

МОСКВА, 16 апр — РИА Новости. «АвтоВАЗ» внедрил систему заказа автомобилей через интернет, так можно купить любую модель Lada, говорится в сообщении компании. После оплаты, в зависимости от ситуации в регионе, автомобиль можно забрать в автосалоне или заказать доставку на дом с помощью эвакуатора, уточняет «АвтоВАЗ».В то же время, по данным ассоциации автодилеров РоАД и самих автодилеров, в Москве и Московской области на этой неделе полностью запрещена работа автосалонов, включая сервисное обслуживание машин, которое еще на прошлой недели было доступно в Подмосковье. Наиболее распространенное предложение дилеров сейчас — оставить заказ на автомобиль, чтобы получить его после снятия ограничительных мер.

https://ria.ru/20200415/1570071390.html

московская область (подмосковье)

москва

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2020

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria. ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdnn21.img.ria.ru/images/155951/61/1559516151_540:0:3271:2048_1920x0_80_0_0_1bf32b366b4a415b8941f797b54c7b31.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

экономика, московская область (подмосковье), москва, автоваз, авто

АВТОВАЗ приостановил прием заказов на ряд модификаций LADA Vesta и Granta

АВТОВАЗ в ноябре принимает от дилеров заказы на январь 2022 года, однако в списке доступных автомобилей присутствуют не все модификации. Как пишет портал «Лада. Онлайн» со ссылкой на дилеров LADA, это связано с производственными ограничениями из-за нехватки электронных компонентов.

Так, не доступны к заказу на январь 2022 года автомобили LADA Vesta Cross и Vesta SW Cross, а также LADA Granta Drive Active и Granta с автоматической трансмиссией. Когда возобновят заказы на эти комплектации автомобилей LADA, пока неизвестно. Также в списке отсутствует пятидверная LADA Niva Legend, которая, судя по всему, с 2022 года больше выпускаться не будет.

Между тем, АВТОВАЗ возобновил прием заявок от дилеров на трехдверные LADA Niva Legend, но уже с датой отгрузки в следующем году – их сборка начнется только в январе 2022-го, сообщает паблик «Нетипичный АВТОВАЗ». Напомним, прием дилерских заказов на LADA Niva Legend 3d был приостановлен еще в октябре. Причиной стала большая задолженность по отгрузке этих машин из предыдущих заявок, принятых еще в начале осени. Чтобы не тащить старые долги в новый год, завод постарался рассчитаться по ним до наступления праздничных каникул.

По предварительной информации, рабочую неделю 22-26 ноября все сборочные линии АВТОВАЗа начнут по обычным графикам, но без простоев все же не обойдется. Так, с понедельника по среду все конвейеры будут работать. А вот на четверг и пятницу ожидается простой на сборочной линии LADA Granta.

Напомним, сборочные линии на АВТОВАЗе работают с перебоями с июня текущего года. Это происходит из-за проблем с поставками компонентов электроники от компании «Роберт Бош Самара», которая, в свою очередь, испытывает сложности в работе со своими поставщиками. Между тем, АВТОВАЗ планирует восполнить производственные потери за счет работы по субботам и организации 9-часовых рабочих смен после нормализации ситуации с поставками комплектующих от компании «Роберт Бош Самара».

Как ранее сообщал «АВТОСТАТ», в октябре АВТОВАЗ реализовал на российском рынке 25573 автомобиля LADA – это на 31% меньше, чем годом ранее. По итогам десяти месяцев 2021 года российские дилеры LADA продали 294422 машины, что на 11% выше показателя за аналогичный период прошлого года. В результате рыночная доля LADA с начала года составила 22,4% против 22,3% годом ранее, согласно данным АЕБ.

Во сколько обходится содержание автомобиля LADA – можно подсчитать при помощи «Калькулятора оценки стоимости владения». 

Фото: АВТОВАЗ

6001549717 Элемент зеркала Largus правый антиблик подогрев LADA

БрендLADA
Штрихкод2000403114869

Информация для покупателей

Информация по аналогам имеет исключительно справочный характер и не гарантирует совместимость с вашим автомобилем! Если Вы не уверены в том, что выбранная Вами деталь подходит к Вашему транспортному средству — обратитесь за помощью к менеджеру по подбору запчастей.

Цены указаны при заказе физическими лицами на сайте.

Фильтр

  • срок доставки
  • Доступное количество
  • Сбросить

Размещённая на сайте информация (описание, технические характеристики а так же фотографии) приведена для ознакомления и не является публичной офертой. Не может служить основанием для предъявления претензий в случае изменения характеристик, комплектности и внешнего вида товара производителем без уведомления.

 

Почему покупают 6001549717 Элемент зеркала Largus правый антиблик подогрев LADA у нас:

«Автолюбитель» — крупнейший автомобильный супермаркет на Юге Кузбасса. Он открыт в 1987 году и с тех пор является центром автомобильной торговли в городе Новокузнецке. Являемся поставщиком товарной марки LADA на территории Новокузнецка, Кемеровской области РФ, у нас несколько складов по наличию и имеем запчасти на редкие автомобили и готовы дать хорошую цену на Элемент зеркала Largus правый антиблик подогрев 6001549717 бренда LADA.

На все детали бренда LADA предоставляется гарантия.

 

Цена на 6001549717 Элемент зеркала Largus правый антиблик подогрев:

Получить цену на оригинальную или аналоговую запчасть Элемент зеркала Largus правый антиблик подогрев, и знать лучший срок доставки, которая будет удобна для вас, можно позвонив нашему менеджеру. Наши продавцы-консультанты всегда рады видеть Вас и всегда готовы оказать Вам квалифицированную услугу.

Телефон: 

+7 (906) 924-13-37

Или отправить VIN-запрос на нашем ресурсе и менеджер вам сам перезвонит.

 
Как заказать LADA 6001549717:

1. Определиться со сроками, выбрать количество и добавить Элемент зеркала Largus правый антиблик подогрев в корзину.

2. Оформить заказ, выбрать тип получения товара и тип оплаты.

3. Если товар в наличии — Вы можете буквально сразу получить свой товар в нашей точке выдачи.

Allen Guitars & Luthier Supplies Услуга по прорезке грифа

ЦЕНЫ
  • Цены указаны только за работу, они не включают материал. Перейти к Пустая страница грифа приобрести заготовки для грифа.

  • 25 долларов.00 плата за работу будет применяться к любому заказ на прорезку до 10 плат на шкалу. Наша ответственность ограничена стоимостью нашего размещения услуга.

  • При 10 досках плата за работу в размере 25 долларов снижается. Количество скидки начинаются от 5 досок. (можно смешать древесину, характеристики должны быть одинаковыми)   

  • Радиус Сервис есть также доступны.Мы иногда в нашем запасе есть необычные весы, пожалуйста смотрите страницу распродажи.

  • Цены указаны для весов ниже 30 дюймов, до 24 ладов

  • Для масштабов более 30 дюймов добавьте 1 доллар.

    00, для ладов от 25 до 30 ладов добавить 1,00 долл. США 31–36 ладов добавить 2,00 долл. США

Цены на обслуживание грифа

 долл. США
Количество Труд до Prep Толщина и линейка Labor To Slot накладки грифа Работа по прорезке плат, поставляемых заказчиком Рабочий радиус Рабочая до радиуса

Платы, поставляемые заказчиком

          *no: Кровавое дерево; * нет фигурного дерева.
1 4 4,50 доллара США за штуку. $11.00 плюс плата за работу. $17.00 плюс Плата за работу. $10 плюс лезвие за 5 долларов плата за изменение. $10 плюс лезвие за 5 долларов плата за изменение.
5 — 9 $4.00 шт. $8.00 плюс Плата за работу. $12.00 Нет платы за работу. $7 плюс лезвие за 5 долларов плата за изменение.  
10 + до 6.5 $ 3,50 шт. $6.00 Нет платы за работу. 10,00 $ $6 нет лезвия плата за изменение.  
           
Плата за работу   (до 10 лет) плат на вес) 25 долларов. 00 Плата за работу.    
           
  Дополнительные услуги      
Орех Слот 1/8″ в стиле Fender 2 доллара.00      
     
Добавлены слоты для ладов более 24 ладов  2       
Радиус Сервис подробнее см. Страница радиуса  

Как Рассчитайте стоимость вашей индивидуальной работы.

+ Цена заготовки грифа
+ Работа для обслуживания слотов из таблицы выше.
+ Подготовка платы
+ паз для гайки при необходимости.
+ Работа для Radius Service из таблицы выше.
+ Если менее 10 досок на шкалу, добавьте 25,00 долларов США. плата за работу.
 
 

 

Что говорят клиенты О наших услугах по работе с грифами
 
Уважаемый г-н. Аллен …. Я просто хотел поблагодарить вас за работу вы сделали с древесиной падаука, которую я отправил вам по почте. То гриф выглядит просто ОТЛИЧНО, и я очень доволен. Я также цените время и энергию, чтобы поддерживать общение открытым так что я смог получить ИМЕННО то, что мне нужно. Вы действительно Ремесленник и Мастер! Я буду посылать все свое будущее гитарный гриф работы вам и вашим отличным работникам! Еще раз спасибо….и с Богом!
«Предыдущий доски, которые я заказал у вас, были превосходны. я был очень качеством доволен — никуда не поеду другое.»

«Я получил гриф этим утром. Это здорово выглядит! Как раз то, что я надеялся за. Я не могу дождаться, чтобы продолжить этот проект.»

«Я только что закончил натягивая свою мандолину после установки нового грифа, который Я получил от вас. Интонация фантастическая, и я полностью нравится новый гриф !!! Я буду рекомендовать ваши грифы любой, с кем я когда-либо говорил на тему улучшения интонация инструмента.
«Привет, я получил свой Закажите сегодня два басовых грифа и две пластины на головке грифа. Просто хотел сказать спасибо за отличный сервис… вы будете скоро снова услышишь от меня!»
Привет!!
Я просто хотел сказать, вы проделали потрясающую работу! Пау Присланный вами гриф Ferro просто ИДЕАЛЬНЫЙ и КРАСИВАЯ!!! Ты заставляешь меня хотеть купить еще тысячу, даже я они мне не нужны. Пожалуйста, продолжайте делать эту замечательную работу, ты нужен миру лютье!! Удачного дня!
Эдуардо………… ПЕРУ
 

Онлайн-кампус микроскопии ZEISS | FRET-микроскопия со спектральной визуализацией

Введение

Сложная ассоциация между белками и путями передачи сигнала, которые контролируют клеточную функцию, зависит от множества слабых и преходящих динамических взаимодействий, которые часто трудно или даже невозможно охарактеризовать с помощью традиционной биохимической методологии.Флуоресцентная микроскопия продемонстрировала превосходную чувствительность при обнаружении чрезвычайно низких концентраций меченых биомолекул в очень широких пространственных и временных измерениях. С появлением и разработкой высокоэффективных генетически кодируемых флуоресцентных белков, которые могут стабильно экспрессироваться в живых клетках, появилось несколько методов флуоресценции в качестве мощных инструментов для визуализации динамических взаимодействий белков in situ в физиологических условиях. В частности, применение резонансного переноса энергии Ферстера (FRET) становится все более популярным, чтобы служить молекулярной линейкой при определении межмолекулярных расстояний или для демонстрации того, образуются ли вообще молекулярные комплексы.Чтобы сконструировать биомолекулы, потенциально способные к взаимодействию с FRET, можно использовать простые методы молекулярной биологии для слияния кДНК, кодирующей флуоресцентные белки, с кДНК белков-мишеней, которые, как предполагается, участвуют. В настоящее время предпочтительными флуоресцентными белками для FRET-анализа являются производные Aequorea victoria медузы GFP, обладающие голубой и желтой эмиссией (ECFP и EYFP) в качестве доноров и рецепторов соответственно. Хотя ECFP и EYFP использовались в многочисленных исследованиях FRET, несколько более новых и более совершенных вариантов, Cerulean (производное голубого) и Citrine или Venus (производное желтого цвета), доказали свою высокую эффективность в обеспечении увеличенного динамического диапазона, необходимого для внимательно следите за чувствительными сигналами FRET. Кроме того, продолжающееся расширение цветовой палитры флуоресцентных белков предоставляет новых кандидатов в оранжевой, красной и дальнекрасной областях спектра в качестве потенциальных партнеров FRET для существующих голубых, зеленых и желтых белков.

Одним из наиболее полезных применений FRET в клеточной биологии является метод, который включает слияние двух флуоресцентных белков с концами экологически чувствительного белка или пептида, чтобы действовать как биосенсор специфических клеточных функций.Биосенсоры флуоресцентных белков нашли широкое применение в отчетах о разнообразных внутриклеточных процессах. Творчески сочетая FRET-способные пары флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют важные функции, участвующие в различных аспектах физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для оптической визуализации в живых клетках таких важных процессов, как кальциевая волна. индукция, циклические нуклеотидные мессенджеры, рН, флуктуации мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточных протеаз.Возможно, наиболее широко используемый дизайн биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ расщепления протеазой (см. Рисунок 1). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков (в данном случае Cerulean и Venus), связанных между собой коротким пептидом, который содержит сайт расщепления консенсусной протеазой. В целом сенсор демонстрирует очень сильный резонансный перенос энергии, который полностью прекращается при расщеплении линкерной последовательности. Поскольку этот метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами.Принципы резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET)

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении света флуорофором на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Максимумы (пики) спектральных профилей возбуждения и излучения отделены друг от друга переменной шириной полосы в диапазоне от десятков до сотен нанометров. Мечение внутриклеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет локализовать их в фиксированных и живых препаратах.При одновременном мечении нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в одной клетке или срезе ткани. При использовании этого метода молекулы, которые находятся ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими (и говорят, что они совместно локализуются). Эта кажущаяся пространственная близость означает, что молекулярная ассоциация возможна.Однако в большинстве случаев нормальное разрешение флуоресцентного микроскопа, ограниченное дифракцией, недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами. FRET представляет собой процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии (-донор ) ко второму флуорофору (-акцептор ) в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен примерно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к разделяющему расстоянию между флуорофорами, измерения FRET могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий.

Фундаментальный механизм FRET включает донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который способен передавать свою энергию возбуждения соседнему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом посредством дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения флуорофора в возбужденном состоянии как колеблющегося диполя, который может обмениваться энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, вибрирующих на одной частоте. Напротив, радиационный перенос энергии (который не происходит в FRET) требует испускания и последующего повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей прохождения волнового фронта. . В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о паре донор-акцептор.

Резонансный перенос энергии не чувствителен к окружающей растворяющей оболочке флуорофора и, таким образом, производит молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется зависимыми от растворителя событиями, такими как тушение флуоресценции, реакции в возбужденном состоянии, релаксация растворителя или анизотропные измерения. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, заключается в влиянии на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо большие расстояния, чем короткодействующие эффекты растворителя, а диэлектрическая природа компонентов (растворитель и макромолекула-хозяин), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансного переноса энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление FRET не опосредуется испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве применений и донор, и акцептор флуоресцируют, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении флуоресценции донора и уменьшении времени жизни флуоресценции, что также сопровождается увеличением эмиссии флуоресценции акцептора (от чего зависит экспериментальная эффективность FRET). можно извлечь).Если акцептор является флуоресцентным, он будет излучать фотоны в соответствии со своим характерным спектральным профилем, что приведет к измеримому логометрическому изменению сигнала. Большое отношение интенсивности акцептора к донору свидетельствует о высокой эффективности FRET, что также может быть связано с более коротким расстоянием или более благоприятной ориентацией между флуорофорами. Эффективность процесса передачи энергии ( E FRET ) изменяется пропорционально обратному шестому расстоянию между молекулами донора и акцептора ( r ), как показано в уравнении, представленном ниже.Следовательно, измерения FRET можно использовать в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим флуорофором донора и акцептора, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга. Таким образом, эффективность FRET можно математически описать как:

E ЛАД = 1/[1 + (r/R 0 ) 6 ]

, где R 0 (обычно называемое радиусом Ферстера) представляет характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов. В дополнение к требованию близости эффективная передача энергии требует значительного перекрытия спектров между излучением донора и спектрами поглощения акцептора (как показано на рисунке 2). Эффективность повышается за счет увеличения квантового выхода донора и/или коэффициента экстинкции акцептора. Например, ECFP имеет квантовый выход 0,40, тогда как выход Cerulean примерно на 50 процентов больше, что увеличивает эффективность FRET, когда Cerulean заменяет ECFP в качестве донора FRET.Точно так же коэффициент поглощения Венеры примерно на 11 процентов выше, чем у EYFP, что делает Венеру лучшим акцептором FRET. Как правило, спектральное перекрытие между донором и акцептором должно быть достаточным для обеспечения радиуса Фёрстера, который составляет приблизительно 4 нанометра или более. Другим важным параметром, который следует учитывать при выборе флуоресцентных белков в качестве пар FRET, является соответствие относительной скорости созревания. Количество времени, необходимое для созревания хромофора, колеблется от нескольких минут до многих часов, в зависимости от конкретного белка, и может широко варьироваться в пределах близкородственных вариантов. Измерения FRET будут скомпрометированы в тех случаях, когда донорский флуоресцентный белок созревает значительно быстрее или медленнее, чем акцепторный.

Для оптимизации измерений FRET необходимо учитывать множество других факторов. Одной из основных проблем является относительная яркость донорных и акцепторных флуорофоров. В целом из-за ограниченного динамического диапазона большинства микроскопов флуорофоры, сопоставимые по яркости, как правило, дают более удовлетворительные результаты. Значительное рассогласование по яркости часто приводит к тому, что сигнал одного флуорофора насыщает канал детектора, а сигнал другого (более диммерного) флуорофора теряется в шумовом пороге.Другая часто встречающаяся ловушка — это прямое возбуждение акцептора на длине волны, используемой для возбуждения донора, что приводит к избыточному излучению акцептора, которое не является результатом FRET. Этот артефакт называется спектральным просачиванием акцептора . Кроме того, флуоресцентное излучение донора может просачиваться в канал обнаружения акцептора (известный как просачивание спектра донора ), что также приводит к искусственно завышенным значениям FRET (рис. 2). В связи с тем, что эти источники просачивания будут присутствовать практически во всех парах FRET, их неизбежно необходимо устранять во время измерений FRET.Флуоресцентные белки в анализе FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследования резонансной передачи энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и нацеливать на живые клетки. Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для изучения явлений на внешней стороне плазматической мембраны, но эти зонды не могут проникать через мембрану и поэтому малопригодны во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии, комплекс Гольджи. или эндоплазматический ретикулум.Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время являются одними из лучших флуорофоров-кандидатов для визуализации FRET с высоким разрешением в живых клетках. Однако многие типичные артефакты, возникающие при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются применительно к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров полной ширины на половине максимума ( FWHM ), характерной для спектральных профилей излучения многих синтетических красителей, для флуоресцентных белков диапазон варьируется от примерно 60 нанометров до значительно более 100 нанометров, что часто приводит к значительные области перекрытия при попытке разделить флуоресценцию донора и акцептора.Таким образом, широкие спектральные профили флуоресцентных белков ограничивают количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.

Окружающий хромофор флуоресцентного белка представляет собой полипептид из 220-230 аминокислот, свернутый в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (называемую бета--бочонком; см. бета — листы, которые окружают и защищают центральную альфа — спираль, содержащую остатки, образующие хромофор.Концы ствола закрыты полуспиральными пептидными областями, которые блокируют проникновение ионов, воды и малых молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично ответственны за устойчивую фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET (рис. 3). Большой размер цилиндра эффективно экранирует соседние хромофоры флуоресцентных белков с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого сближения в 2-3 нанометра), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET, которая может быть получена с флуоресцентными белками, примерно до 40 процентов. теоретическое значение.Несмотря на это, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для визуализации FRET живых клеток намного перевешивают затраты.

Усугубляют проблемы спектральной ширины и размера, с которыми сталкиваются флуоресцентные белки, также их высокое сродство к олигомеризации. Почти все флуоресцентные белки, открытые к настоящему времени, демонстрируют по крайней мере ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая склонность нативного зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях (например, при ограничивается плазматической мембраной). Этот артефакт также наблюдался в мотиве строгой тетрамеризации нативных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных в рифовых кораллах и морских анемонах. Олигомеризация может быть серьезной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в случаях, когда флуоресцентный белок слит с белком-хозяином, нацеленным на определенное субклеточное место. После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может приводить к атипичной локализации, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри специфической органеллы или цитоплазмы.Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природных олигомеров (такими как актин, тубулин и щелевые контакты; см. рис. 4). Продукты слияния с белками, образующими только слабые димеры (по сути, большинство вариантов Aequorea victoria ), могут не проявлять агрегации или неправильного нацеливания при условии, что локальная концентрация остается низкой. Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, как описано выше, локализованная концентрация белка может стать достаточно высокой, чтобы обеспечить димеризацию.Это явление может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые часто дают сложные наборы данных, которые иногда скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация белков медуз может в некоторых случаях использоваться для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Клеточный дистресс, приводящий к апоптозу или некрозу, является проблемой, возникающей из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и сверхэкспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков.Кроме того, здоровье и продолжительность жизни оптимально помеченных клеток млекопитающих в камерах микроскопа также могут страдать от ряда других вредных факторов. Главным из них является индуцированное светом повреждение (фототоксичность), возникающее при многократном воздействии на флуоресцентно меченные клетки излучения лазеров, светодиодов и ламп дугового разряда высокой интенсивности. В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы склонны реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку.Флуоресцентные белки, как правило, не фототоксичны для клеток, отчасти из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки (см. рис. 3). При планировании экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально возможную длину волны возбуждения, чтобы свести к минимуму повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах. Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим освещением соответственно) варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными. К сожалению, низкие коэффициенты поглощения и квантовые выходы мономерных оранжевых и красных флуоресцентных белков препятствуют их широкому применению в FRET-анализе. Возможно, когда будут обнаружены новые варианты флуоресцентных белков, зонды в цветовых областях с большей длиной волны станут полезными акцепторами FRET для доноров желтого и зеленого цветов.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых биосенсоров флуоресцентных белков и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET и не мешают другим важным биологическим явлениям.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентного белка во время визуализации в клеточных линиях после транзиторной трансфекции. Олигомерные флуоресцентные белки рифовых кораллов (обсуждаемые выше) имеют гораздо большую склонность к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но продукты слияния с неправильной укладкой могут встречаться в любом варианте. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным средством для инактивации специфических белков с помощью световой инактивации с помощью хромофора ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed, способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности ECFP и EYFP показывают, что даже несмотря на то, что хромофоры способны генерировать синглетный кислород, эти зонды неэффективны в качестве фотосенсибилизаторов. Однако длительное освещение клеток, экспрессирующих любой вариант EGFP, может привести к физиологическим изменениям и возможной гибели клеток, что является определенным показателем потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для длительной покадровой визуализации из-за их меньшей скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной изменчивости между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов можно использовать для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 захватов), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в цейтраферных последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в течение которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, вращающегося диска, многофотонного и т. д.), поскольку различия в фотостабильности часто наблюдаются для одного и того же белка при освещении дугой. газоразрядная лампа по сравнению с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков диктуется многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки для визуализации.

Первой парой флуоресцентных белков, разработанной для анализа FRET, был вариант синего белка (EBFP) в сочетании с EGFP, предназначенный для возбуждения источником ультрафиолетового света. К сожалению, относительно плохие фотофизические свойства EBFP, наряду с потенциальной фототоксичностью коротковолнового освещения, сделали эту комбинацию непрактичной. Новые варианты синих флуоресцентных белков могут возродить эту стратегию спаривания для краткосрочных наблюдений, но им все равно будет препятствовать необходимость высокоэнергетического возбуждения, что исключает использование синих флуоресцентных белков для долгосрочной визуализации.Наиболее эффективной парой флуоресцентных белков FRET остается высокоэффективный вариант ECFP в качестве донора, соединенный с высокоэффективным вариантом EYFP в качестве акцептора. Другие пары включают производное EGFP или EYFP в качестве донора оранжевых и красных вариантов, таких как мономерный Kusabira Orange или mCherry. Среди проблем, связанных с применением оранжевых и красных флуоресцентных белков (все они получены из рифовых кораллов и морских анемонов) в качестве акцепторов FRET, являются длинные хвосты возбуждения, характерные для спектральных профилей поглощения. Во многих случаях спектры поглощения простираются в голубую и зеленую области спектра, что приводит к артефактам прямого возбуждения акцептора.

Свойства пар флуоресцентных белков для спектральной визуализации FRET

Флуоресцентный
Белковый
Пара
Донор
Возбуждение
Максимум
(нм)
Акцептор
Излучение
Максимум
(нм)
Донор
Квант
Выход
Акцептор
Поглощение
Коэффициент
Förster
Расстояние
(нм)
Яркость
Соотношение
EBFP2-mEGFP 383 507 0. 56 57 500 4,8 1:2
ECFP-EYFP 440 527 0,40 83 400 4,9 1:4
Лазурно-Венера 440 528 0.62 92 200 5,4 1:2
МиЦи-МКО 472 559 0,90 51 600 5,3 1:2
TFP1-mVenus 492 528 0.85 92 200 5.1 1:1
CyPet-YPet 477 530 0,51 104 000 5. 1 1:4,5
EGFP-mCherry 507 510 0.60 72 000 5.1 2,5:1
Венера-мЧерри 528 610 0,57 72 000 5,7 3:1
Venus-tdTomato 528 581 0.57 138 000 5,9 1:2
Venus-mPlum 528 649 0,57 41 000 5,2 13:1
gif»>
Таблица 1

Недавнее расширение цветовой палитры флуоресцентных белков для создания вариантов, обладающих широким спектром спектральных профилей, в сочетании с возрастающей сложностью конструкции белковых химер (слияний, а также биосенсоров) привело к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые потенциально полезно в экспериментах FRET (см. Таблицу 1).Применение флуоресцентных белков для FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически кодируемая конструкция, как кратко обсуждалось выше), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком. Последний подход использовался для изображения различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение анализов FRET на независимо экспрессируемых белковых химерах гораздо сложнее из-за вариабельной стехиометрии, которая неизбежно возникает при экспрессии отдельных флуоресцентных объектов в живых клетках.Методы измерения FRET

Из-за того, что практически всем комбинациям флуорофоров, используемым для мониторинга FRET, препятствуют определенные и часто уникальные проблемы, которые усложняют их применение для этого метода, для исследователя крайне важно полностью понять методологию, в соответствии с которой проводится FRET. измерено. Исследователи должны использовать как можно больше различных методов измерения при проведении пилотных экспериментов с новыми комбинациями FRET с биологическими последствиями.После точной настройки системы и получения согласованных и понятных результатов можно использовать простейшие экспериментальные подходы для дополнительных измерений. Хотя для измерения FRET было разработано большое количество методов, многие из них очень сложны и требуют оборудования, которого нет в большинстве основных лабораторий микроскопии. Наиболее практичные подходы к измерению FRET ограничены несколькими методами, которые будут обсуждаться ниже.

Высокая степень спектрального перекрытия между профилями излучения донора и профиля поглощения акцептора, необходимая для FRET, также создает значительный уровень фонового шума, который может существенно мешать обнаружению сигналов FRET.Как обсуждалось ранее, спектральное просачивание, возможно, является основной проблемой при разделении сигналов FRET для анализа. Как донор, так и акцептор обычно вносят вклад в просачивание, которое можно обнаружить в канале FRET. Просачивание от донора является результатом перекрытия профилей эмиссии флуоресценции донора и акцептора, которые часто бывают очень широкими (более 100 нанометров) и их трудно разделить. Напротив, просачивание от акцептора является результатом прямого возбуждения акцепторных флуорофоров освещением, которое используется для возбуждения донора и получения FRET.Широкий спектр других источников шума также может искажать измеряемый сигнал FRET. К ним относятся автофлуоресценция, детектор микроскопа и оптический шум, а также изменения спектральной чувствительности в донорных и акцепторных каналах. В результате наиболее полезный подход к измерению точных сигналов FRET требует применения методологии, которая может либо избежать, либо успешно удалить загрязняющие фоновые сигналы.

Просвечивания сигнала можно в значительной степени избежать, используя методы FRET, такие как фотообесцвечивание акцептора (также обычно называемое дегашением донора ; см. другие ограничения.Метод фотообесцвечивания акцептора используется для определения эффективности FRET путем измерения величины сигнала погашенного донора (рис. 5(а)) в присутствии акцептора с последующим измерением сигнала непогашенного донора после того, как флуоресценция акцептора была разрушена фотообесцвечивание (рис. 5(b) и 5(c)). Основная концепция фотообесцвечивания акцептора FRET заключается в том, что флуоресценция донора гасится в результате резонансной передачи энергии акцептору. В результате фотообесцвечивание акцептора увеличивает флуоресценцию донора из-за потери эффекта тушения.Таким образом, если между донором и акцептором происходит FRET, флуоресценция донора должна увеличиваться, когда акцептор эффективно удаляется после фотообесцвечивания. Одним из преимуществ акцепторного фотообесцвечивания является то, что каждая исследуемая клетка служит своим собственным контролем, что делает этот метод одним из наиболее точных для измерения FRET.

Основная задача при выполнении измерений FRET фотообесцвечивания акцептора состоит в том, чтобы убедиться, что донор также не подвергается фотообесцвечиванию, и что акцептор фотообесцвечивается (как минимум) примерно на 10 процентов от его начального значения.Любое фотообесцвечивание донора приведет к недооценке эффективности FRET из-за потери сигнала. Кроме того, поскольку акцептор подвергается необратимому фотообесцвечиванию (фактически разрушается), методика фотообесцвечивания акцептора не может быть повторена на одной и той же клетке. Кроме того, из-за высокой фотостабильности, проявляемой многими флуоресцентными белками, фотообесцвечивание акцептора может занять несколько минут и менее полезно для динамических измерений в живых клетках. Измерения фотообесцвечивания акцептора также могут быть скомпрометированы, если вся клетка не обесцвечивается за один шаг.Фотообесцвечивание выбранной области цитоплазмы обеспечивает приток свежих флуорофоров в обесцвеченную область, что увеличивает время, необходимое для обесцвечивания всех акцепторных молекул в клетке. Помимо этих проблем, фотообесцвечивание акцептора по-прежнему широко используется для определения эффективности FRET и обеспечивает превосходный контроль после проведения экспериментов, основанных на альтернативных методах.

Мониторинг времени жизни флуоресценции донора в экспериментах FRET можно использовать, чтобы избежать многих проблем, часто возникающих при использовании методов фотообесцвечивания акцептора.FLIM, возможно, является наиболее строгим методом, используемым для измерения FRET, и менее склонен к просачиванию артефактов, поскольку он измеряет только колебания флуоресценции донора. Все флуорофоры, включая флуоресцентные белки, демонстрируют экспоненциальное затухание флуоресцентного излучения, которое можно измерить в наносекундном масштабе. Скорость этого экспоненциального затухания чувствительна к любым процессам, влияющим на возбужденное состояние, включая множество переменных окружающей среды, которые могут подавить флуоресценцию.Таким образом, основная концепция, связанная с FLIM, связана с фотообесцвечиванием акцептора в том смысле, что его можно использовать для обнаружения изменений времени жизни флуоресценции донора, которые сопровождают передачу энергии акцептору. Фактически флуоресценция донора гасится FRET, и степень этого тушения можно определить путем измерения изменений времени жизни флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора.

Сочетание FLIM с FRET может облегчить проблемы с артефактами прямого возбуждения акцептора, которые усложняют другие методологии, и этот метод также можно использовать для мониторинга FRET с использованием акцепторов, которые сами по себе не являются флуоресцентными. Однако у FLIM есть ограничения, которые не позволяют ему стать самым популярным методом визуализации FRET. Основное соображение заключается в том, что измерения времени жизни в наносекундах чрезвычайно сложны и должны проводиться на дорогостоящем оборудовании, которое не является широко доступным. Кроме того, FLIM часто требуется несколько минут для сбора каждого изображения, что сильно ограничивает его применение для быстрых динамических событий. Еще одной сложностью являются многоэкспоненциальные кривые затухания времени жизни, которые обычно встречаются со многими флуорофорами, что обычно требует более полных стратегий сбора данных и усложняет анализ FRET.Наконец, измерения FLIM чувствительны к факторам окружающей среды за пределами FRET, которые могут сократить измеряемый срок службы, включая автофлуоресценцию, вязкость, колебания pH и присутствие ионов металлов. Все только что описанные переменные снижают эффективность использования только методов фотообесцвечивания акцептора и FLIM, однако они представляют собой важный контроль для проверки измерений FRET, полученных другими методами.

Самый основной и простейший метод измерения FRET известен как сенсибилизированное излучение (обычно называемое в литературе двухцветным логометрическим изображением ; см. наборы фильтров.При сенсибилизированном излучении донорный флуорофор возбуждается определенным диапазоном длин волн, и сигнал собирается с использованием двух наборов эмиссионных фильтров, настроенных либо на донорную, либо на акцепторную флуоресценцию. Этот метод может давать результаты очень быстро (ограниченный только ограничениями переключения колес фильтров) и поэтому весьма полезен при динамической визуализации живых клеток. В маловероятном случае отсутствия просачивания между возбуждением и испусканием двух флуорофоров преобладающим методом измерения FRET будет сенсибилизированное испускание.К сожалению, просачивание обычно является серьезной проблемой, особенно при использовании флуоресцентных белков, а сенсибилизированное излучение требует обширных контрольных экспериментов, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Кроме того, эти элементы управления должны подвергаться значительной обработке изображения, чтобы исключить просачивание, ограничение, которое замедляет время сбора данных, увеличивает уровень шума и вносит относительно высокую степень неопределенности в измерения.

На рис. 6 показана серия изображений, полученных при широкопольном флуоресцентном освещении кальциевых волн, пересекающих цитоплазму клеток карциномы человека ( HeLa ), экспрессирующих циркулярно пермутированный камелеоновый вектор YC3.60. Этот биосенсор содержит варианты ECFP и EYFP, которые состоят из белкового кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина ( M13 ) в виде линейной химеры. В присутствии повышенных уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулина, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками. На рис. 6(а) представлено реальное цветное изображение двух соседних клеток перед добавлением гистамина для индуцирования связывания кальция с биосенсором. На рисунках с 6(b) по 6(h) показаны псевдоцветные изображения кальциевых волн, распространяющихся через цитоплазму двух клеток HeLa. Обратите внимание, что волна распространяется сверху вниз в верхней ячейке и справа налево в нижней ячейке. Общее время прохождения кальциевой волны через цитоплазму в этих клетках составляло примерно 1,5 секунды. Уровень FRET указывается путем сравнения логометрических псевдоцветов с легендой, представленной на рисунке 6 (а). Изображения на рисунке 6 были получены с использованием двухдиапазонного дихроматического светоделителя, соединенного с фильтрами возбуждения и излучения, настроенными на оптимальные диапазоны длин волн для визуализации ECFP и EYFP с минимальным просачиванием.

Описан ряд корректирующих подходов к сенсибилизированному излучению с использованием нескольких различных комбинаций фильтров с контролями, которые содержат только донор, только акцептор, или образец FRET с донором и акцептором. Элементы управления позволяют исследователю определить уровень просачивания возбуждения и эмиссии и вычесть его из измерения FRET. Однако из-за всех необходимых поправочных коэффициентов количество шума в конечном FRET-изображении может превышать уровень сенсибилизированного излучения в ситуациях, когда взаимодействия между донором и акцептором слабы.Спектральное отображение в измерениях FRET

В приложениях FRET спектральную визуализацию можно рассматривать как разновидность метода сенсибилизированного излучения, основанного на возбуждении только донора с последующим получением всего спектра излучения флуоресценции как донора, так и акцептора вместо сбора данных в двух независимых каналах. До появления лазерных сканирующих конфокальных микроскопов, предназначенных для получения спектральных изображений, этот метод в значительной степени ограничивался экспериментами по спектроскопии с использованием кювет и очищенных флуорофоров.Спектральная визуализация FRET предполагает, что сбор всего спектра флуоресценции позволит разделить перекрывающиеся спектральные профили в соответствии с отчетливыми формами спектров, а не просто контролировать интенсивность излучения в ограниченной области полосы пропускания с помощью фильтра. Таким образом, собирая весь спектр как от донора, так и от акцептора (см. рис. 7(а)), можно с помощью спектральной визуализации определить уровни флуоресценции донора и акцептора, а на основе этой информации (в сочетании с контролем) рассчитать эффективность FRET.

Представленное на рисунке 7 логометрическое измерение спектральной визуализации для биосенсора флуоресцентного белка кальция, известного как камелеон YC3.60, как описано выше. Спектральные профили YC3.60 в присутствии (красная кривая; рис. 7(а)) и в отсутствие (желтая кривая) кальция демонстрируют широкий динамический диапазон зонда при 530 нм. Мультяшные рисунки биосенсора камелеона представлены в присутствии (рис. 7(b)) и в отсутствие (рис. 7(c)) кальция, чтобы проиллюстрировать, как щелочной металл вызывает конформационные изменения в M13, чтобы переместить две части флуоресцентного белка ближе друг к другу. .Стек лямбда-изображений с интервалом 10 нанометров клеток, экспрессирующих камелеон в присутствии высокой концентрации кальция, показан на рисунке 7(d). Отметим, что самые высокие интенсивности наблюдаются для лямбда-плоскости, содержащей длины волн излучения от 530 до 540 нм.

Сравнение спектральной визуализации с линейным разделением и сенсибилизированным излучением с двумя длинами волн возбуждения для определения FRET показывает, что отношение сигнал/шум для методов сенсибилизированного излучения ниже, чем при спектральной визуализации (хотя это не всегда так и зависит сильно зависит от параметров и конфигурации прибора).Это несоответствие связано с тем, что фильтры излучения с относительно узкой полосой пропускания, необходимые для отделения излучения от близко перекрывающихся флуорофоров, блокируют большинство пригодных для использования фотонов, которые в противном случае обнаруживаются с помощью спектральной визуализации. Отбрасывание большого количества излучения приводит к значительной потере информации, которая в некоторых случаях приближается к 50 процентам имеющихся данных. Кроме того, спектральное изображение обеспечивает оптимальное взвешивание в соответствии с шумом, присутствующим в отдельных каналах данных, в отличие от традиционных методов (часто произвольно отбрасываемых). Спектральная визуализация требует предварительного определения уровня просачивания из-за прямого возбуждения акцептора, но этот метод может выиграть от использования двух длин волн возбуждения с инструментами, которые так оборудованы.

Конфокальные микроскопы для получения спектральных изображений, оснащенные акустооптическими перестраиваемыми фильтрами ( AOTF ) и специализированными детекторными системами, могут использоваться для получения серии изображений в дискретных полосах с ограниченным диапазоном длин волн для создания так называемых лямбда-стеков (изображения боковых ( x,y ) плоскость как функция длины волны).Спектральные характеристики ( эмиссионных отпечатков ) для отдельных флуорофоров или флуоресцентных белков и загрязняющих фоновых сигналов (таких как аутофлуоресценция) получаются путем деконволюции стопок лямбда. Метод линейного разделения может быть применен к лямбда-стеку для разделения вкладов отдельных сигналов флуорофора в каждом пикселе полученного изображения. Таким образом, спектральная визуализация в сочетании с линейным разделением может определять и устранять вклад просачивания донором в сигнал FRET.Однако в связи с тем, что флуоресцентное излучение, возникающее при прямом возбуждении акцептора (обозначаемое как просачивание акцептора, см. выше), по спектральным характеристикам идентично флуоресцентному сигналу, создаваемому FRET, необходимо разработать средства контроля, помогающие определить и устранить вклад просачивания акцептора, чтобы получить эффективность FRET. Спектральную визуализацию также можно комбинировать с фотообесцвечиванием акцептора или использовать для изучения динамических изменений эффективности FRET в биосенсорах флуоресцентных белков без использования контролей.Последняя стратегия, возможно, является наиболее широко применяемой техникой исследования FRET с помощью спектральной визуализации.

Для устранения спектрального просачивания акцептора из-за перекрестного возбуждения в приложениях спектральной визуализации FRET большинство подходов основано на предположении, что при визуализации в идентичных условиях динамика этих артефактов будет практически одинаковой в контрольных клетках, которые экспрессируют только акцептор (по сравнению с экспериментальными клетками, которые экспрессируют как донор, так и акцептор). Однако из-за того, что для определения вклада просачивания в экспериментальных ячейках используются разные ячейки, непосредственное сравнение отдельных местоположений пикселей невозможно. В большинстве случаев можно провести сравнение между пикселями как в контрольных, так и в экспериментальных клетках, которые имеют одинаковые уровни флуоресценции. Этот метод основан на алгоритме, который определяет уровни флуоресценции пиксель за пикселем и устанавливает уровень просачивания в контрольных клетках, которые экспрессируют только акцептор.Эти контрольные значения просачивания затем применяются в качестве поправочного коэффициента к соответствующим совпадающим пикселям в экспериментальных клетках, которые экспрессируют как донорные, так и акцепторные флуорофоры.

В парах FRET флуоресцентных белков, которые созданы с вариантами голубого и желтого флуоресцентных белков (ECFP и EYFP), спектральная визуализация требует возбуждения голубого варианта с использованием лазерной спектральной линии, которая перекрывается с профилем поглощения флуоресцентного белка. Современные конфокальные микроскопы оснащены диодными и газовыми лазерами со спектральными линиями 405, 440 и 458 нанометров, каждый из которых полезен для возбуждения голубых флуоресцентных белков.Однако 458-нанометровая спектральная линия аргон-ионного газового лазера приводит к значительному просачиванию акцептора (примерно 20 процентов) в канал FRET для пар ECFP-EYFP. Напротив, 405- и 440-нанометровые диодные лазеры будут генерировать меньшее просачивание (примерно 4 и 8 процентов соответственно), но для точного расчета сигнала FRET все же необходимо удалить загрязняющий сигнал от прямого возбуждения акцептора. После установления соотношения интенсивностей изображения донора в присутствии ( I DA ) и в отсутствие ( I D ) акцептора эффективность FRET можно определить, применяя следующую зависимость:

E ЛАД = 1 — (I DA /I D )

Расчет эффективности FRET таким образом был подтвержден с использованием пар FRET флуоресцентных белков, которые были слиты вместе с короткими пептидными линкерами, а также с гораздо более сложной задачей исследования FRET между зондами, которые экспрессируются по отдельности. Результаты показали очень похожие значения эффективности FRET при сравнении спектральной визуализации с методологией на основе интенсивности и FLIM. Тем не менее, спектральная визуализация позволяет избежать потенциальных проблем, связанных с просачиванием акцепторного сигнала в донорный канал, что характерно для сенсибилизированного излучения на основе фильтров и визуализации с многофотонным возбуждением. С осторожностью отметим, что компонент просачивания спектра акцептора часто незначителен и может создавать проблемы при количественной оценке уровня сигнала при использовании детекторов фотоумножителей, которые имеют нестабильный отклик при очень низких значениях интенсивности.Этот артефакт можно преодолеть, определяя протекание при разных уровнях интенсивности в контрольных клетках.

Можно избежать перекрестного возбуждения акцептора при выборе пар FRET флуоресцентных белков, имеющих донор с большим стоксовым сдвигом. Например, mT-Sapphire и mAmetrine представляют собой производные GFP, которые поглощают свет в ультрафиолетовых длинах волн (примерно 400 нм), но излучают либо в зеленой (510 нм), либо в желтой (530 нм) областях спектра. Когда эти доноры соединяются с акцепторами оранжевого или красного флуоресцентного белка, возбуждение пары FRET приводит к незначительному просачиванию акцептора и не требует никаких корректирующих факторов или контролей. Например, сочетание производного GFP, известного как GFP2, с EYFP привело к образованию пары FRET, которую можно возбудить с помощью 405-нанометрового диодного лазера и успешно наблюдать с помощью спектральной визуализации. Поскольку спектры испускания GFP2 и EYFP сильно перекрываются, линейное разделение данных FRET позволяет выявить вклад каждого флуорофора в общее испускание флуоресценции.Аналогичным образом, сочетание mAmetrine с тандемным димером Tomato (tdTomato) привело к образованию пары FRET, которая испускает оранжево-красную флуоресценцию при возбуждении на длине волны 405 нанометров. Возбуждение одного tdTomato на этой длине волны практически не дает заметного сигнала, поэтому при использовании этой пары поправка на просачивание акцептора не требуется. Подобные пары FRET, скорее всего, дадут идентичные результаты.

Из-за неспособности конфокальной микроскопии спектральной визуализации различить сигнал испускания акцептора, генерируемый посредством FRET, и сигнал, происходящий от прямого возбуждения акцептора во флуоресцентном белке и других парах флуорофоров, которые имеют сильно перекрывающиеся спектральные профили, необходимые для FRET, несколько исследователей объединили спектральное изображение с методами фотообесцвечивания акцептора для определения эффективности FRET.На рисунке 8 показан пример спектральной визуализации флуоресцентных белков с фотообесцвечиванием акцептора для анализа FRET. Флуорофор представляет собой химеру mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. При экспрессии в клетках млекопитающих (кроличьи почки) вектор слияния распространяется по цитоплазме и проникает в ядро. Спектральное изображение экспрессированного вектора в клетках, полученное от 450 до 650 нанометров, представлено на рисунке 8 (а) со спектрально разрешенными изображениями эмиссии mCerulean и mVenus, показанными на рисунках 8 (b) и 8 (c), соответственно. При фотообесцвечивании mCerulean в ячейке, показанной в нижней части окна светом с длиной волны 514 нм (рис. 8(f)), флуоресцентная эмиссия mCerulean увеличивается (рис. 8(d) и 8(e)) вследствие донора. растушевка.

Фотообесцвечивание акцептора обычно осуществляется с использованием спектральной линии лазера, которая перекрывает область с высоким коэффициентом экстинкции (как можно ближе к пику) в спектре поглощения акцептора. Например, в комбинации ECFP-EYFP FRET линия аргон-ионного лазера с длиной волны 514 нм обычно используется для фотообесцвечивания EYFP, таким образом уменьшая гашение ECFP с последующим увеличением сигнала донора (рис. 8(d)–8(f)).Поскольку EFYP подвергается постепенному фотообесцвечиванию, лямбда-сканирование спектральных изображений проводится с использованием линии аргон-ионного лазера с длиной волны 548 нм (возбуждающей ECFP) между каждым событием фотообесцвечивания, чтобы регистрировать изменения спектрального отклика. Как правило, лямбда-стеки собираются в диапазоне длин волн от 465 до 600 нанометров в дискретной полосе пропускания (примерно 10 нанометров). Этот экспериментальный подход предназначен для минимизации ошибки отдельных измерений путем подгонки изменений интенсивности к стандартной кривой.Значения максимального увеличения интенсивности ECFP затем можно экстраполировать из этой кривой, даже если EYFP никогда не подвергается полному фотообесцвечиванию. Конечная цель состоит в том, чтобы избежать повреждения живых клеток и нежелательного фотообесцвечивания ECFP в ходе эксперимента. Методы фотообесцвечивания акцептора дают оптимальные результаты, когда донор фотостабилен, а акцептор фотозависим, ситуацию, которую можно контролировать, выбирая подходящие варианты флуоресцентного белка, такие как Cerulean и Venus.

Чтобы рассчитать эффективность FRET с помощью метода фотообесцвечивания акцептора, необходимо выполнить ряд шагов в стратегии анализа данных. Первый этап состоит из линейного разделения компонентов ECFP и EYFP (или других флуорофоров, если они используются вместо них). Затем за измерением средней интенсивности донора ECFP и акцептора EYFP следует расчет изменений интенсивности для определения эффективности FRET. После получения стеков лямбда линейное разделение используется для создания изображений донора ECFP и акцептора EYFP из стеков.Общий успех линейного разделения зависит от наличия образцов с хорошим соотношением сигнал-шум и использования эталонных спектров, точно представляющих спектры, содержащиеся в образце FRET. В большинстве случаев клетки, экспрессирующие только ECFP или EYFP (контроль), используются для создания эталонных спектров. Контрольные спектры должны быть получены в тех же условиях, что и для образца FRET, включая настройки усиления, смещение, диапазон длин волн, объектив и дихроматическое зеркало. Изображения должны быть получены с минимальной насыщенностью сигнала и минимальной интенсивностью пикселей, установленной чуть выше нуля, чтобы получить максимально возможный динамический диапазон.После вычитания фона эффективность FRET рассчитывается с использованием уравнения, представленного выше, где ( I DA ) и ( I D ) представляют нормированные интенсивности донора до и после 100-процентного фотообесцвечивания акцептора. Из-за того, что EYFP почти никогда полностью не обесцвечивается, значение для ( I D ) обычно экстраполируется из линейной аппроксимации графика, описывающего процентное увеличение эмиссии ECFP по сравнению с процентным уменьшением EYFP.Аналогичным образом метод фотообесцвечивания акцептора можно использовать с другими парами флуоресцентных белков (например, EGFP и mKusabira Orange).

Уникальный подход к измерению FRET с помощью спектральной визуализации был назван lambda FRET и оказался высокоспецифичным, чувствительным и надежным методом анализа резонансной передачи энергии в живых клетках. Алгоритм лямбда-FRET основан на отображении образца FRET на нескольких длинах волн излучения с последующим разделением спектра FRET на его донорную и акцепторную компоненты для расчета эффективности FRET на основе пикселей.Lambda FRET применяет новую процедуру предварительной калибровки для коррекции спектрального просачивания на основе получения эталонных изображений отражения и была подтверждена с использованием стандартов синтетических флуорофоров FRET (таких как Alexa Fluor 488 и Cy3), а также слияний флуоресцентных белков. (ECFP и EYFP) с различной длиной линкера и стехиометрией. Уникальная процедура коррекции, основанная на использовании изображений отражения для нормализации для различных интенсивностей излучения света, в принципе аналогична методам сенсибилизированного излучения, но дает результаты с меньшим шумовым загрязнением.Было продемонстрировано, что лямбда-FRET полезен в случаях, когда сильное спектральное перекрытие и артефакты аутофлуоресценции присутствуют как в фиксированных, так и в сценариях визуализации живых клеток.

Помимо исследования межмолекулярных взаимодействий и определения эффективности FRET с использованием методов фотообесцвечивания акцептора и коррекции просачивания, спектральная визуализация оказалась очень полезной для изучения биосенсоров флуоресцентных белков для определения наличия или отсутствия FRET в ответ на биологический стимул. .Методология требует получения спектра биосенсора в присутствии и в отсутствие стимулятора, чтобы определить, наблюдается ли FRET или устраняется, и контролировать динамический диапазон ответа (см. Рисунок 7). Таким образом, путем творческого слияния пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов или другой биологической активности, ряд исследователей разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для оптической визуализации важных клеток в живых клетках. метаболические и сигнальные процессы.Как правило, два флуоресцентных белка (обычно голубой и желтый вариант) вставляются на противоположных концах последовательности сенсорного белка или пептида (см. Фигуру 9), как кратко описано выше. Изменения в конформации сенсорного белка вызывают соответствующие третичные изменения в структурной организации комплекса и, таким образом, уровень FRET, который можно наблюдать между фланкирующими флуоресцентными белками. Рационометрическое изменение выхода флуоресценции донора и акцептора с использованием одного параметра возбуждения в сочетании со спектральной визуализацией становится популярной методологией для исследования этих биосенсоров.

На рисунке 9 представлена ​​карикатура, иллюстрирующая распространенные стратегии конструирования биосенсоров на основе флуоресцентных белков. Голубые цилиндры представляют собой CFP, серые цилиндры представляют YFP без FRET, а желтые цилиндры представляют YFP с FRET. Синие молнии указывают на возбуждение на 450 нм, а параллельные волны — на флуоресцентное излучение (на 475 нм — голубой; или на 530 нм — желтый). Сенсорные домены окрашены в телесный цвет, а эффекторные агенты имеют форму сфер или эллипсов. На рис. 9(а) показан межмолекулярный FRET между отдельным сенсорным доменом и субстратом, слитым с CFP и YFP, соответственно, тогда как на рис. 9(b) показан биосенсор флуоресцентного белка с одним сенсорным доменом и эффекторным лигандом.Связывание субстрата с сенсорным доменом на рис. 9(а) вызывает FRET, тогда как связывание лиганда на рис. 9(б) вызывает конформационные изменения в сенсорном домене, чтобы привести флуоресцентные белки в правильную близость для переноса энергии (см. также Рисунки 7(b) и 7(c)). В некоторых случаях домены субстрата и сенсорного белка связаны (рис. 9(с)) для создания единой генетической единицы экспрессии для внутримолекулярного FRET, в отличие от ситуации на рис. 9(а). Биосенсор флуоресцентного белка, который обнаруживает расщепление субстрата (рис. 1 и рис. 9 (d)) действует путем устранения FRET после индукции соответствующей протеазы.Биосенсоры расщепления протеазы являются популярными индикаторами апоптоза.

За последние несколько лет было сообщено о большом количестве новых биосенсоров, использующих различные пары FRET. Несмотря на ограничения динамического диапазона, наблюдаемые в нескольких биосенсорах FRET, использующих голубые и желтые производные, использование этих флуоресцентных белков получило широкое распространение, вероятно, из-за простоты логометрических измерений, широкой доступности и легкости сравнения с другими сенсорами, имеющими аналогичные свойства. .Начинают появляться альтернативные пары FRET, в том числе голубые и бирюзовые донорные флуоресцентные белки, связанные с желтыми и оранжевыми акцепторными флуоресцентными белками, а также зеленые доноры флуоресцентных белков, связанные с красными флуоресцентными белками-акцепторами. Однако на сегодняшний день полезность флуоресцентных белков, полученных из рифовых кораллов и актиний, ограничена. Несколько многообещающих биосенсоров сочетают сапфировое или желтое производное GFP с красным флуоресцентным белком для получения репортера с длинным сдвигом Стокса, как обсуждалось выше.Усовершенствованные биосенсоры, без сомнения, появятся с использованием более точно настроенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов. С этой целью спектральная визуализация в сочетании с линейным разделением будет по-прежнему рассматриваться как один из предпочтительных методов для анализа FRET.

Выводы

Разработан ряд методов анализа FRET во флуоресцентных белках, а также в синтетических красителях и квантовых точках.Для визуализации живых клеток спектральная визуализация в сочетании с линейным разделением обеспечивает надежный метод измерения FRET с использованием флуорофоров с сильно перекрывающимися спектральными профилями, что обычно происходит с образцами FRET. Новые биосенсоры флуоресцентных белков обещают расширить горизонты динамических исследований субклеточной активности, и спектральная визуализация должна оказаться очень полезным инструментом в этой области. Для дальнейшего улучшения аналитических методов спектральное изображение можно комбинировать с методами фотообесцвечивания в течение всего срока службы или акцепторного фотообесцвечивания.Кроме того, возможность проведения экспериментов FRET с использованием двух разных акцепторов (имеющих разные спектры излучения) находится в области спектральной визуализации, но ее гораздо сложнее выполнить с использованием традиционной методологии.

Правила доставки двенадцатого лада

Мы отправляем практически по любому адресу в мире. Существуют ограничения на некоторые товары, и некоторые товары не могут быть отправлены в международные пункты назначения.

Обратите внимание, что стоимость доставки многих товаров, которые мы продаем, зависит от размеров и веса.Чтобы отразить политику транспортных компаний, которые мы используем, все веса будут округлены до следующего полного килограмма/фунта.

Нашим основным перевозчиком является FedEx с DHL для некоторых зарубежных отправлений. Мы также используем Почту Канады, где расценки или графики доставки могут обеспечить лучшее обслуживание наших клиентов.

Несмотря на то, что мы делаем все возможное, чтобы отправить товар быстро, иногда мы приостанавливаем доставку, если определяем, что погодные условия могут привести к повреждению отправленного товара.

  • Все заказы подлежат проверке.
  • Двенадцатый лад взимает налог с продаж со всех заказов, где это применимо.
  • Поставки за пределы Канады могут облагаться импортными сборами, ответственность за которые несет покупатель. Ваш заказ может облагаться НДС, ввозными пошлинами и/или налогами, которые взимаются, как только ваша посылка достигает вашей страны. Компания «Двенадцатый лад» отправляет вашу посылку D.D.U., «пошлины и налоги не уплачены», не взимает импортный НДС, пошлины и/или налоги и не может предсказать, какими могут быть ваши конкретные сборы. Если вы берете на себя эти другие расходы, они должны быть оплачены, чтобы ваша посылка прошла таможенную очистку. Для получения дополнительной информации о таможенной политике вашей страны, пожалуйста, свяжитесь с местным таможенным управлением.
  • Продаваемые товары будут иметь одну розничную цену, которая не рассчитывается по обменному курсу. Вы увидите обменный курс, применяемый в сводке вашей кредитной карты на момент получения выписки.
  • Чтобы узнать точную цену перед покупкой, просто добавьте товары в «корзину» вашего заказа и оформите заказ.Здесь вы увидите расходы на желаемые товары, прежде чем разместить заказ.
  • Никаких специальных предложений по нашим тарифам на доставку нет.
  • Сборы рассчитываются до уплаты налогов.
  • Обратите внимание, что общая стоимость доставки и обработки не увеличивается после размещения заказа.
  • Если товары не заказаны, общая стоимость доставки и обработки будет распределяться пропорционально и взиматься по мере отгрузки товара.
  • Все заказанные товары отправляются стандартной доставкой.

Доступ к способам доставки предоставляется автоматически во время онлайн-оформления заказа. Вы также можете просмотреть сметы и выбрать способ доставки (ускоренная и т. д.). Мы предоставляем расценки на доставку, где это применимо.

Обратите внимание, что «Двенадцатый лад» предоставляет цены и расценки на доставку, но опять же, любые импортные пошлины, которые может взимать ваше правительство, находятся вне нашего контроля, и мы не можем предсказать или сообщить, какими они будут.

Узнайте больше о наших правилах и процедурах возврата и возмещения.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)

Резонансный перенос энергии флуоресценции (более известный как FRET) позволяет обнаруживать сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров.

Это взаимодействие, зависящее от расстояния, достаточно близко, чтобы позволить происходить молекулярным реакциям, и поэтому может предоставить информацию о потенциальных взаимодействиях между мечеными молекулами внутри клетки.

Содержание

Введение в FRET

Флуоресценция – это световой сигнал, который мы можем обнаружить, когда флуорофор поглощает энергию на определенной длине волны и возбуждается, чтобы излучать свет на более высокой длине волны, возвращаясь в свое основное состояние.

Во время FRET донорный флуорофор возбуждается источником света и передает свою энергию соседнему акцепторному флуорофору. Акцепторный флуорофор поглощает энергию, создавая обнаруживаемый сигнал излучения света. Этот процесс приводит к потере флуоресценции донора и усилению флуоресценции акцептора, оба из которых могут быть измерены. Донорный и акцепторный флуорофоры должны быть близко друг к другу, чтобы процесс FRET был эффективным.Эффективность FRET (E) определяется уравнением E = Ro6 / (Ro6 + r6), где Ro — радиус Фёрстера, а r — фактическое расстояние между двумя флуорофорами. Радиус Ферстера — это расстояние, на котором 50% энергии возбуждения передается от донора к акцептору, а значение Ro обычно лежит в пределах 10–100 Å (1–10 нм). Пары FRET со значением Ro ближе к верхнему пределу этого диапазона часто предпочтительнее из-за повышенной вероятности возникновения FRET.

  • Спектральное перекрытие .Спектр излучения донорного флуорофора должен перекрываться со спектром поглощения акцепторного флуорофора. Чем больше степень спектрального перекрытия, тем больше вероятность возникновения FRET.
  • Ориентация диполя . Перенос энергии от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору происходит посредством межмолекулярного диполь-дипольного взаимодействия. Пространственная связь между дипольным моментом излучения донора и дипольным моментом поглощения акцептора описывается коэффициентом ориентации ø2, который имеет значения в диапазоне от 0 (все диполи перпендикулярны) до 4 (все диполи параллельны).Ориентация диполей между двумя флуорофорами обычно считается случайной из-за быстрого вращения молекул и принимается равной статистическому среднему значению (значение 2/3) для большинства расчетов Ro.
  • Применение технологии FRET

    FRET — чрезвычайно мощный метод выявления потенциальных молекулярных взаимодействий, который можно использовать в таких методах, как проточная цитометрия, иммуноцитохимия, иммуногистохимия и ELISA. FRET также идеально подходит для высокопроизводительного скрининга (HTS), поскольку он прост, чувствителен и легко автоматизируется.

    Одним из популярных применений FRET является определение взаимодействия между двумя биомолекулами, например, связывание лиганда с рецептором; сигнал FRET можно обнаружить, только когда биомолекулы находятся в непосредственной близости благодаря событию связывания.

    FRET полагается на использование высококачественных маркированных реагентов. В зависимости от предполагаемой установки анализа это могут быть антитела, белки или пептиды.

    Оптимальные пары флюорохромов для FRET

    Мы определили следующие оптимальные пары FRET, которые можно найти в нашем ассортименте антител, созданные с использованием наборов для конъюгации Lightning-Link® или изготовленные с помощью наших услуг по индивидуальной маркировке для обеспечения полной гибкости анализа:

    • ​RPE-APC
    • RPE-Cy5
    • RPE-Cy5. 5
    • RPE-Cy7
    • RPE – DyLight®650
    • RPE – APC/Cy5.5
    • Флуоресцеин – RPE
    • APC – DyLight750

    покрывая спектр от УФ до дальнего инфракрасного диапазона, чтобы помочь удовлетворить все ваши экспериментальные потребности.

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    Addgene: Fluorescent Protein Guide: FRET

    C5V Cerulean присоединен к Венере через линкер из 5 аминокислот
    К17В Cerulean присоединен к Венере через линкер из 17 аминокислот
    К32В Cerulean присоединен к Венере через линкер из 32 аминокислот
    С5А Cerulean, присоединенный к янтарю через линкер из 5 аминокислот
    С17А Cerulean, присоединенный к янтарю через линкер из 17 аминокислот
    С32А Cerulean, присоединенный к янтарю через линкер из 32 аминокислот
    mGFP-10-sREACh-N3 Мономерный EGFP, присоединенный к super-REACh через линкер из 10 аминокислот
    АКА Гетеротримерная конструкция, состоящая из Amber-5aa линкер-Cerulean-6aa линкер-Amber
    ACV Гетеротримерная конструкция, состоящая из линкера Amber-5aa-Cerulean-6aa-линкера-Venus
    СВУ Гетеротримерная конструкция, состоящая из линкера Venus-5aa-Cerulean-линкера 6aa-Amber
    ВКВ Гетеротримерная конструкция, состоящая из линкера Venus-5aa-Cerulean-линкера 6aa-Venus
    ACAV Гетеротетрамерная конструкция, состоящая из Amber-5aa линкер-Cerulean-5aa линкер-Amber-6aa линкер-Venus
    АКВА Гетеротетрамерная конструкция, состоящая из Amber-5aa линкер-Cerulean-5aa линкер-Venus-6aa линкер-Amber
    ВСАА Гетеротетрамерная конструкция, состоящая из Venus-5aa линкер-Cerulean-5aa линкер-Amber-6aa линкер-Amber
    ВКВВ Гетеротетрамерная конструкция, состоящая из линкера Venus-5aa-Cerulean-линкера 5aa-линкера Venus-6aa-линкера-Venus
    В5В Стандарт анизотропии/яркости, состоящий из двух флуоресцентных белков Венеры, соединенных линкером из 5 аминокислот
    В17В Стандарт анизотропии/яркости, состоящий из двух флуоресцентных белков Венеры, соединенных линкером из 17 аминокислот
    В32В Стандарт анизотропии/яркости, состоящий из двух флуоресцентных белков Венеры, соединенных линкером из 32 аминокислот
    ВВВ Стандарт анизотропии/яркости, состоящий из трех флуоресцентных белков Venus, соединенных линкером из 5 и 6 аминокислот соответственно
    ВВВВ Стандарт анизотропии/яркости, состоящий из четырех флуоресцентных белков Venus, соединенных линкером из 5, 5 и 6 аминокислот соответственно
    ВВВВВ Стандарт анизотропии/яркости, состоящий из пяти флуоресцентных белков Венеры, соединенных линкерами из 5 аминокислот
    ВВВВВВ Стандарт анизотропии/яркости, состоящий из шести флуоресцентных белков Венеры, соединенных линкерами из 5 аминокислот
    ПЭТ28CLY1 Стандартный пептидный линкер, состоящий из ECFP и EYFP, соединенных 1 гибким повтором глицин- и серинсодержащего пептидного линкера (GGSGGS)
    ПЭТ28CLY2 Стандартный пептидный линкер, состоящий из ECFP и EYFP, соединенных 2 повторами GGSGGS
    ПЭТ28CLY3 Стандартный пептидный линкер, состоящий из ECFP и EYFP, соединенных 3 повторами GGSGGS
    ПЭТ28CLY4 Стандартный пептидный линкер, состоящий из ECFP и EYFP, соединенных 4 повторами GGSGGS
    ПЭТ28CLY5 Стандартный пептидный линкер, состоящий из ECFP и EYFP, соединенных 5 повторами GGSGGS
    ПЭТ28CLY6 Стандартный пептидный линкер, состоящий из ECFP и EYFP, соединенных 6 повторами GGSGGS
    ПЭТ28CLY7 Стандартный пептидный линкер, состоящий из ECFP и EYFP, соединенных 7 повторами GGSGGS
    ПЭТ28CLY8 Стандартный пептидный линкер, состоящий из ECFP и EYFP, соединенных 8 повторами GGSGGS
    ПЭТ28CLY9 Стандартный пептидный линкер, состоящий из ECFP и EYFP, соединенных 9 повторами GGSGGS
    pmВенера(L68V)-mБирюзовый2 Стандарт яркости, используемый в качестве положительного контроля для характеристики mTurquoise2
    pmБирюзовый2-T2A-Венера(L68V) Эталон яркости использовал отрицательный контроль (без FRET) с pmVenus(L68V)-mTurquoise2

    Границы | FRET в биофизике мембран: обзор

    Введение

    Резонансный перенос энергии Ферстера (FRET) представляет собой фотофизический процесс, при котором первоначально электронно-возбужденный флуорофор, называемый донором (D), передает свою энергию возбуждения (и, таким образом, гасится) другому хромофору, называемому акцептором (A), электронный спектр поглощения которого перекрывает эмиссию D. Последний, первоначально находящийся в основном электронном состоянии, при переносе возбуждается и может (или не может) флуоресцировать. FRET не включает ни испускание фотонов, ни молекулярный контакт между двумя видами, но сильно зависит от расстояния между ними. Для изолированной пары донор-акцептор коэффициент скорости (первого порядка) для FRET-взаимодействия пропорционален обратной шестой степени этого расстояния (Förster, 1949). Характерной длиной для FRET является радиус Фёрстера, R 0 , определяемый как расстояние донор/акцептор, для которого FRET в данной паре D/A эффективен на 50% (то есть столь же вероятен, как и другие процессы D затухание возбуждения).На практике диапазон расстояний, для которого чувствителен FRET, находится между 0,5 R 0 и 2 R 0 , поскольку эффективность FRET в этом интервале варьируется от 98,5 до 1,5%. Величина R 0 характерна для каждой пары D/A в данной среде, но обычно лежит в диапазоне 1,5–6 нм. Это означает, что FRET в основном чувствителен к расстояниям в масштабе от 1 до 10 нм, что находится за пределами досягаемости обычных методов оптической микроскопии, но полностью подходит для изучения важных вопросов биофизики мембран, таких как обнаружение и характеристика. нанодоменов/рафтов и липид-белкового или белок-белкового взаимодействия (рис. 1).

    Рисунок 1. Схематическое изображение приложений FRET в биофизике мембран . Изображен только один двухслойный листок. (А) неоднородность мембраны; (B) определение поперечного расположения флуоресцентного остатка/метки; (C) белково-липидная селективность; (D) олигомеризация белка .

    Можно предусмотреть различные подходы, начиная от качественных исследований изменения стационарной эффективности FRET без учета лежащей в основе кинетики и заканчивая анализом данных флуоресценции с временным разрешением с использованием соответствующих формализмов, позволяющих количественно восстановить топологическую информацию о системе, подвергаемой воздействию. учиться.До недавнего времени эти последние сложные приложения были в основном ограничены простыми системами (обычно одно- или двухкомпонентными модельными мембранами), тогда как исследования FRET в сложных системах, таких как мембраны живых клеток (для которых получение качественных данных флуоресценции с временным разрешением было технически неосуществимо) полагались на более качественные методы лечения. В настоящее время, с огромным развитием методов, основанных на флуоресцентной микроскопии, пространственное и временное разрешение могут эффективно сочетаться с изучением реальных биологических мембран.В этом обзоре описываются основные формализмы FRET в мембранах и указываются важные иллюстративные применения FRET для решения различных проблем в мембранных системах (таблица 1).

    Таблица 1 . Избранные примеры исследований мембран FRET .

    Феноменологические применения FRET в мембранах

    Даже если FRET используется в качестве качественного индикатора близости хромофоров, без учета его фактической кинетики, остается широкий спектр приложений в биофизике мембран. Кроме того, сложность некоторых систем является серьезным сдерживающим фактором для применения сложных формализмов, и единственным доступным вариантом может быть более феноменологический подход.

    Классическим применением FRET является мониторинг липидного обмена или смешивания и слияния мембран, как описано Struck et al. (1981). Эти авторы следили за слиянием фосфатидилсериновых (PS) пузырьков, индуцированных ионом кальция. Были смешаны две популяции везикул, одна из которых содержала зонды D и A, а другая содержала только немеченый фосфолипид.Выбранная пара FRET состояла из меченых фосфолипидов N -(7-нитро-2,2,3-бензосадиазол-4-ил)-фосфатидилэтаноламина (NBD-PE, D) и N -(лиссамин Родамин B сульфонил )-диолеоилфосфатидилтаноламин (Rh-PE, A) и с тех пор стал, вероятно, наиболее часто используемой парой в исследованиях мембранного FRET. При добавлении иона кальция слияние вызывает смешивание меченых и немеченых везикул. После перераспределения липидов путем латеральной диффузии поверхностная концентрация акцепторных зондов, окружающих каждого донора, уменьшается. Это приводит к уменьшению степени тушения доноров при FRET, снижается эффективность переноса энергии и, следовательно, увеличивается интенсивность эмиссии доноров. Другая возможность заключается в наблюдении за повышением эффективности FRET (снижение флуоресценции D) при смешивании популяции везикул, помеченных только D, с другой, помеченной только A, как показано в недавнем исследовании SNARE-опосредованного слияния (van den Bogaart et al. ., 2010).

    При изучении латерального распределения липидов FRET между зондами с одинаковыми свойствами распределения станет более эффективным вследствие разделения фаз (и, наоборот, для зондов, проявляющих предпочтительность комплементарных фаз).Однако разделение зонда — не единственное явление, которое может повлиять на эффективность FRET. При изменении состава мембраны могут возникать изменения площади/липида и фотофизических параметров зонда (и, следовательно, R 0 ), что потенциально может привести либо к ошибочной идентификации, либо к маскировке образования домена. С этой целью могут быть разработаны оригинальные схемы для более точного обнаружения начала образования домена, такие как схема, предложенная Сильвиусом (2003), в которой эффективность FRET достигается с помощью акцептора со сродством к одной из липидных фаз и двух разных доноров. которые распределяются по разным мембранным доменам, сравнивают.Пока мембрана гомогенна, изменения в составе липидов будут одинаково влиять на эффективность FRET обеих пар D/A. Однако если домены образуются, два донора распадаются на разные фазы, и эффективность тушения для каждого из них будет сказываться противоположным образом.

    Как упоминалось ниже, распределение D или A можно количественно оценить по параметрам разрешенной во времени флуоресценции D в присутствии A (анализируется в целом вместе с флуоресценцией в отсутствие A).FRET можно также использовать более простым способом в качестве индикатора предпочтения домена, примером чего является недавно предложенный «FRET assay of raft Association» (Nelson et al. , 2010). Эффективность FRET между исследуемым белком (D) и одним из двух акцепторов, пирен-DOPE (предпочитает ld-фазу) и LcTMADPH (предпочитает lo-фазу), измеряют и сравнивают с эффективностью при использовании других доноров, LW-пептида (трансмембранный спиральный тип пептид с высокой аффинностью к ld-доменам) и холерный токсин-B (белок, который связывается с липидом, ассоциированным с рафтом, ганглиозидом GM1 и имеет очень высокую аффинность к lo-доменам) в липидной смеси ld/lo-фазы сосуществования.Таким образом, в примерах этих авторов показано, что перфринголизин O имеет промежуточное сродство между рафтами пептида LW и холерного токсина-B в везикулах, содержащих упорядоченные домены, богатые сфингомиелином мозга или 1,2-дистеароил- sn -3-глицерофосфохолином ( ДСПК).

    При изучении липидно-белкового взаимодействия FRET между, например, мембранным пептидом или белком D и акцепторами липидов различных классов/ацильных цепей может указывать на предпочтительную ассоциацию или селективность в отношении определенного типа липидов, а FRET между D-несущими и А-несущие мембранные белки можно использовать для обнаружения образования гетеро- или гомоолигомеров белков. В этом случае количественные модели необходимы для дальнейшей характеристики этих взаимодействий (см. Формализмы для липид-белкового или белок-белкового взаимодействия ниже).

    Внутримолекулярный FRET: «спектроскопическая линейка»

    Резонансный перенос энергии Фёрстера между D/A-парами, для которых расстояние D-A одинаково, например, подтвержденный в растворе двуххромофорных соединений, часто называют «внутримолекулярным» FRET. Количественное определение степени FRET определяется эффективностью FRET, E , которая рассчитывается как

    .

    в этом уравнении, i D ( t ) и i DA ( t ) — распады D в отсутствие и присутствии A (соответственно).Влияние FRET на флуоресценцию D заключается в уменьшении его времени жизни и квантового выхода. В этом простом случае закон распада D остается экспоненциальным, хотя и более быстрым, чем в отсутствие акцептора. Связь между временем жизни D в отсутствие и в присутствии A (τ 0 и τ соответственно) определяется выражением

    , где R — разделение D–A. Выражение, идентичное уравнению 2 можно записать для квантового выхода флуоресценции или стационарной интенсивности флуоресценции. R 0 рассчитывается независимо от спектроскопических данных,

    , где κ 2 — фактор ориентации (подробное обсуждение см. в Van Der Meer et al., 1994), Φ D — квантовый выход D в отсутствие A, n — показатель преломления, λ — длина волны (в единицах нм), I (λ) — нормализованный спектр излучения D, а ε(λ) — спектр молярного поглощения A. Таким образом, R легко вычисляется как из установившегося состояния, так и из времени — разрешенные данные.На этом основано использование внутримолекулярного FRET в качестве «спектроскопической линейки» (Stryer, 1978).

    В контексте биофизики мембран внутримолекулярный FRET до сих пор используется для получения структурной и динамической информации о мембранных белках. Это особенно важно, учитывая, что до сих пор отсутствуют структуры высокого разрешения многих мембранных белков (традиционно получаемые с помощью рентгеновской кристаллографии, криоэлектронной микроскопии или ЯМР-спектроскопии). Сайт-направленное мечение позволяет включать подходящие донорные и акцепторные группы FRET, и на основании измерения эффективности FRET можно изучать картирование белков и/или кинетику конформационных изменений.Последние приложения перечислены и кратко описаны в таблице 1.

    Равномерное распределение флуорофоров в мембранах

    В мембранах каждая молекула D обычно окружена распределением молекул A. Следовательно, измерение одиночных цифро-аналоговых расстояний нецелесообразно и нецелесообразно. Затухание эмиссии D становится сложным и зависит от топологии изучаемой системы, а также от концентрации A. Аналитические решения все еще могут быть получены для равномерного распределения хромофоров.Для плоских распределений D и A распад D в присутствии A дан Fung and Stryer (1978), Wolber and Hudson (1979):

    В этом уравнении γ — неполная гамма-функция, R e — минимальное расстояние D/A (расстояние исключения), а n — численная концентрация А (молекул на единицу площади). Хотя первоначально он был получен для плоскости акцепторов, содержащей донор (перенос цис ), он также действителен, если молекула D отделена от плоскости А расстоянием R e , ситуация обычная для мембран, поскольку D и A часто располагаются на разной глубине бислоя.

    При приготовлении липидных везикул молекулы D и A часто с равной вероятностью встраиваются в любой из двухслойных листков. В этом случае для данного D необходимо рассматривать две плоскости А, одну из которых соответствуют акцепторам, лежащим в том же бислойном листке, что и донор, а другую — расположенным в противоположном листочке. Закон затухания в этом случае получается простым умножением собственного затухания D на члены FRET, соответствующие каждой плоскости A.

    Другим обычным явлением в мембранных системах является сложный распад D даже в отсутствие A, при этом для правильного описания требуется сумма двух или трех экспонент.В этом случае можно по-прежнему использовать приведенные выше уравнения при условии, что экспоненциальный член собственного распада D заменяется этой функцией, а τ 0 заменяется средним по интенсивности (Lakowicz, 2006) временем жизни распада. Это связано с тем, что каждый компонент времени жизни характеризуется различным значением R 0 , пропорциональным обратной шестой степени соответствующего квантового выхода флуоресценции Φ D (уравнение 3). Если все эти компоненты имеют одинаковые радиационные постоянные распада (обычно хорошее приближение), их значения Φ D , в свою очередь, пропорциональны значениям τ 0 .Это означает, что скорости FRET для заданного A, расположенного на расстоянии R [задается формулой (1/τ 0 )( R 0 / R ) 6 ], одинаковы независимо от D рассматривается компонент времени жизни, поскольку он является инвариантным (Loura et al., 1996, 2000b). Из-за этого постоянства уравнение 4 можно использовать со средними значениями R 0 и τ 0 . Вариант здесь состоит в том, чтобы использовать спектроскопический R 0 (рассчитанный с экспериментальным, усредненным значением Φ D ) и истинное статистическое среднее τ 0 , которое является средней интенсивностью.

    Для стационарных приложений уравнение. 4 можно проинтегрировать численно (в программе или электронной таблице) для получения кривых эффективности FRET E (рассчитанной с использованием уравнения 1) как функции концентрации акцептора n с R e в качестве параметра. Альтернативно, R e фиксируется, и экспериментальные затухания/эффективности FRET сравниваются с теоретическими ожиданиями. Возможная неудача при анализе кинетики FRET с помощью формализма равномерного распределения зонда может иметь значение (например,(например, добавление нового компонента к данной однофазной липидной двухслойной системе может вызвать компартментализацию и/или разделение фаз и, следовательно, отклонения от ожидаемого теоретического равномерного распределения).

    Неравномерное распределение флуорофоров содержит топологическую информацию

    Неравномерное распределение компонентов и разделение фаз являются обычными явлениями в смесях липидов. Молекулы, которые несут флуорофоры D и A в эксперименте FRET в такой системе, естественно, будут иметь неоднородное распределение после их распределения между сосуществующими фазовыми доменами.Будем считать, что присутствуют только две фазы или типа доменов (наиболее распространенная экспериментальная ситуация). Если они достаточно велики, чтобы быть бесконечными в масштабе FRET (т. е. осложнения, возникающие в результате FRET с участием молекул в разных доменах, или граничные эффекты, пренебрежимо малы; это тот случай, когда домены больше, чем ~ 5–10 R 0 ), то закон распада донора представляет собой просто линейную комбинацию гипотетических законов распада в каждой фазе i DA , фаза i (задается уравнением4), взвешенных по относительному количеству D в каждой фазе A i (Loura et al., 2000a, 2001):

    Обратите внимание, что время жизни D обычно различно в двух фазах, как и поверхностные концентрации A (и, возможно, также расстояния исключения D-A). Это вводит большое количество подгоночных параметров в уравнение. 5. Чтобы обеспечить значимое восстановление этих параметров, распад D в присутствии A анализируется в целом вместе с распадом в отсутствие A,

    .

    , где τ 1 и τ 2 — время жизни D в каждой фазе.Восстанавливаемые параметры обычно τ 1 , τ 2 , A 2 / A 1 (откуда коэффициент распределения D K pD 90 две фазы, C 1 и C 2 (из которых получен коэффициент распределения A K pA ; Loura et al., 2000a). Частным случаем этого формализма является так называемая ситуация «изолированных доноров», которая соответствует C 2 = 0.

    Будучи строго применимой для бесконечного фазового разделения, эта модель может быть применена к формированию наноразмерных доменов; в этом случае восстановленный коэффициент распределения A («FRET» K pA ) не будет равен истинному коэффициенту, полученному из независимых измерений (интенсивность флуоресценции, анизотропия или время жизни A) («non-FRET» K pA ), и на него влияет (будучи ближе к единице, чем значение «не-FRET») тот факт, что доноры в одной фазе чувствительны к акцепторам в другой. Степень этого отклонения отражает размер нанодоменов. В пределе очень малого размера домена (< R 0 ) «FRET» K pA по существу равен единице. Следовательно, этот вид анализа может дать представление о размере доменов и в случае бесконечного разделения фаз (что может быть подтверждено, если значения «FRET» и «non-FRET» K pA неразличимы) было показано, что фазовая диаграмма бинарной смеси может быть получена из параметров распада (Loura et al., 2001). Buboltz (2007) предложил экспериментальный метод характеристики фазового разделения в липидных мембранах (и определение бинарных и тройных фазовых диаграмм в пределе бесконечной фазы), основанный на этом формализме, но опирающийся исключительно на стационарное сенсибилизированное излучение акцептора. который назвал это «Установившееся состояние пробного разделения FRET» или SP-FRET. Применения этих методологий перечислены в Таблице 1.

    Численное и упрощенное аналитическое рассмотрение FRET в неоднородных системах

    Не получено точного решения скорости или эффективности FRET для случая неполного фазового разделения, когда в сплошной фазе диспергированы нанометровые домены данного типа. Это связано с очевидной потерей симметрии, вызванной наличием доменов. Один из способов справиться с этой сложностью — рассчитать распад D с помощью численного моделирования. По сути, процесс начинается с построения топологии липидной матрицы (т. е. определения размера моделируемой системы, формы домена, среднего размера и распределения по размерам, а затем размещения доменов на матрице, гарантируя, что общая доля каждой фазы равна как и предполагалось) и размещая молекулы D и A с учетом их доменных предпочтений.Затем выбирается данное D и вычисляется его взаимодействие со всеми акцепторами (или с теми, которые находятся в пределах нескольких R 0 длин). Затем этот шаг повторяется для всех доноров, чтобы получить среднее значение по ансамблю для всей системы. Можно получить среднее затухание D, и, используя уравнение. 1, значение эффективности FRET.

    Этот вид численного моделирования уже был описан Вольбером и Хадсоном (1979) для равномерного распределения в плоской геометрии для проверки их аналитической теории. Первое численное решение FRET для неравномерного распределения мембранных зондов было дано Снайдером и Фрейре (1982). В этой работе неоднородность распределения зондов была введена путем включения эвристической потенциальной функции в случайное размещение зондов. Следовательно, никакие домены фактически не моделируются, и хотя уравнения авторов подходят для анализа агрегации зондов в однофазной системе, они бесполезны для разделения фаз. Моделирование, в котором неоднородность распределения зондов вводится путем построения двухфазной системы и с учетом разделения зондов, было представлено авторами для проверки их аналитических формализмов (Loura and Prieto, 2000; Loura et al., 2001; Таулз и Дэн, 2007 г .; Тоулз и др., 2007).

    Другой подход к моделированию состоит в воссоздании процессов возбуждения и девозбуждения каждой молекулы D или A путем стохастического моделирования. В этих расчетах учитываются вероятности возбуждения донора, распада донора не-FRET-процессами, FRET на данный акцептор и девозбуждения акцептора. Эффективность FRET просто рассчитывается по соотношению между общим количеством передач и общим количеством D-возбуждений.Этот тип моделирования был применен к случаю FRET в плоской геометрии с дискообразными доменами (Kiskowski and Kenworthy, 2007).

    Все предыдущие работы характеризуются предварительной фиксацией основной липидной матрицы, включая размер и форму домена, а моделирование касается исключительно расчета скоростей и вероятностей FRET. Другой подход был недавно использован Frazier et al. (2007), которые объединили статистическое моделирование механической решетки методом Монте-Карло (для описания липидной матрицы и определения в ней позиций хромофоров) с упрощенной ступенчатой ​​зависимостью расстояния FRET (считалось, что FRET имеет место тогда и только тогда, когда расстояние D-A в данной паре были менее R 0 ) для анализа экспериментальных данных FRET в тройной смеси плот-модель.Эта работа демонстрирует, что FRET и вычислительные методы могут быть объединены для создания мощной комбинации, подходящей для изучения разделения липидной фазы.

    Преимущество численного моделирования в глобальном масштабе состоит в том, что оно позволяет рассчитывать FRET в системах, для которых из-за их сложности точное решение невозможно. Однако до сих пор они не позволяют напрямую анализировать экспериментальные данные, поскольку в реальном эксперименте ожидается много степеней свободы. Для каждого моделирования необходимо зафиксировать значения для R 0 , времени жизни D, расстояния исключения D/A (все они могут различаться в каждой сосуществующей фазе), формы и размера домена, а также коэффициентов разделения D и A.Эта множественность переменных исключает возможность подгонки простыми эмпирическими функциями, которые могли бы описать, например, изменение эффективности FRET в зависимости от концентрации А в общем виде, удобном для большинства исследователей. Изучение конкретной системы требует индивидуальной настройки и процедур моделирования.

    Альтернативой численному моделированию FRET в наногетерогенных бислоях является использование упрощенных аналитических методов, которые, в отличие от первых, потенциально могут быть пригодны для прямого анализа экспериментальных данных, позволяющего восстановить интересующие параметры. Однако этот вид формализма характеризовался либо жесткими упрощающими приближениями (Gutierrez-Merino, 1981; Brown et al., 2007a,b), либо в некоторой степени полагался на численные результаты (Towles et al., 2007; см. Loura et al. ., 2010а для подробного обсуждения), что исключает их широкое использование.

    Формализмы для липид-белкового или белок-белкового взаимодействия

    Относительно простым применением FRET в мембранных системах, содержащих пептиды/белки, несущие флуоресцентные остатки (триптофан и тирозин), является определение поперечного расположения последних.Триптофан и тирозин действуют как доноры переноса энергии, поскольку они поглощают на коротких волнах, поэтому следует использовать подходящие акцепторы с известным положением в мембране (см. табл. 1). Поскольку эффективность переноса зависит от расстояния исключения D-A, значение R e (и, следовательно, поперечное расположение) может быть получено путем подгонки уравнений 1 и 4 к экспериментальным данным. Ряд стеариновых кислот, дериватизированных антроильным хромофором, доступен и очень подробно описан в литературе (см.г., Блатт и др., 1984). Поскольку спектры поглощения различных акцепторов практически неизменны, радиус Фёрстера для всех постоянен, а для триптофана в виде D он близок к R 0 = 25 Å. Можно показать, что при R e > приблизительно 1,7 R 0 получается зависимость типа Штерна–Фольмера (Shaklai et al., 1977; Dewey, Hammes, 1980), выражающаяся очень простое уравнение

    , где I DA и I D обозначают стационарную интенсивность излучения D в присутствии и в отсутствие A соответственно.В то время как уравнения 4 и 7 предполагают аксиальное распределение хромофоров A вокруг остатка D, Yguerabide (1994) обобщил теорию, включив случай, когда D не находится на оси симметрии меченого белка, и распространил ее действие на случаи, когда R e < R 0 , неизбежно с некоторой дополнительной сложностью.

    Белки, включенные в модельные мембраны, содержащие липиды с различными электростатическими свойствами или гидрофобными длинами, могут проявлять селективность к одному липидному компоненту на границе белок-липид, что традиционно рассматривалось с помощью спектроскопии электронного спинового резонанса (Marsh and Horváth, 1998).Однако практически идентичную информацию можно получить с помощью FRET. Качественная информация легко получается путем сравнения степени FRET от белка до флуоресцентно меченных липидов различных классов/ацильных цепей, как упоминалось выше. Было предложено несколько количественных моделей, которые недавно подверглись критическому анализу (Loura et al., 2010b). В таблице 1 перечислены приложения этих формализмов к экспериментальным данным FRET.

    Характеристика белок-белковых взаимодействий с использованием FRET с участием двух различных меченых производных белков или пептидов была описана более 30 лет назад.В уже ставшей исторической статье, используя простой формализм, который пренебрегал межмолекулярным FRET, но принимал во внимание различные схемы олигомеризации (димеры/тримеры/тетрамеры), Витч и Страйер (1977) подтвердили, что гипотеза образования димеров грамицидина (D: дансил-грамицидин C; A: производное 4-(диэтиламино)-фенилазобензол-4-сульфонилхлорида грамицидина C) лучше соответствует модели, чем сценарии образования как тримера, так и тетрамера. Агрегация белков мембраны хромаффинных гранул, меченных йодоаминонафтилсульфонатом малеимида (D) и флуоресцеин-ацетатом ртути или флуоресцеин-5-малеимидом (А), была качественно подтверждена Morris et al.(1982) при добавлении иона кальция. После этих ранних исследований FRET стал важным инструментом для характеристики агрегации белков/пептидов. Необходимо тщательно выбирать формализм, который будет использоваться для анализа данных, поскольку ранние модели сосредоточены на внутриагрегатном переносе энергии, пренебрегая межмолекулярным FRET «свидетеля» (например, Adair and Engelman, 1994; Li et al., 1999). Это приближение, как правило, справедливо только в пределах очень разбавленных меченых белков и обычно используется в недавних работах по применению FRET или резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET, см.g., James et al., 2006) к изучению олигомеризации мембранных белков, перечисленных в таблице 1. Другие подходы направлены на вычисление чистого внутриагрегатного члена (недавний пример см. в Raicu, 2007). Следует отметить, что сочетание внутриагрегатных и межмолекулярных терминов следует проводить осторожно. В частности, неправильно вычитать чистую межмолекулярную эффективность из комбинированной межагрегатной и межмолекулярной FRET (You et al., 2005). Если популяция доноров подвергается тушению двумя разными типами акцепторов (т.g., связанные и несвязанные с данным донором), правильный способ расчета эффективности FRET состоит в том, чтобы умножить члены FRET, соответствующие всем вкладам тушения, чтобы получить i DA ( t ), и конец (уравнение 1). Примером этого является недавнее исследование, в котором сделан вывод о том, что N-концевой домен N-BAR образует антипараллельные димеры в 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3-[фосфо-рац-(1-глицерин)] (POPG) везикулы (Fernandes et al., 2008).

    FRET с диффузионным усилением

    В предыдущих разделах предполагалось, что поступательная диффузия как D, так и A пренебрежимо мала в течение времени жизни возбужденного состояния D, т. е. условие ≪ 1 (где D DA — сумма коэффициентов боковой диффузии D и A, а с — среднее расстояние D—A).В противном случае быстрая диффузия хромофора приводит к увеличению скорости FRET, что можно интуитивно понять, если учесть, что пара D/A, первоначально разделенная большим расстоянием, которое предотвратило бы FRET, может стать достаточно близкой для возникновения FRET с высокой скоростью. вероятность в течение времени жизни возбужденного состояния D вследствие диффузии.

    Общая теория FRET с усилением диффузии была создана Steinberg and Katchalski (1968) и подтверждена экспериментально Thomas et al.(1978). Особый интерес представляет так называемый предел быстрой диффузии, характеризуемый D DA τ 0 / с 2 ≪ 1, что приводит к предельно упрощенным уравнениям для скорости FRET. Это условие требует времени жизни D в диапазоне от микросекунд до миллисекунд, что обычно достижимо с использованием подходящих хелатов лантанидов в качестве частиц D. Для однородного двумерного распределения незаряженных сферических хромофоров можно показать, что получается экспоненциальный распад D со временем жизни

    где

    Последнее уравнение (которое, как ни странно, формально идентично уравнению7, который является приблизительным решением совсем другой задачи) показывает, что скорость FRET в этом режиме сильно зависит от R e . По этой причине FRET с пределом быстрой диффузии нашел применение для измерения расстояния до ближайшего подхода DA (где обычно вид A представляет собой белок) в 1980-х годах (примеры см. в Таблице 1). Кроме того, усиленная FRET диффузия заряженных частиц D/A чувствительна к электростатическому потенциалу и поэтому может использоваться для определения мембранных потенциалов (Meltzer et al., 2006). Удивительно, но недавних применений в мембранах было очень мало, что привело к воодушевленному комментарию: «С середины 1980-х технология [FRET с диффузионным усилением], кажется, оставалась бездействующей, ожидая подходящей возможности вернуться к жизни» (Fairclough, 2006).

    Гомо-FRET против гетеро-FRET

    В предыдущих разделах предполагалось, что хромофоры D и A различаются (гетеро-FRET). Это подразумевало необратимость процесса переноса, который можно было контролировать, измеряя либо степень тушения D, либо сенсибилизированную флуоресценцию A.Напротив, FRET между идентичными флуорофорами (гомо-FRET) не приводит к снижению интенсивности флуоресценции или времени жизни донора, потому что популяция возбужденного состояния донора не уменьшается во время акта переноса. На практике единственным наблюдаемым явлением, отражающим это явление, является анизотропия флуоресценции (Lakowicz, 2006), которая уменьшается вследствие гомопереноса. Для измерения анизотропии флуоресценции требуются поляризаторы, и, поскольку они приводят к значительному снижению регистрируемого излучения, часто для заданной точности требуется большее количество флуорофора (по сравнению с тем, которое используется при измерении интенсивности).В случае, если прибор не представляет проблемы, уменьшение анизотропии совершенно очевидно: если две молекулы разделены расстоянием R = R 0 , измеренная анизотропия будет составлять только ~ 2/3 от анизотропии молекулы. мономера, что является значительным снижением.

    Несмотря на очевидное преимущество, заключающееся в том, что требуется только один флуорофор, использование гомо-FRET более ограничено, чем использование гетеро-FRET. Обоснование степени деполяризации из-за гомо-FRET более сложно, чем тушение из-за гетеро-FRET, потому что: (i) существует возможность обратного переноса на непосредственно возбужденного донора или переноса на любой донор, в конечном итоге включает большое количество стадий переноса, и (ii) будучи анизотропией флуоресценции, соответствующей наблюдаемой, в дополнение к RET, другим источником деполяризации является вращение флуорофора.Если вращение и RET происходят в одном и том же временном масштабе, эти два явления связаны, что является основным препятствием для количественного анализа данных гомопереноса. Теоретические описания, которые не учитывают эти особенности должным образом (например, Yeow and Clayton, 2007), следует рассматривать с осторожностью. Несмотря на эту сложность, гомо-FRET по-прежнему регулярно используется в исследованиях мембран, в последнее время в сочетании с флуоресцентной микроскопией (см. раздел ниже и таблицу 1; Bader et al., 2011) для обнаружения и характеристики хромофора (например,г., меченый белок) конфайнмент или агрегация. В связи с этим следует отметить, что использование объективов с высокой числовой апертурой приводит к уменьшению наблюдаемой анизотропии (Axelrod, 1979). Этот артефакт можно минимизировать, используя меньшую числовую апертуру (≤0,8) с потерей разрешения и чувствительности, или скорректировать, например, с помощью стандартной молекулы (Tramier and Coppey-Moisan, 2008).

    ЛАД под микроскопом

    Недавние разработки в области мультиволновой визуализации и визуализации с поляризационным разрешением привели к широкому использованию FRET-визуализации в исследованиях функциональных агрегатов клеточных мембран.Экспериментальные методы визуализации мембранных микродоменов и количественной оценки эффективности FRET в FRET-микроскопии с упором на новые стратегии были рассмотрены в другом месте (Rao and Mayor, 2005; Jares-Erijman and Jovin, 2006; Owen et al. , 2007; Padilla-Parra et al. ., 2008). Было разработано несколько подходов для изучения в нанодиапазоне специфических белок-белковых, липид-липидных или липид-белковых взаимодействий в живых клетках с использованием как гомо-, так и гетеро-FRET.

    Клеточные мембраны характеризуются большим количеством липидных и белковых компонентов, находящихся в неравновесном состоянии.Одним из распространенных упрощений является предположение о двух типах доменов, например, плот/неплот или упорядоченный/неупорядоченный. Затем результаты можно сравнить, например, с сосуществованием ld/lo на фазовой диаграмме липидов в тройной модельной системе. Из-за внутренних ограничений, таких как стабильность клеток, а также из-за того, что обычно в клетках проводятся микроскопические исследования (чтобы контролировать состояние клеток, знать локализацию флуорофора и использовать сигнал, исходящий только от интересующей мембраны), интенсивность флуоресценции затухает с большое количество фотонов и низкий фоновый сигнал (необходимые для применения большинства формализмов, описанных выше) обычно невозможны. Обычно получают установившиеся данные и сравнивают их с интегрированным формализмом FRET. Даже когда с помощью микроскопии для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM; см. традиционно используется для расчета эффективности FRET с использованием уравнения. 1, а не непосредственно анализировать с помощью лежащей в основе кинетической модели FRET. Однако с инструментальными улучшениями, а также разработкой новых подходов к анализу (Grecco et al., 2009) эта тенденция меняется на противоположную. Избранные работы, сочетающие FRET и микроскопию, перечислены в таблице 1, в которой кратко описаны иллюстративные литературные отчеты, в которых FRET использовался (по крайней мере) в одном из приложений, описанных выше.

    Заключение

    В этом обзоре описаны применения FRET в биофизике мембран, в том числе исследования картирования мембранных белков, латеральной гетерогенности (мембранных доменов), определения поперечного расположения (глубины) флуоресцентных остатков/меток внутри мембраны, белковой/липидной селективности ( предпочтение определенного липида рядом с белком) и олигомеризация мембранного белка.

    Была рассмотрена сложность FRET в мембранах, представлена ​​оценка гетеро- и гомо-FRET, и с помощью этой методологии можно получить подробную топологическую информацию, если принять во внимание адекватное моделирование. Критически рассмотрены примеры соответствующих работ в этой области и упомянуты недавние применения FRET под микроскопом, а именно из данных с временным разрешением (FRET-FLIM). В целом подчеркивается мощь FRET как инструмента биофизики мембран.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Авторы признают финансирование FEDER через программу COMPETE и FCT, ссылки на проекты FCOMP-01-0124-FEDER-010787 (FCT PTDC/QUI-QUI/098198/2008), PTDC/QUI-BIQ/099947/2008 и PTDC/QUI-BIQ/112067/2009.

    Каталожные номера

    Акасандреи, М. А., Дейл, Р. Э., ВандеВен, М., и Амелут, М. (2006). Двумерный резонансный перенос энергии Фёрстера (2-D FRET) и гипотеза мембранного рафта. Хим. физ. лат. 419, 469–473.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Аниковский М., Дейл Л., Фергюсон С. и Петерсен Н. (2008). Резонансный перенос энергии в клетках: новый взгляд на эффект фиксации и агрегацию рецепторов на клеточной мембране. Биофиз. Дж. 95, 1349–1359.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Антоллини С.С. и Баррантес Ф.Дж. (1998). Обнаружение дискретных участков для фосфолипидов и стеролов на поверхности раздела белок-липид в нативной мембране, богатой ацетилхолиновыми рецепторами. Биохимия 37, 16653–16662.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Бадер, А. Н., Хетцль, С., Хофман, Э.G., Voortman, J., van Bergen en Henegouwen, P. M.P., van Meer, G., и Gerritsen, H.C. (2011). Визуализация Homo-FRET как инструмент для количественной оценки кластеризации белков и липидов. Химфизхим 12, 475–483.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Блатт, Э., Шателье, Р. К., и Сойер, У. Х. (1984). Поперечное расположение флуорофоров в липидных бислоях и мицеллах, определяемое методами флуоресценции. Фотохим. Фотобиол. 39, 477–483.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Браун, А.С., Таулз, К.Б., и Ренн, С.П. (2007a). Измерение размера плота в зависимости от состава мембраны в системах на базе ПК: часть I – бинарные системы. Ленгмюр 23, 11180–11187.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Браун, А.С., Таулз, К.Б., и Ренн, С.П. (2007b). Измерение размера рафта в зависимости от состава мембраны в системах на основе ПК: часть II – тройные системы. Ленгмюр 23, 11188–11196.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Buboltz, JT, Bwalya, C., Williams, K., and Schutzer, M. (2007). Картирование фазового поведения с высоким разрешением в тройной липидной смеси: зависят ли фазовые границы липид-плот от процедуры приготовления образца? Ленгмюр 23, 11968–11971.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Capeta, R.C., Poveda, J.A., and Loura, L.М. С. (2006). Неравномерное распределение мембранных зондов при резонансной передаче энергии: приложение к белково-липидной селективности. J. Флуоресц. 16, 161–172.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Ча, А., Снайдер, Г.Е., Селвин, П.Р., и Безанилла, Ф. (1999). Движение чувствительной к напряжению области в калиевом канале в атомном масштабе, измеренное с помощью спектроскопии. Природа 402, 809–813.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Роговица, Р. Л., Ниту Ф., Грубер С., Колер К., Сатцер М., Томас Д. Д. и Фруен Б. Р. (2009). Картирование кальмодулина, связанного с каналом высвобождения RyR1 Ca2 + , на основе FRET. Проц. Натл. акад. науч. США 106, 6128–6133.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Корнеа Р.Л., Ниту Ф., Самсо М., Томас Д.Д. и Фруен Б.Р. (2010). Картирование белковой субъединицы FK506, связывающей рианодиновый рецептор, с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции. Дж. Биол. хим. 285, 19219–19226.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Коутиньо, А., Лоура, Л.М.С., Федоров, А., и Прието, М. (2008). Пережатая мультиламеллярная структура агрегатов лизоцим- и фосфатидилсеринсодержащих мембран, выявленная методом FRET. Биофиз. Дж. 95, 4726–4736.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    де Алмейда, Р. Ф.М., Лоура, Л.М.С., Федоров А. и Прието М. (2005). Липидные рафты имеют разные размеры в зависимости от состава мембраны: исследование переноса энергии флуоресцентного резонанса с временным разрешением. Дж. Мол. биол. 346, 1109–1120.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Доманов Ю.А., Молотковский Ю.Г. и Горбенко Г.П. (2005). Зависимые от покрытия изменения поперечного расположения цитохрома с в фосфолипидных мембранах, выявленные методом FRET. Биохим.Биофиз. Acta 1716, 49–58.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Фернандес, Ф., Лоура, Л. М. С., Чичон, Ф. Дж., Карраскоса, Дж. Л., Федоров, А., и Прието, М. (2008). Роль спирали 0 домена N-BAR в формировании кривизны мембраны. Биофиз. Дж. 94, 3065–3073.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Фернандес Ф. , Лоура Л. М. С., Федоров А. и Прието М.(2006). Отсутствие кластеризации фосфатидилинозитол-(4,5)-бисфосфата в жидком фосфатидилхолине. J. Рез. липидов. 47, 1521–1525.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Фернандес Ф., Лоура Л.М.С., Кохорст Р., Спруйт Р.Б., Хемминга М.А., Федоров А. и Прието М. (2004). Количественная оценка белково-липидной селективности с использованием FRET: применение к основному белку оболочки M13. Биофиз. J. 87, 344–352.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Фернандес, Ф., Loura, L.M.S., Prieto, M., Koehorst, R., Spruijt, R.B., and Hemminga, M.A. (2003). Зависимость олигомеризации белка основной оболочки M13 и латеральной сегрегации от состава бислоя. Биофиз. J. 85, 2430–2441.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Фёрстер, Т. (1949). Experimentelle und theoretische Untersuchung des Zwischenmolekularen übergangs von Elektrinenanregungsenergie. З. Натурфорш. 4а, 321–327.

    Фрейзер, М.Л., Райт, Дж.Р., Покорный, А., и Алмейда, П.Ф.Ф. (2007). Исследование образования доменов в смесях сфингомиелин/холестерин/ПОФХ с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции и моделирования методом Монте-Карло. Биофиз. J. 92, 2422–2433.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Фунг, Дж. Дж., Деупи, X., Пардо, Л., Яо, X. Дж., Велес-Руис, Г. А., Деври, Б. Т., Сунахара, Р. К., и Кобилка, Б.К. (2009). Лиганд-регулируемая олигомеризация бета(2)-адренорецепторов в модельном липидном бислое. EMBO J. 28, 3315–3328.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Гамбхир А., Хангьяс-Михалине Г., Зайцева И., Кафизо Д.С., Ван Дж., Мюррей Д. , Пентяла С.Н., Смит С.О. и Маклафлин С. (2004). Электростатическая секвестрация PIP2 на фосфолипидных мембранах основными/ароматическими областями белков. Биофиз. J. 86, 2188–2207.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Госвами Д., Гоуришанкар К., Билграми С., Гош С., Рагхупати Р., Чадда Р., Вишвакарма Р., Рао М. и Майор С. (2008). Нанокластеры GPI-заякоренных белков формируются в результате активности кортикального актина. Сотовый 135, 1085–1097.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Гутьеррес-Мерино, К. (1981). Количественная оценка переноса энергии Фёрстера для двумерных систем.I. Латеральное разделение фаз в однослойных везикулах, образованных бинарными смесями фосфолипидов. Биофиз. хим. 14, 247–257.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Gutierrez-Merino, C. , Munkonge, F., Mata, A.M., East, J.M., Levinson, B.L., Napier, R.M., and Lee, A.G. (1987). Положение сайта связывания АТФ на (Ca 2+ + Mg 2+ )-АТФазе. Биохим. Биофиз. Acta 897, 207–216.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Хардинг, П.J., Attrill, H., Boehringer, J., Ross, S., Wadhams, G.H., Smith, E., Armitage, J.P., and Watts, A. (2009). Конститутивная димеризация рецептора, связанного с G-белком, нейротензинового рецептора 1, преобразованного в бислои фосфолипидов. Биофиз. Дж. 96, 964–973.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Харикумар, К.Г., Хаппс, Р.М., и Миллер, Л.Дж. (2008). Димеризация в отсутствие олигомеризации более высокого порядка секретинового рецептора, связанного с G-белком. Биохим. Биофиз. Acta 1778, 2555–2563.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Heberle, F. A., Wu, J., Goh, S.L., Petruzielo, R.S., and Feigenson, G.W. (2010). Сравнение трех смесей тройных липидных бислоев: FRET и ESR выявляет нанодомены. Биофиз. J. 99, 3309–3318.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Эррерос, Дж., Нг, Т., и Скьяво, Г.(2001). Липидные рафты действуют как специализированные домены для связывания и интернализации столбнячного токсина в нейроны. Мол. биол. Ячейка 12, 2947–2960.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст

    Хофман, Э. Г., Руонала, М. О., Бадер, А. Н., ван ден Хеувел, Д., Воортман, Дж., Руверс, Р. К., Верклей, А. Дж., Герритсен, Х. К., и ван Берген и Хенегувен, П. М. П. (2008). EGF индуцирует слияние различных липидных рафтов. Дж. Сотовый. науч. 121, 2519–2528.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Джеймс, Дж. Р., Оливейра, М. И., Кармо, А. М., Ябони, А., и Дэвис, С. Дж. (2006). Строгая экспериментальная основа для обнаружения олигомеризации белков с использованием резонансного переноса энергии биолюминесценции. Нац. Методы 3, 1001–1006.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Джонсон, Д. А., и Насс, Дж. М. (1994). Сайт связывания этидия, чувствительный к гистрионикотоксину, расположен за пределами трансмембранного домена никотинового ацетилхолинового рецептора: флуоресцентное исследование. Биохимия 33, 9070–9077.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Кенворти, А.К., и Эдидин, М. (1998). Распределение гликозилфосфатидилинозитол-заякоренного белка на апикальной поверхности клеток MDCK исследовали с разрешением <100 Å с использованием переноса энергии резонанса флуоресценции визуализации. J. Cell Biol. 142, 69–84.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Кусба, Дж. , Ли, Л., Грычински, И., Пищек, Г., Джонсон, М., и Лакович, Дж. Р. (2002). Коэффициенты боковой диффузии в мембранах, измеренные с помощью резонансной передачи энергии, и новый алгоритм диффузии в двух измерениях. Биофиз. Дж. 82, 1358–1372.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Лакович, младший (2006). Принципы флуоресцентной спектроскопии , 3-е изд. Нью-Йорк: Спрингер.

    Ледер, Р.О., Хелгерсон С.Л. и Томас Д.Д. (1989). Поперечное расположение хромофора сетчатки в пурпурной мембране за счет диффузионно-усиленного переноса энергии. Дж. Мол. биол. 209, 683–701.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Леви, В., Росси, Дж. П. Ф. К., Кастелло, П. Р., и Флеча, Ф. Л. Г. (2003). Количественный анализ взаимодействия мембранных белков с амфифилами с использованием резонансного переноса энергии. Анал. Биохим. 317, 171–179.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Леви, В., Росси, Дж. П. Ф. К., Экарте, М. М., Кастелло, П. Р., и Флеча, Ф. Л. Г. (2000). Термическая стабильность кальциевой помпы плазматической мембраны. Количественный анализ его зависимости от липидно-белковых взаимодействий. Дж. Мембр. биол. 173, 215–225.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Ли, М., Редди, Л. Г., Беннетт, Р., Сильва, Н.Д. младший, Джонс, Л. Р., и Томас, Д. Д. (1999). Метод переноса энергии флуоресценции для анализа олигомерной структуры белка: приложение к фосфоламбану. Биофиз. Дж. 76, 2587–2599.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Лоура, Л.М.С., Коутиньо, А., Сильва, А., Федоров, А., и Прието, М. (2006). Структурные эффекты основного пептида на организацию мембран дипальмитоилфосфатидилхолина/дипальмитоилфосфатидилсерина: исследование переноса флуоресцентной резонансной энергии. J. Phys. хим. В 110, 8130–8141.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Лоура Л.М.С., Федоров А. и Прието М. (1996). Резонансный перенос энергии в модельной системе мембран: приложение к гелевой и жидкокристаллической фазам. Биофиз. Дж. 71, 1823–1836 гг.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Лоура Л.М.С., Федоров А. и Прието М. (2000a).Разделение мембранных зондов в двухкомпонентной липидной системе гель/жидкость: исследование переноса энергии резонанса флуоресценции. Биохим. Биофиз. Acta 1467, 101–112.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Лоура Л.М.С., Федоров А. и Прието М. (2000b). Неоднородность распределения мембранных зондов: исследование резонансного переноса энергии. J. Phys. хим. Б 104, 6920–6931.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Лоура, Л. М. С., Фернандес, Ф.и Прието, М. (2010a). Мембранная микрогетерогенность: характеристика передачи энергии резонанса Фёрстера боковых доменов мембраны. евро. Биофиз. J. 39, 589–607.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Лоура, Л.М.С., Прието, М., и Фернандес, Ф. (2010b). Количественная оценка белково-липидной селективности с использованием FRET. евро. Биофиз. J. 39, 565–578.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Лоура, Л. М. С., и Прието, М. (2000). Резонансный перенос энергии в гетерогенных планарных и двухслойных системах: теория и моделирование. J. Phys. хим. В 104, 6911–6919.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Марш, Д., и Хорват, Л.И. (1998). Структура, динамика и состав липидно-белкового интерфейса. Перспективы спин-маркировки. Биохим. Биофиз. Acta 1376, 267–296.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст

    Мельцер, Р. Х., Лурц, М. М., Вензель, Т. Г., и Педерсен, С. Э. (2006). Электростатика канала никотинового ацетилхолинового рецептора определяется диффузионно-усиленным переносом энергии люминесценции. Биофиз. Дж. 91, 1315–1324.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Мерсье, Дж. Ф., Салапур, А., Анже, С., Брейт, А., и Бувье, М. (2002). Количественная оценка гомо- и гетеродимеризации бета-1- и бета-2-адренорецепторов методом биолюминесцентного резонансного переноса энергии. Дж. Биол. хим. 277, 44925–44931.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Мейер, Б.Х., Сегура Дж.-М., Мартинес К.Л., Ховиус Р., Джордж Н., Джонссон К. и Фогель Х. (2006). Визуализация FRET показывает, что функциональные рецепторы нейрокинина-1 являются мономерными и находятся в мембранных микродоменах живых клеток. Проц. Натл. акад. науч. США 103, 2138–2143.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Моррис, С.Дж., Судхоф, Т.С., и Хейнс, Д.Х. (1982). Обусловленный кальцием резонансный перенос энергии между флуоресцентно мечеными белками при агрегации мембран хромаффинных гранул. Биохим. Биофиз. Acta 693, 425–436.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Нараянасвами, В., и Макнами, М. Г. (1993). Белково-липидные взаимодействия и функция никотиновых ацетилхолиновых рецепторов Torpedo californica . 2. Текучесть мембраны и опосредованное лигандом изменение доступности остатков цистеина гамма-субъединицы для холестерина. Биохимия 32, 12420–12427.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Нельсон, Л.Д., Чейнтиа С. и Лондон Э. (2010). Ассоциация перфринголизина O с упорядоченными липидными доменами: значение для сродства трансмембранных белковых рафтов. Биофиз. Дж. 99, 3255–3263.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Номикос М., Малгрю-Несбитт А., Паллави П., Михалин Г., Зайцева И., Суонн К., Лай Ф.А., Мюррей Д. и Маклафлин С. (2007) . Связывание фосфоинозитид-специфической фосфолипазы C-ξ (PLC-ξ) с фосфолипидными мембранами. Дж. Биол. хим. 282, 16644–16653.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Падилья-Парра, С., Одуге, Н., Коппи-Мойсан, М., и Трамье, М. (2008). Количественный анализ FRET с помощью FLIM с быстрым получением данных во временной области с высоким пространственным разрешением в живых клетках. Биофиз. Дж. 95, 2976–2988.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Пап, Э.Х.В., Бастианс, П.I.H., Borst, J.W., van den Berg, P.A.W., van Hoek, A., Snoek, G.T., Wirtz, K. W.A., and Visser, A.J.W.G. (1993). Количественное определение взаимодействия протеинкиназы С с диацилглицерином и фосфоинозитидами путем обнаружения резонансного переноса энергии с временным разрешением. Биохимия 32, 13310–13317.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Пикас, Л., Суарес-Херма, К., Монтеро, М.Т., Васкес-Ибар, Дж.Л., Эрнандес-Боррель, Дж., Прието, М., и Лоура, Л. М. С. (2010). Селективность пермеазы липидов лактозы с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера. Биохим. Биофиз. Acta 1798, 1707–1713.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Поведа, Дж. А., Энсинар, Дж. А., Фернандес, А. М., Матео, К. Р., Феррагут, Дж. А., и Гонсалес-Рос, Дж. М. (2002). Сегрегация доменов, богатых фосфатидной кислотой, в реконструированных мембранах рецепторов ацетилхолина. Биохимия 41, 12253–12262.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Шарма П., Варма Р., Сарасий Р. К., Ира, Гуссе К., Кришнамурти Г., Рао М. и Майор С. (2004). Наноразмерная организация нескольких GPI-заякоренных белков в мембранах живых клеток. Сотовый 116, 577–589.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Сильвиус, младший (2003). Перенос энергии флуоресценции выявляет образование микродоменов при физиологических температурах в смесях липидов, моделирующих внешний листок плазматической мембраны. Биофиз. Дж. 85, 1034–1045.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Стейнберг И. З. и Качальский Э. (1968). Теоретический анализ роли диффузии в химических реакциях, тушении флуоресценции и безызлучательном переносе энергии. J. Chem. физ. 48, 2404–2410.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Страйер, Л. (1978). Перенос энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. год. Преподобный Биохим. 47, 829–846.

    Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Валенсуэла, К.Ф., Вейн, П., Игерабиде, Дж., и Джонсон, Д.А. (1994). Поперечное расстояние между мембраной и сайтами связывания агонистов на рецепторе ацетилхолина Torpedo: исследование флуоресценции. Биофиз. Дж. 66, 674–682.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    ван ден Богаарт, Г., Холт, М.Г., Бунт Г., Ридель Д., Воутерс Ф. С. и Ян Р. (2010). Одного комплекса SNARE достаточно для слияния мембран. Нац. Структура Мол. биол. 17, 358–364.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Ван Дер Меер, Б.В., Кокер, Г. III, и Чен, С. -Ю. С. (1994). Резонансная передача энергии: теория и данные . Нью-Йорк: ВЧ.

    Витч, В., и Страйер, Л. (1977). Димерная природа трансмембранного канала грамицидина А: исследования проводимости и переноса энергии флуоресценции гибридных каналов. Дж. Мол. биол. 113, 89–102.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Фон Арним, CAF, Киношита, А., Пелтан, И. Д., Тангреди, М. М., Херл, Л., Ли, Б. М., Сполген, Р., Хши, Т. Т., Ранганатан, С., Батти, Ф. Д., Лю, CX, Баскай, Б.Дж., Север, С., Иризарри, М.К., Стрикленд, Д.К., и Хайман, Б.Т. (2005). Белок, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP), является новым субстратом бета-секретазы (BACE1). Дж.биол. хим. 280, 17777–17785.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Йегнесваран С., Вуд Г. М., Эсмон С. Т. и Джонсон А. Э. (1997). Белок S изменяет положение активного центра активированного протеина С над поверхностью мембраны. Изучение переноса энергии флуоресцентного резонанса топографии. Дж. Биол. хим. 272, 25013–25021.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Йеоу, Э.К.Л. и Клейтон, А.Х.А. (2007). Подсчет состояний олигомеризации мембранных белков в живых клетках с помощью гомо-FRET-спектроскопии и микроскопии: теория и применение. Биофиз. Дж. 92, 3098–3104.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    Ю, М., Ли, Э., Уимли, В. К., и Христова, К. (2005). Резонансный перенос энергии Фёрстера в липосомах: измерения димеризации трансмембранной спирали в природной бислойной среде. Анал. Биохим. 340, 154–164.

    Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *