Бридж спайк 02: Bridgestone Blizzak Spike-02 — , , ,

ᐅ Bridgestone Blizzak Spike-02 отзывы — 69 честных отзыва покупателей о шинах Bridgestone Blizzak Spike-02

Самые выгодные предложения по Bridgestone Blizzak Spike-02

 
 

Max, 07.07.2019

Достоинства:
Купил осенью. Езжу на зеднеприводном мощном седане. На шипах конечно шлифует везде где только можно, но держак есть, ESP в тандеме с этими шинами, обеспечивает устойчивость и уверенность на любом покрытии. Зимой крутил пятаки на парковках, тоже без особых трудов, занос контролируемый. Самым главным плюсом считаю, что за первую зиму не выпало ни одного шипа. буду тестировать дальше в следующем году и готовится к покупке летних шин от этого производителя.

Недостатки:
НЕТ

Антуан, 08.

05.2019

Достоинства:
Отлично держат на дороге. Ездишь почти как летом, спокойно переезжаешь колею, бровку из снега или льда между полосами. Несмотря на высокие шипы, внятно едет по сухому асфальту, не скользит. В горку 20-30 градусов, грунтовка под снегом, трактор раз в неделю — заезжаю с небольшого разгона без проблем (на предыдущей резине (кама-евро, 3 года ездил) заезжал через раз, не цепляется и все. По снегу гребет хорошо, лучше наверное только с грунтозацепами будет.

Недостатки:
Шумит конечно посильнее чем та же кама-евро, но безопасность мне вот важнее, чем комфорт.

Комментарий:
Однозначно рекомендую, своих денег стоит. Долго выбирал между Нокиан, Пирелли и Бриджстоуном, итоге решил, что эти будут оптимальны и по цене, и по качеству и главное для меня — должны хорошо грести по заснеженным грунтовкам (живу в деревне, да еще на горе).

В итоге не прогадал, вывозит меня эта резина в мои горы))) А сравнивать есть с чем — ползимы заезжал то задом, то с нескольких попыток в нашу гору по нечищенной дороге.
Посоветовал бы эту резину тем, кто ездит не только по городу, эта резина для асфальт\грунтовка в соотношении 50\50.
Прикатывал 700 км на скоростях до сотки, кстати после этого пробега стали потише.

Евгений, 04.05.2019

Достоинства:
проходимость супер! сделана классно, сбоку резина плотнее

Недостатки:
шумновата, но не критично

Комментарий:
В общем мы на работе всем отделом поставили себе Spike-02 на тачки)) Один поставил, доволен, второй — и так все перешли на бриджей. Я раньше как-то больше к michelin склонялся, а теперь понял, что в плане новых технологий японцы на шаг впереди.

Сцепление с покрытием отличное, офис у нас за городом и приходится частенько ездить прям по снегу или наледи, особенно рано утром когда за ночь успевает набраться. Не застревал ни разу, колеса не прокручиваются, тормозят уверенно. Хороший выбор сделал!

Калимулин Рамиль, 20.04.2019

Достоинства:
уверено чувствуешь себя в галолед

Недостатки:
проездил пару месяцев и повылетали шипы

Комментарий:
резину специально прикатывал 500 км, проехал вобщем 6000 км

Разоблачитель, 18.04.2019

Достоинства:
Отличные шины.

Недостатки:
Ублюдки за бабки пишут отзывы.

Комментарий:
Один год.

forhram forhram, 29.03.2019

Достоинства:
Когда тормозишь -отличное замедление слышно как шипы вгрызаются в поверхность. В поворотах держат уверенно, без сюрпризов. Размерность 185/65/15. Ниссан Тиида Латио, передний привод.

Недостатки:
—

Комментарий:
Я из г.Братска Иркутской области. Очень понравилась работа этих шин сегодня вечером 12.10.17., ставлю 5 в конкретных погодны условиях: У нас Подморозило после дождя со снегом, t -6+2 на асфальте-тонкий лёд по всей ширине дороги и местами замёрзшие лужи, а сверху позёмка. …Надеюсь, резина при нашей зиме (днём -20, ночью за -30 (-46)) своих отличных свойств не потеряет. ..

Роман, 14.03.2019

Достоинства:
Удивительно хорошо выкапываются из рыхлого снега, сугробов, цепляются за накатанную корку льда. На трассе уверенно держат дорогу, пока слой рыхлого снега меньше 2-3 см… дальше необходимо сбрасывать скорость и думать головой. По лужам, по сухому асфальту, по гололеду поведение прогнозируемо и адекватно. Ни с чем не сравнимая уверенность, что при необходимости затормозишь быстрее впереди идущей машины.

Недостатки:
Шум шипов, который является неотъемлемым спутником данного вида шин. Ещё говорят, что жесткая резина, но с моей мягкой подвеской и высоким профилем этого не заметно.
Ах, да, снежная каша при колейности на трассе — это настоящая боль… вот только пока не встречал зимних шин, которые в таких условиях ведут себя хорошо.

Комментарий:
Отзыв о размерности 205/65 R15 на автомобиле Renault Fluence.
Раньше ездил на липучках Bridgestone Blizzak VRX — они чуть лучше вели себя по колее и в снежной каше, но корка льда ставила их в один ряд с самыми бюджетными шиповками.

suleymanov rust, 21.02.2019

Достоинства:
крепкая и надежная покрышка, сцепление, бренд

Недостатки:
шум как от любой шипованной резины

Комментарий:
Шины протестил как на московских улицах, на которых в принципе все достаточно прилично, и на подмосковном месиве. Парковка около дома с толщиной снега в полметра, дороги с приличным слоем льда — резина взяла все. Отдельно отмечу, что протектор хорошо очищается, ничего туда не забивается. Шипы не вылетают вообще, что для меня — прям показатель!Хотя резину не жалел вот вообще, практически с первого дня пользования уже гонял по 140 на трассе. Модель рекомендую.

Игорь, 07.02.2019

Достоинства:
Поставил в ноябре 2018 года новую резину на РАВ 4 (поменял машину весной 2018 года). Использовал как на сухом асфальте осенью, так и по заснеженным дорогам в новогодние праздники за городом. Очень понравилась управляемость. Дорогу держит хорошо. При прохождении снежной каши из полосы в полосу — проблем нет. Также понравилась самоочистка резины от снега. Как следствие видимо, очень хорошо также ведет себя по нечищеной дороге (на даче не чистили дорогу все праздники). Очень хорошо гребет. В горку и по обледеневшей колее трогается без проблем (не сносит).

Недостатки:
Немного шумновата оказалась на обкатке (до этого использовал резину Continental ContiContact 2). Но хочу также заметить, что после обкатки стала тише.

Комментарий:
Лично мне очень понравилась резина. Честно до этого никогда не покупал Bridgestone. Но теперь также честно могу посоветовать и знакомым, и друзьям.

Никита, 02.02.2019

Достоинства:
Цена, прочность, очень цепкая, на льду, снегу и асфальте в поворотах не сносит.

Недостатки:
Начали выпадать шипы

Комментарий:
Купил данные шины в конце августа 2018 года, производства Япония 2016 год. В течении 700км обкатывал эти шины, резко не тормозил, не разгонялся и не больше 80км/ч. На данный момент на этих шинах пробег около 2ткм. Был недавно в сервисе и когда машину подняли на подьемнике, то увидел что на переднем левом колесе отсутствует 3 шипа, рядом с друг другом. Или это брак или такие нынче шины галимые.

До этого с 12 по 17 год ездил на бричстоун айс крузер 7000, не обкатывал их даже тогда, первый шип выпал через 3 сезона. Вот такие дела, очень обидно.

 

Вячеслав, 02.02.2019

Достоинства:
Купил себе на Субару 225 55 17. Очень доволен. Машина опять позволяет ехать по диагонали на дороге 🙂
Отличная управляемость, на любом покрытии. Ради интереса оттормаживаюсь в деревне на подтаявшем и потом подмерзшем снегу — отлично. Тут был снегопад ночной на днях — тоже великолепно гребёт по каше.
Минус один — звук! Я бы даже сказал стабильный вой как у турбины 🙂
Лично мне не мешает. Но слышно очень хорошо

Комментарий:
Прошел в Москве снегопад.
Мнение не изменилось. Шуметь стало меньше. Может привык 🙂
Отличная резина. Из сугробов выезжаем ходом.
Правда — у меня все таки полноприводник.

Wheeler Flex, 28.01.2019

Достоинства:
норм цена, легко найти в продаже, на снегу и льду безупречно едут

Недостатки:
шина не для асфальта, что очевидно, но на всякий напишу еще раз, что тормозной путь будет длиннее

Комментарий:
Если ищете хорошую шипованную резину, это точно к бриджам. Имхо, они лидеры рынка в этом плане. А конкретно эта модель радует соотношением цена-качество, плюс найти ее в продаже не так сложно. Советую всем, кому приходится ездить по нерасчищенным дорогам, ледяным дорожкам и прочему беспределу)) Для голого асфальта и чисто городской езды я бы все-таки взял липучки — эти тормозят на асфальте похуже, да и не продуманы для таких моментов.

Фирсов Александр, 24.01.2019

Достоинства:
Не стоит она своих денег.

Недостатки:
Сильный гул. После обкатки 500км шума меньше. Длинный тормозной путь с 60км метров 40.

Комментарий:
Итак откатал на ней зиму. По пробегу 3500км, вылетило 3 шипа с переди, сзади все на месте. Ездил акуратно. Итог я бы не стал ее рекомендовать. Не стоит она своих денег. Из ценового сигмента Нокия Хака8 будет получше! Думаю продам её. Машина сивик 5d

Ljhjujq Владимир, 14.01.2019

Достоинства:
рекомендовали люди, чьему мнению я доверяю. неровную дорогу берут отлично, рисунок остается чистым

Недостатки:
да как-то и сказать нечего

Комментарий:
Сомневался немного при покупке, потому что не люблю переплачивать за бренд, но мужики в салоне меня убедили — показали личные тачки с такой же резиной. Раз сами на ней ездят и рекомендуют, значит точно не фигня)) Пока особо не тестил на льду-снегу, но грунт берут отлично. На асфальте немного шумные, но у брата стоят шипованные nokian, и от них шума так-то побольше. Так что все познается в сравнении.

елсакова юлия, 12.01.2019

Достоинства:
мне очень нравится все))) особенно то, что уверенно себя ведет на льду!

Недостатки:
непривычно было в начале, когда казалось немного жесткой. видела, многие тоже это заметили. но потом становится по мягче.

Комментарий:
Абсолютно заслуживает всех 5, цена вполне досягаемая, износа за первый сезон не заметила, на льду ведет себя вполне уверенно. Пока что лучшая резина из всех, что я пробовала, по совокупности всех параметров))

Юсупов Алексей, 02.01.2019

Достоинства:
Итак по порядку. Автомашина у меня ВАЗ2114. Шины поставил 20.09.2017 то есть некоторое время ездил по асфальту при температуре около нуля градусов. На момент написания отзыва проехал около 9000 км (работа водитель на своей машине и подработка в такси). Из положительного действительно очень хорошо держится на льду, особенно порадовал старт в горку по льду.Отлично держат снег под которым лёд. Не забиваются снегом и камушками. Аквапланирование как на летних ( летняя резина формула не помню точнее какая именно, но одна из самых дешёвых), поэтому на скорости в глубокую лужу лезть не рекомендую, но для зимы все отлично.

Недостатки:
К минусам можно безусловно отнести шумность. При условии того что у меня четырка и антишумкой я ее не проходил, гул от шипов особенно на асфальте как в городе так и на трассе глушит не только все посторонние шумы улицы, но и шумы работающей машины, шумы от разговора в салоне и от магнитолы тоже гул резины глушит. 🙂 Но гул от шипов при езде это ерунда и мелочь. Самая проблема при езде на сухом асфальте, особенно при не груженной авто. При пустой машине на сухом асфальте в повороте как корова на льду, видимо шипами за асфальт трудно цепляться.

Комментарий:
В целом все таки рекомендую. На момент написания отзыва все шипы ещё на месте.

Tourer_V, 31.12.2018

Достоинства:
Лучшая резина! Хорошее сцепление с любой поверхность.

Недостатки:
Слегка шумновата, но это не страшно. Музычку погромче и все отлично.:).

Комментарий:
Езжу на Mark 2, 1JZ-GTE, стиль вождения — в меру агрессивный, люблю в повороты входить боком (когда никого нет на горизонте). В общем, за зиму вылетело по 1-му шипу с колеса… Сказать что удивлен — ничего не сказать! До этого были Nordman 5, за первый же сезон -50 — 60% шипов. Хотя обкатывал аккуратно около 1000 км. Так что если хотите качественную, надежную резину, на которой и в сугроб и в гололед и в лужу, то это лучший вариант. Как и писали многие — соотношение цены и качества на высоте!

Дорошев Виктор, 23.12.2018

Достоинства:
по бокам плотная, сама покрышка видится надежной

Недостатки:
цена не самая маленькая, но за бренд можно и доплатить

Комментарий:
Взял Spike 02 по настойчивому совету друга (Васян, привет!), он на ней уже второй год и очень хвалит. У меня это первый бридж, поэтому с другими моделями марки сравнить не могу. Шина достаточно твердая, упругая, видно что плотные бока. Часто езжу по гравию в гараж, поэтому жесткость для меня плюс. Шума особенного не отметил, шипы как шипы.

Руслан Паничкин, 08.12.2018

Достоинства:
Управляемость.

Недостатки:
Очень-очень сильный шум и гул свыше 60 километров час. Если вы ездите по трассе то никому не советую.

Комментарий:
Понравилось только одно то что машина не гуляет по трассе. Хорошо себя ведёт по снегу и по льду.

Едемский Янис, 05.12.2018

Комментарий:
Выбрал в этом году Spike-02 по отзывам знакомых — их советовало несколько авторитетных для меня водителей. Не пожалел абсолютно, стоят своих денег. Особенно заценил на грунте — сцепление гуд, и протекторы остаются чистыми.

Сергей, 26.11.2018

Достоинства:
Неплохо гребет по глубокому снегу. Прочная, в ямы влетать не страшно.

Недостатки:
Торможение в пол непредсказуемое. При работе АБС на скользком покрытии резина катится и катится. Раньше был Cordiant, так он предсказуемее себя вел.
Через 3500 км заметил отсутствие нескольких шипов на ведущих колесах, а у многих других шипов сердечник сместился к краю. Наверное скоро еще куча шипов вылетит.

Комментарий:
Не ожидал такого от Бриджа. Специально брал его, исходя из отзывов, думал made in japan. У меня шипы в 1-й год еще никогда не выпадали. Не стоит своих денег и проигрывает некоторым брендам 2 линии.

Привалов Алексей, 08.11.2018

Достоинства:
Шипы все на месте после сезона агрессивной езды. Жесткая шина, для меня это плюс. Безопасность.

Недостатки:
Да пока все ок)

Комментарий:
Зачетная резина. Прошлую зиму на ней откатал, износа ноль! Шип не выпал, кажется, ни один. Да, твердовата, но лично мне так нравится больше, и сознательно мягкие не хотел брать. По поводу сцепления скажу так — раза три попадал в почти аварийные ситуации, когда на льду спасли только шипы. Видел, как передо мной улетали в отбойник( Так что ставлю плюсы японцам за безопасность и износостойкость.

Павел, 31. 10.2018

Достоинства:
Отличная управляемость почти на всех видах покрытия!

Недостатки:
Немного плавает в снежной каше

Комментарий:
По снегу гребет просто ОТЛИЧНО!

Дмитрий Сергеевич, 29.10.2018

Достоинства:
Крепкая

Недостатки:
Что по льду что по снегу во дворе на ней вообще не выехать, очень разачарован.

Комментарий:
На лето адреналин 3 езжу хорошая резина, на зиму решил взять тоже бридж понял что зря, резина на льду только буксует не заехать не выехать со двора да и везде кроме трассы, на трассе ведёт себя хорошо.

Гость, 22. 07.2018

Достоинства:
Отличная, крепкая, износостойкая резина.

Недостатки:
Их нету

Комментарий:
Использовал с октября по май в г. Магадане, размер 195/65 R 15. Сегодня при смене на лето, посмотрел все ли шипы на месте, оказалось что ни один шип не вылетел! Обкатал как и положено первые 500 км. В общем рекомендую эти шины.

Пирязев Евгений, 21.04.2018

Достоинства:
очищается протектор, жесткая и плотненькая покрышка

Недостатки:
все окей!

Комментарий:
Вообще как по мне, в плане шин азиатам нет равных. До этого катал на бриджах, потом по работе дали гольф с небезызвестными финскими покрышками — ну вот не мое, и все. В этом году раскошелился и взял опять BS на свои личные. Ход совсем другой, плюс заметно когда паркуешься на грунте (у меня около дома как раз так) — протектор не забит, сцепление с поверхностью гораздо лучше

Харитонов Сергей, 23.03.2018

Достоинства:
отличное качество резины, покрышка сделана не абы как.

Недостатки:
может чуть, подкорректировал бы момент с заносами на «каше»

Комментарий:
это магия какая-то, но за всю прошлую зиму моя резина лишилась всего 2-х шипов. Как раз в выходные поехал переобуваться (я слоупок, да) и спецом пересчитал. Вот это качество, я понимаю! Прошлые мои Michelin, как помню, в первый сезон потеряли процентов так 20, мне еще все говорили мол это нормально. Нет, ребята, нормально — это как у Бриджей. Плюсы почти за всё по максимуму, сбавил балл только за сцепление на каше, как мне показалось, покрышки не так устойчивы на ней, как на крепком снегу.

Сергей, 08.02.2018

Достоинства:
Реально гребет, на Барминской горе специально останавливался несколько раз.Что бы с места в гору тронуться и подняться. По сугробам Пробовал. По работе в области часто бываю по селам без проблем на ней. Авто 2114. 4 нордман был до спайк 2, это просто подошва от батинка…

Недостатки:
Шум

Комментарий:
Перечитал массу информации по разной резине, выбор пал на неё. Не жалею. Надеюсь,кому то будет полезным, этот отзыв. Накатал 5000 за пару месяцев. 5 из 5 балоб

Юрий, 07. 02.2018

Достоинства:
Шины-огонь.Управляемость отличная.Сцепление и управляемость на 5+ как по снежной каше, так и в гололед. При разгоне от 50км/ч шум как в самолете).Однозначно рекомендую.

Недостатки:
Шумная

Дмитрий, 06.02.2018

Достоинства:
Эксплуатирую на ларгусе.Прочная,шипы после года эксплуатации и 15000 пробега не выскочили. Ни один! По гладкой наледи на дороге идёт нормально.

Недостатки:
Если на дороге даже небольшая каша из снега — это страшно! Тормозов нет совсем, и рулишь как на катере. Нет управления. Нордман 4 был лучше! Несколько раз чудом дтп избежал, когда идущая впереди машина тормозит, а я при хорошей дистанции не успеваю замедлить свой автомобиль. Он просто плывёт. Приходилось на обочину уходить. Езжу я аккуратно, стаж 20 лет.

Шипы преткновения — Авторевю

На новых шинах Bridgestone Spike-02 я поездил еще в начале этого года на презентации в Подмосковье — и удивился: вместо разрешенных по регламенту 1,2 мм шипы выступали из протектора на добрые два миллиметра! Поэтому, дождавшись появления этих покрышек в магазинах, мы испытали их на полигоне и… У них по-прежнему 2 мм! Но — после обкатки.

В Японии, как известно, шипы запрещены. Поэтому шинники из Страны восходящего солнца могут заниматься доводкой шипованных покрышек лишь на закрытых полигонах или в других странах. Да и приоритеты у компании иные: главное — обеспечить зимними шинами внутренний рынок, на котором Bridgestone лидирует. А еще это очень консервативная компания: все должно быть тридцать раз проверено и утверждено руководством.

Поэтому японцы долго не использовали фигурные шипы, применяемые в Европе. Сперва они сделали шины Ice Cruiser 7000 c насечками в круглом корпусе шипа, затем — Blizzak Spike-01 с крестообразной выборкой на твердосплавной вставке. А полноценные фигурные шипы производства немецкой компании Sitek появились лишь сейчас в шинах Blizzak Spike-02. «Прямоугольный» корпус, вытянутый фланец, а главное — широкая твердосплавная вставка. Как уверяют инженеры, потери шипов такой конструкции на 15 процентов ниже, чем у покрышек предыдущего поколения Blizzak Spike-01. ­А износостойкость протектора аж на 60 процентов выше.

Шип, извлеченный из шины Bridgestone Blizzak Spike-02 (на фото справа) заметно крупнее шипа из покрышки Nokian Hakkapeliitta 8. Но финны берут количеством: используют 190 шипов против 115 (в шинах размерности 205/55 R16)

Но основное отличие — в сцепных свойствах на льду. Они выросли настолько, что организаторы февральской презентации отважились на публичное сравнение новых шин с победителями наших тестов — покрышками Nokian Hakkapeliitta 8. Однако корректного теста тогда не вышло: потеплело, лед растаял… Зато когда я по привычке измерил выступание шипов у японских шин, удивился: вместо положенных по регламенту 1,2—1,5 мм, как у Хаккапелиитты, они торчали на 1,8—2,0 мм!

Так выглядят обкатанные шины, у которых вылет шипов, то есть их выступание над поверхностью протектора, составляет 1,8—2,0 мм против первоначальных 1,5 мм

Неужели японцы привезли для российской презентации «спецпродукт», чтобы пустить пыль в глаза журналистам? Однако организаторы недоуменно развели руками: дескать, покрышки товарные и соответствуют регламенту Таможенного союза.

Полная версия доступна только подписчикамПодпишитесь прямо сейчас

я уже подписан

Отзывы о зимних шинах Bridgestone Blizzak Spike-02 285/50 R20 116T

Достоинства:

Абсолютная предсказуемость. Неубиваемость. Отличное ощущение авто.

Недостатки

Кто не любит жесткую резину — да она жесткая и, соответственно, в колее ее кидает (не надо ездить в колее ни на какой резине), аквапланирование выраженное.

Комментарий

Купил после еще французского мишлен х-айс норф 2. Авто Опель Инсигния 249 л.с., полный привод, размер 17″ 245/55. Резина жесткая, не самая комфортная, но абсолютно предсказуемая. Я лично люблю жесткую резину, т.к. и зимой на межгороде езжу под 200. Валкость при резких перестроениях и мягкость отсутствует, в отличие от континенталь айс контакт. Шумность обычная, не скажу, что какая-то особенно сильная, летняя потенза не менее шумная) Относительно предсказуемости, резина не цепляется до последнего, все срывы чувсвствуешь сразу и можешь спокойно парировать, тот же мишлен стоял как влитой до последнего, но если вдруг сорвало, то сорвало, и усилий на парирование уже надо приложить гораздо больше, может стать неприятным сюрпризом. С бриджем же сразу понятно, что начинаешь выходить на критический режим и чего ожидать дальше. При перестроениях никакой валкости, как на лете. Колею не любит, т.к. жесткая боковина. Воду не любит, всплывает, мишлену было пофиг на воду и относительно пофиг на колею, хотя тоже боковины были не самые мягкие. Гребет отлично, ямы пофиг, чувствуешь себя как на тракторе, в связи с этим замял порог об жесткий снег. В целом, резина отличная, но французский мишка, наверное, был чуть поприятнее, если я не загонял авто в сомнительный режим, то рулежка с ним на высоких скоростях была менее напряжной. Могу сравнить еще с континенталь айс контакт, стоит на бмв дизель 177 л.с. ПП — он более городской, комфортный, мягкий, но валкий, перестраиваться на 150 — машину болтает, боковина очень нежная, тонкая и мягкая, но сплкойна к колее и более спокойна к воде. Вобщем женский вариант для города)

Шины Bridgestone Blizzak Spike-02 205/55 R16 91T шип. в Набережных Челнах

Достоинства:
Абсолютная предсказуемость. Неубиваемость. Отличное ощущение авто.
Недостатки:
Кто не любит жесткую резину — да она жесткая и, соответственно, в колее ее кидает (не надо ездить в колее ни на какой резине), аквапланирование выраженное.
Комментарий:
Купил после еще французского мишлен х-айс норф 2. Авто Опель Инсигния 249 л.с., полный привод, размер 17″ 245/55. Резина жесткая, не самая комфортная, но абсолютно предсказуемая. Я лично люблю жесткую резину, т.к. и зимой на межгороде езжу под 200. Валкость при резких перестроениях и мягкость отсутствует, в отличие от континенталь айс контакт. Шумность обычная, не скажу, что какая-то особенно сильная, летняя потенза не менее шумная) Относительно предсказуемости, резина не цепляется до последнего, все срывы чувсвствуешь сразу и можешь спокойно парировать, тот же мишлен стоял как влитой до последнего, но если вдруг сорвало, то сорвало, и усилий на парирование уже надо приложить гораздо больше, может стать неприятным сюрпризом. С бриджем же сразу понятно, что начинаешь выходить на критический режим и чего ожидать дальше. При перестроениях никакой валкости, как на лете. Колею не любит, т.к. жесткая боковина. Воду не любит, всплывает, мишлену было пофиг на воду и относительно пофиг на колею, хотя тоже боковины были не самые мягкие. Гребет отлично, ямы пофиг, чувствуешь себя как на тракторе, в связи с этим замял порог об жесткий снег. В целом, резина отличная, но французский мишка, наверное, был чуть поприятнее, если я не загонял авто в сомнительный режим, то рулежка с ним на высоких скоростях была менее напряжной. Могу сравнить еще с континенталь айс контакт, стоит на бмв дизель 177 л.с. ПП — он более городской, комфортный, мягкий, но валкий, перестраиваться на 150 — машину болтает, боковина очень нежная, тонкая и мягкая, но сплкойна к колее и более спокойна к воде. Вобщем женский вариант для города)

Шины Bridgestone Blizzak SPIKE-02 255/55 R19 111T

Обращаем Ваше внимание, что товар перемещается в пункт выдачи после оформления заказа.
Так же возможна экспресс доставка, подробности уточняйте у менеджеров.

Пункт выдачи	Режим работы	Можно забрать
ул. Седова, 18 (центральный склад)	09:00 — 21:00	завтра (18.07, воскресенье)
Выборгское шоссе, 212Д	10:00 — 20:00	завтра (18.07, воскресенье)
Петровская коса, 3Д	10:00 — 20:00	завтра (18.07, воскресенье)
ул. Уральская, 8	10:00 — 20:00	завтра (18.07, воскресенье)
ул. Парашютная, 24А	10:00 — 20:00	завтра (18.07, воскресенье)
ул. Кубинская, 4	09:00 — 21:00	завтра (18.07, воскресенье)
Приморский пр-т., 26	10:00 — 20:00	завтра (18.07, воскресенье)
Лахтинский пр., 2 к.1	09:00 — 21:00	завтра (18.07, воскресенье)
ул. Рощинская, 48 (Витебский пр., 9Б)	10:00 — 21:00	завтра (18.07, воскресенье)
Пулковское ш., 19А	Круглосуточно	завтра (18.07, воскресенье)
пр. Сизова, 2	Круглосуточно	завтра (18.07, воскресенье)
пр. Просвещения, 74 к. 2 лит. А	Круглосуточно	завтра (18.07, воскресенье)
Зеленогорск, пр. Ленина, д. 88	Круглосуточно	завтра (18.07, воскресенье)
Сестрорецк, Приморское шоссе, 260Н	09:00 — 23:00	завтра (18.07, воскресенье)
Кудрово, ул. Центральная, 35Н	09:00 — 23:00	завтра (18.07, воскресенье)
ул. Васенко, 12	Круглосуточно	завтра (18.07, воскресенье)
ул. Карбышева, 9Б	Круглосуточно	завтра (18.07, воскресенье)
пр. Юрия Гагарина, 2А	10:00 — 21:00	завтра (18.07, воскресенье)
Комендантский пр-т, 44 к2	09:00 — 21:00	завтра (18.07, воскресенье)

Отчетливые конформационные состояния спайкового белка SARS-CoV-2

Динамический вирусный спайк

Усилия по защите человеческих клеток от тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), были сосредоточены на тримерном спайковом (S) белке. Несколько структур показали стабилизированный эктодомен шипа в его префузионной конформации. Cai et al. теперь дает представление о структурных изменениях в S-белке, которые приводят к слиянию мембран вируса и клетки-хозяина.Они очистили полноразмерный S-белок и определили с помощью криоэлектронной микроскопии структуры как до, так и после слияния. Эти структуры дополняют наше понимание функции S-белка и могут использоваться при разработке вакцины.

Наука , этот выпуск стр. 1586

Abstract

Срочно необходимы стратегии вмешательства для борьбы с пандемией тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2 (SARS-CoV-2). Белок тримерного вирусного шипа (S) катализирует слияние между вирусной и клеточной мембранами-мишенями, чтобы инициировать инфекцию.Здесь мы сообщаем о двух структурах для криоэлектронной микроскопии, полученных из препарата полноразмерного S-белка, представляющих его префузионные (разрешение 2,9 ангстрем) и пост-слияние (разрешение 3,0 ангстрем) конформации, соответственно. Спонтанный переход в состояние после слияния не зависит от клеток-мишеней. Тример до слияния имеет три рецептор-связывающих домена, зажатых сегментом, примыкающим к слитому пептиду. Постфузионная структура стратегически украшена N-связанными гликанами, что указывает на возможную защитную роль против иммунных ответов хозяина и суровых внешних условий.Эти результаты улучшают наше понимание проникновения SARS-CoV-2 и могут направлять разработку вакцин и терапевтических средств.

Текущая пандемия коронавируса имеет разрушительные социальные и экономические последствия. Коронавирусы (CoV) представляют собой оболочечные вирусы с положительной цепью РНК. К ним относятся тяжелый острый респираторный синдром (SARS) и ближневосточный респираторный синдром (MERS), оба из которых были связаны со значительными летальными исходами ( 1 — 3 ), а также несколько эндемичных вирусов простуды ( 4 ). ).При большом количестве подобных вирусов, циркулирующих среди летучих мышей и верблюдов ( 5 — 8 ), возможность дополнительных вспышек представляет собой серьезную угрозу для здоровья населения во всем мире. Текущее заболевание, коронавирусное заболевание 2019 (COVID-19), которое вызывается новым вирусом SARS-CoV-2 ( 9 ), создало срочные потребности в диагностике, терапии и вакцинах. Удовлетворение этих потребностей требует глубокого понимания взаимосвязи структура-функция вирусных белков и соответствующих факторов хозяина.

Для всех вирусов в оболочке слияние мембран является ключевым ранним шагом для проникновения в клетки-хозяева и установления инфекции ( 10 ). Хотя это энергетически выгодный процесс, слияние мембран имеет высокие кинетические барьеры, когда две мембраны сближаются, в основном из-за сил отталкивания гидратации ( 11 , 12 ). Для слияния вирусных мембран свободная энергия для преодоления этих кинетических барьеров возникает в результате рефолдинга кодируемых вирусом слитых белков из праймированного, метастабильного конформационного состояния до слияния в стабильное состояние после слияния ( 13 — 15 ).Слитый белок для CoV — это его шипованный (S) белок, который украшает поверхность вириона в виде обширной короны (отсюда «корона»). Белок также вызывает нейтрализующие реакции антител и, следовательно, является важной мишенью для разработки вакцины ( 16 ). Белок S представляет собой сильно гликозилированный мембранный белок типа I, закрепленный в вирусной мембране. Сначала он продуцируется как предшественник, который тримеризируется и, как полагают, расщепляется фурин-подобной протеазой на два фрагмента: рецептор-связывающий фрагмент S1 и слитый фрагмент S2 (рис.1А) ( 17 ). Связывание через рецептор-связывающий домен (RBD) в S1 с рецептором клетки-хозяина [ангиотензин-превращающий фермент 2 (ACE2) как для SARS-CoV, так и для SARS-CoV-2] и дальнейшее протеолитическое расщепление на втором сайте в S2 ( S2 ‘) сериновой протеазой, трансмембранной сериновой протеазой 2 (TMPRSS2) ( 18 ) или эндосомными цистеиновыми протеазами, катепсинами B и L (CatB / L), которые, как полагают, запускают диссоциацию S1 и необратимую рефолдинг S2 в постфузионная конформация, тримерная шпилька, образованная гептадным повтором 1 (HR1) и гептадным повтором 2 (HR2) ( 19 , 20 ).Эти большие структурные перестройки объединяют вирусные и клеточные мембраны, в конечном итоге приводя к слиянию двух бислоев.

Рис. 1. Приготовление полноразмерного спайкового белка SARS-CoV-2.

( A ) Схематическое изображение конструкции экспрессии полноразмерного белка SARS-CoV-2 S. Сегменты S1 и S2 включают NTD, RBD, CTD1, CTD2, S1 / S2, S2 ‘, FP, FPPR, HR1, CH, CD, HR2, TM, CT и древовидные символы для гликанов. Стреп-метку сливали с С-концом S-белка гибким линкером.( B ) Очищенный белок S разделяли гель-фильтрационной хроматографией на колонке Superose 6 в присутствии NP-40. Стандарты молекулярной массы включают тиоглобулин (670 кДа), гамма-глобулин (158 кДа) и овальбумин (44 кДа). Три основных пика (пики I, II и III) содержат белок S. ( C ) Образец нагрузки и фракции пиков из (B) анализировали с помощью SDS-PAGE, окрашенного кумасси синим. Меченые полосы были подтверждены вестерн-блоттингом (S, S1 и S2) или секвенированием белков (S2 и Cont; полосы S и S1 не дали каких-либо значимых результатов, вероятно, из-за заблокированного N-конца).Cont, совместно очищенный загрязняющий белок, идентифицированный как предшественник BiP шаперона эндоплазматического ретикулума путем N-концевого секвенирования. * Предполагаемый фрагмент S1 / S2-S2 ‘. Также показаны репрезентативные изображения и двумерные средние значения трех фракций пиков, полученные с помощью EM отрицательного окрашивания. Размер ящика двумерных средних составляет ~ 510 Å.

С тех пор, как была выпущена первая последовательность генома SARS-CoV-2 ( 21 ), сообщалось о нескольких структурах для S-белковых комплексов, включая эктодомен, стабилизированный в конформации до слияния ( 22 — 24 ) и RBD -Комплексы АСЕ2 ( 25 — 28 ) (рис.S1), опираясь на предыдущий успех структурной биологии белков S из других CoV ( 20 ). В стабилизированном S-эктодомене S1 складывается в четыре домена, N-концевой домен (NTD), RBD и два C-концевых домена (CTD), и защищает префузионную конформацию S2, в которой HR1 отклоняется назад к вирусной мембране. (рис. S1, A и B). RBD выбирает две различные конформации: «вверх» представляет состояние, доступное для рецептора, а «вниз» — состояние, недоступное для рецептора.Структуры, представляющие состояние после слияния S2 из вируса гепатита мышей (MHV) (рис. S1E), и структуры с более низким разрешением из SARS-CoV (рис. S1F) предполагают, как структурные перестройки S2 протекают, чтобы способствовать слиянию мембран и проникновению вируса ( 29 , 30 ). Сравнение состояний до и после слияния показывает, что HR1 претерпевает переход «складной нож», который может вставлять слитый пептид (FP) в мембрану клетки-мишени. При сворачивании HR2 FP и трансмембранные (TM) сегменты располагаются на одном конце молекулы, заставляя мембраны, с которыми они взаимодействуют, изгибаться друг к другу, эффективно приводя к слиянию мембран.В предыдущих структурах области около вирусной мембраны либо не присутствовали, либо были неупорядоченными, но все они, по-видимому, играли критические структурные и функциональные роли ( 31 — 35 ).

Чтобы получить более глубокое понимание, мы стремились определить состояния до и после слияния полноразмерного белка S дикого типа SARS-CoV-2.

Результаты

Очистка интактного S-белка

Для получения функционального S-белка SARS-CoV-2 мы трансфицировали клетки 293 эмбриональной почки человека (HEK) экспрессионной конструкцией с полноразмерной S-последовательностью дикого типа с С-концевой Strep-tag (рис.1А). Эти клетки эффективно сливались с клетками, трансфицированными интактной конструкцией ACE2 человека, даже без добавления каких-либо дополнительных протеаз (рис. S2), что позволяет предположить, что S-белок, экспрессируемый на поверхности клеток, полностью функционален для слияния мембран. С-концевой Strep-tag не влиял на эффективность слияния. Чтобы очистить полноразмерный S-белок, мы лизировали клетки и солюбилизировали все мембраносвязанные белки в 1% детергенте NP-40. Затем меченый Strep S-белок был захвачен на смоле Strep-tactin в 0.3% НП-40. Очищенный белок S элюируется из колонки для исключения размера в виде трех отдельных пиков в 0,02% NP-40 (фиг. 1B). Анализ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, окрашенным кумасси синим (SDS-PAGE) (рис. 1C), показал, что пик 1 содержит как нерасщепленный предшественник S, так и расщепленный комплекс S1 / S2; пик 2 имел в основном расщепленный, но диссоциированный фрагмент S2; и пик 3 включал в основном диссоциированный фрагмент S1, что было оценено с помощью N-концевого секвенирования и вестерн-блоттинга (фиг. S3).Это было подтверждено с помощью электронной микроскопии (ЭМ) с отрицательным окрашиванием (рис. 1С). Пик 1 показал самое сильное связывание с растворимым ACE2, сравнимое с таковым для очищенного растворимого тримерного S-эктодомена, а пик 2 показал самое слабое связывание, поскольку он содержал в основном фрагмент S2 (фиг. S4). Хотя расщепление по сайту S1 / S2 (фурин) было четко продемонстрировано секвенированием белка N-конца фрагмента S2 в пике 2, расщепление по сайту S2 ‘не было очевидным. В некоторых препаратах мы наблюдали полосу около 20 кДа, размер, ожидаемый для фрагмента S1 / S2-S2 ‘(рис.1С). Мы получили аналогичный профиль гель-фильтрации, когда другой детергент (додецилмальтозид) был использован для солюбилизации S-белка (рис. S5), предполагая, что диссоциация S-белка во время гель-фильтрационной хроматографии не запускается каким-либо конкретным детергентом. Мы также идентифицировали основной загрязняющий белок в препарате как предшественник шаперон-связывающего белка (BiP) эндоплазматического ретикулума ( 36 ), который может играть роль в облегчении укладки S-белка.

Определение структуры Крио-ЭМ

Крио-ЭМ изображения были получены с выбранными сетками, полученными из всех трех пиков на электронном микроскопе Titan Krios, работающем при 300 кэВ и оборудованном энергетическим фильтром BioQuantum и детектором прямых электронов Gatan K3.RELION ( 37 ) использовался для отбора частиц, двумерной (2D) классификации, трехмерной классификации и уточнения. Определение структуры выполнялось с помощью этапов трехмерной классификации, уточнения и скрытого местного уточнения, как описано в дополнительных материалах. Конечное разрешение составляло 2,9 Å для белка S перед слиянием и 3,0 Å для белка S2 в конформации после слияния (фиг. S6 – S9).

Структура тримера S до слияния

Общая архитектура полноразмерного S-белка в конформации до слияния была очень похожа на опубликованные структуры растворимого S-тримера, стабилизированного С-концевой меткой тримеризации фолдона и двумя заменами пролина при граница между HR1 и центральной спиралью (CH) в S2 (рис.S1) ( 22 , 23 ). В нашей новой структуре упорядочены N-конец, несколько периферических петель и гликаны, которые были невидимы в структурах растворимых тримеров (рис. 2, A и B, и рис. S10A). Как описано ранее, четыре домена фрагмента S1, NTD, RBD, CTD1 и CTD2, охватывают тройную ось, покрывая фрагмент S2 внизу. Сайт расщепления фурина на границе S1 / S2 находится в открытой и неупорядоченной петле (рис. 2В), поэтому неясно, представляет ли эта структура нерасщепленный или расщепленный тример, хотя образец явно содержит обе формы (рис.1С). Точно так же фрагмент S2 имеет конформацию, почти идентичную конформации в предыдущих структурах тримеров, при этом большая часть полипептидной цепи упакована вокруг центральной трехцепочечной спиральной спирали, образованной СН, включая коннекторный домен (CD), который связывает СН и C-концевой HR2 через дополнительную линкерную область. Различие между нашей структурой и опубликованными структурами тримеров состоит в том, что сегмент из 25 остатков в S2 сразу после гибридного пептида упорядочен. Сегменты HR2, TM и CT, которые не наблюдались в предыдущих структурах, все еще не видны.

Рис. 2 Крио-ЭМ-структура белка SARS-CoV-2 S в конформации до слияния.

( A ) Структура тримера S моделировалась на основе карты плотности 2,9 Å. Три протомера (A, B и C) окрашены в зеленый, синий и красный цвета соответственно. ( B ) Общая структура белка S в конформации до слияния показана в виде ленты. Различные структурные компоненты в цветовой схеме, показанной на рис. 1A, включают NTD, RBD, CTD1, CTD2, FP, FPPR, HR1, CH и CD.Указаны N-конец, сайт расщепления S1 / S2 и сайт расщепления S2 ‘.

Наша структура отличается от ранее описанных конформаций перед сваркой по ряду функций. Во-первых, N-конец в нашей структуре упорядочен и принимает конформацию, аналогичную конформации SARS-CoV, включая дисульфидную связь (Cys ¹⁵ –Cys ¹³⁶ ) и N-связанный гликан в Asn ¹⁷ (рис. . 3А) ( 38 ). Будет важно подтвердить, разворачивается ли эта область без дисульфидной связи в стабилизированных растворимых конструкциях или она сложена и просто плохо определяется по плотности, несмотря на дисульфидную связь, особенно если эти конструкции широко используются для исследований вакцин.

Рис. 3 Избранные новые особенности тримера SARS-CoV-2 перед слиянием.

( A ) N-концевой сегмент белка S. N-конец находится у остатка Gln ¹⁴ после отщепления сигнального пептида. Cys ¹⁵ образует дисульфидную связь с Cys ¹³⁶ . Мы наблюдали хорошую плотность для N-связанного гликана в Asn ¹⁷ . ( B ) Сегмент непосредственно ниже слитого пептида, обозначенный как FPPR, хотя и неупорядочен в структуре стабилизированного растворимого тримерного S-эктодомена, образует плотно упакованную структуру, примыкающую к CTD1.Недавно идентифицированная структура FPPR будет конфликтовать с CTD1 в конформации RBD up. Различные области показаны в цветовой схеме на фиг. 2B. Структура растворимого тримера S с одним RBD в восходящей конформации (ID PDB: 6vyb) показана серым цветом. В рамке показан увеличенный вид FPPR с соседним гибридным пептидом как в виде поверхности, так и в виде палочки. ( C ) Тример S перед слиянием SARS-CoV-2, если смотреть вдоль оси третьего порядка, накладывается на структуру стабилизированного растворимого тримерного S-эктодомена в закрытой конформации со всеми тремя RBD в нисходящей конформации (PDB ID: 6vxx ).Хотя область S2 хорошо выровнена, существует значительный сдвиг (например, ~ 12 Å между двумя остатками Ala ¹²³ ) в S1. ( D ) Влияние мутаций пролина, введенных в остатки 986 и 987, на стабилизацию конформации до слияния. Мутация K986P удаляет солевой мостик между Lys ⁹⁸⁶ одного протомера и либо Asp ⁴²⁷ , либо Asp ⁴²⁸ другого протомера в интерфейсе тримера.

Во-вторых, другой дисульфидсодержащий сегмент (остатки с 828 по 853) непосредственно после гибридного пептида также отсутствует в структурах растворимого эктодомена, но упорядочен в нашей структуре (рис.3Б). Мы обозначили его как проксимальную область гибридного пептида (FPPR). FPPR неупорядочен как в закрытой, так и в RBD-восходящей конформации стабилизированного растворимого тримера S. В нашей полноразмерной структуре он довольно плотно упаковывается вокруг внутренней дисульфидной связи между Cys ⁸⁴⁰ и Cys ⁸⁵¹ , дополнительно усиленной солевым мостиком между Lys ⁸³⁵ и Asp ⁸⁴⁸ , а также обширным сеть водородных связей. По сравнению с конформацией RBD-вверх путем наложения остальной части S2, FPPR конфликтует с CTD1, который вращается наружу с RBD в переходе с переворачиванием вверх.Таким образом, структурированный FPPR, примыкающий к противоположной стороне CTD1 от RBD, по-видимому, помогает зажать RBD и стабилизировать закрытую конформацию S-тримера. Не очевидно, почему FPPR также не виден в опубликованной закрытой структуре S-эктодомена со всеми тремя RBD в нисходящей конформации ( 23 ). Наша структура полноразмерного S-белка предполагает, что CTD1 является структурным реле между RBD и FPPR, которое может ощущать смещение с обеих сторон. Последний напрямую связан с гибридным пептидом.Отсутствие структурированного FPPR в стабилизированном растворимом тримере S может объяснить, почему в этом препарате легко обнаруживается конформация RBD-up. Кроме того, предполагается, что мутация D614G, которая была идентифицирована в недавних изолятах SARS-CoV-2, приводит к более эффективному проникновению ( 39 , 40 ). D614 образует солевой мостик с K854 в FPPR (рис. S10B), поддерживая функциональную роль FPPR в слиянии мембран. В трехмерной классификации наших частиц до слияния из двух независимых наборов данных наблюдался только один подкласс с перевернутым RBD (рис.S6), предполагая, что конформация RBD-up относительно редко встречается в нашем препарате S полной длины. Карта для этого подкласса была уточнена до 4,7 Å без симметрии C3, и мы не смогли смоделировать FPPR. FPPR упорядочен на всех других картах с разрешением 3,5 Å или выше.

Когда мы выровняли нашу полноразмерную структуру со структурой растворимого тримера S посредством участка S2, три субъединицы S1 в структуре растворимого тримера переместились наружу, от оси третьего порядка, до ~ 12 Å в периферийных областях (рис.3C и рис. S11), предполагая, что полноразмерный тример S более плотно упакован среди трех протомеров, чем мутантный растворимый тример. Исследуя область рядом с мутациями пролина между HR1 и CH, мы обнаружили, что мутация K986P, по-видимому, устраняет солевой мостик между Lys ⁹⁸⁶ в одном протомере и либо Asp ⁴²⁷ , либо Asp ⁴²⁸ в другом протомере; таким образом, мутация может создать чистый заряд (три на один тример) внутри границы раздела тримера. Это может объяснить, почему растворимый тример с мутацией PP имеет более рыхлую структуру, чем полноразмерный S с последовательностью дикого типа.Приводит ли это ослабление к неупорядоченным FPPR в закрытом тримере, потребует дополнительных экспериментальных доказательств. Однако мутации пролина, предназначенные для дестабилизации конформации после слияния и усиления структуры до слияния, также могут влиять на структуру до слияния.

Структура тримеров S2 после слияния

Трехмерная реконструкция образца из пика 2 дала структуру тримеров S2 после слияния, показанную на фиг. 4A. Общая архитектура SARS-CoV-2 S2 в конформации после слияния почти идентична архитектуре опубликованной структуры, полученной из эктодомена S2 MHV, продуцируемого в клетках насекомых (рис.S1) ( 29 ). В структуре HR1 и CH образуют необычно длинную центральную трехцепочечную спиральную спираль (~ 180 Å). Коннекторный домен вместе с сегментом (остатки с 718 по 729) во фрагменте S1 / S2-S2 ‘образуют трехцепочечный β-лист, который инвариантен между структурами до и после слияния. В состоянии после слияния остатки с 1127 по 1135 присоединяются к β-листу соединителя, расширяя его на четыре нити, одновременно проецируя C-концевой HR2 к вирусной мембране. Другой сегмент (остатки 737-769) во фрагменте S1 / S2-S2 ‘составляет три спиральные области, заблокированные двумя дисульфидными связями, которые упираются в канавку СН-части спиральной спирали, образуя короткую структуру пучка из шести спиралей. (6HB-1 на рис.4Б). Неясно, расщепляется ли сайт S2 ‘, потому что он находится в неупорядоченной области, охватывающей 142 остатка (Рис. 4B), как в структуре MHV S2. Тем не менее, фрагмент S1 / S2-S2 ‘является неотъемлемой частью постфузионной структуры и не диссоциирует независимо от расщепления по сайту S2’. N-концевой участок HR2 имеет спиральную форму с одним витком, а также упирается в канавку спиральной катушки HR1; С-концевой участок HR2 образует более длинную спираль, которая составляет вторую структуру пучка из шести спиралей с остальной частью спиральной спирали HR1 (6HB-2 на рис.4Б). Таким образом, длинная центральная спиральная катушка многократно усилена вдоль своей длинной оси, что делает ее очень жесткой структурой, что видно даже из средних значений частиц класса 2D на крио-ЭМ изображениях (рис. S8).

Рис. 4 Крио-ЭМ-структура SARS-CoV-2 S2 в конформации после слияния.

( A ) Структура тримера S2 моделировалась на основе карты плотности 3,0 Å. Три протомера (A, B и C) окрашены в зеленый, синий и красный цвета соответственно. ( B ) Общая структура тримера S2 в конформации после слияния показана на ленточной диаграмме.Различные структурные компоненты в цветовой схеме, показанной на рис. 1A, включают HR1, CH, CD и HR1. Сайт расщепления S2 ‘находится в неупорядоченной петле между Ile ⁷⁷⁰ и Thr ⁹¹² . Также указаны возможные местоположения конца S2 N (сайт расщепления S1 / S2), FP и FPPR. ( C ) Карта низкого разрешения, показывающая структуру плотности для пяти N-связанных гликанов с почти равным интервалом вдоль длинной оси.

Отличительной особенностью постфузионного S2 является украшение его поверхности N-связанными гликанами (рис.4C), что также видно в средних значениях класса 2D (рис. S8). Пять гликанов при остатках Asn ¹⁰⁹⁸ , Asn ¹¹³⁴ , Asn ¹¹⁵⁸ , Asn ¹¹⁷³ и Asn ¹¹⁹⁴ расположены вдоль длинной оси с постоянным интервалом, и четыре из них выровнены на одной стороне тример. Если эти сайты гликозилирования полностью заняты разветвленными сахарами, то они могут экранировать большую часть поверхностей тримеров S2 после слияния. Подобная картина была недавно описана ( 41 ) для препарата SARS-CoV S2, полученного из растворимой конструкции эктодомена, продуцируемой в клетках насекомых и запускаемой протеолизом и низким pH.Причина этого украшения неясна, учитывая, что постфузионная структура выполнила свою миссию, и ее не нужно скрывать от иммунной системы.

Пик 3 содержит в основном диссоциированный мономерный фрагмент S1, который является самым маленьким (~ 100 кДа) и показывает самый низкий контраст в крио-ЭМ решетках из трех типов частиц, которые мы описываем. Мы выполнили предварительный анализ 3D-реконструкции (рис. S12), дополнительно подтвердив его идентичность.

Обсуждение

Архитектура S-белка на поверхности вириона SARS-CoV-2

Тот факт, что расщепленный комплекс S1 / S2 диссоциирует в отсутствие ACE2 и что фрагмент S2 принимает конформацию после слияния в мягких условиях детергента, предполагает что кинетический барьер для конформационного перехода, относящегося к проникновению вируса, неожиданно низок для этого S-белка.Неясно, связано ли это наблюдение напрямую с эффективным слиянием мембран или инфекцией. Тем не менее, стоит отметить, что тример S2 после слияния не только имеет очень стабильную и жесткую структуру, но также стратегически декорирован N-связанными гликанами вдоль своей длинной оси, как если бы он находился под селективным давлением для функций, отличных от процесса слияния мембран. Хотя некоторые предполагают, что вирусные слитые белки могут дополнительно олигомеризоваться в их постфузионной конформации, чтобы способствовать образованию пор слияния ( 42 ), выступающие поверхностные гликаны SARS-CoV-2 S2 делают этот сценарий маловероятным.Более вероятной является защитная роль, которую может играть постфузионная структура S2, если она также присутствует на поверхности инфекционного и зрелого вириона. Он может вызывать ненейтрализующие реакции антител для уклонения от иммунной системы хозяина, а также может защищать более уязвимые тримеры S1 / S2 перед слиянием в условиях вне хозяина, декорируя вирусную поверхность чередующимися жесткими шипами (рис. 5A). Несколько недавних отчетов предоставили некоторые доказательства, подтверждающие эту возможность.Во-первых, ЭМ-изображения препарата вируса SARS-CoV-2, инактивированного β-пропиолактоном, очищенного градиентом плотности тартрата калия-глицерина, по-видимому, потеряли все субъединицы S1, оставив только постфузионный S2 на поверхности вириона ( 43 ). Аналогичным образом, ЭМ-изображения кандидата в вакцину от вируса SARS-CoV-2 (PiCoVacc), инактивированного β-пропиолактоном, также показали игольчатые шипы на его поверхности ( 44 ). Во-вторых, сообщалось о спонтанном выделении SARS-CoV-2 S1 из псевдовирусов в отсутствие ACE2 ( 39 ).В-третьих, связывающие антитела против S2 легко обнаруживаются у пациентов с COVID-19 ( 45 ), что позволяет предположить, что S2 более подвержен воздействию иммунной системы хозяина, чем указывается незащищенными поверхностями на структурах перед слиянием ( 22 , 23 ) (Рис. 2). Поэтому мы предполагаем, что тримеры S2 после слияния могут выполнять защитную функцию, составляя часть короны на поверхности зрелого и инфекционного вириона SARS-CoV-2 (рис. 5). Спайки S2 после слияния, вероятно, образуются после спонтанной диссоциации S1 независимо от клеток-мишеней.

Рис. 5 Модель структурных перестроек белка SARS-Cov-2 S.

( A ) Структурные изменения не зависят от целевой клетки. Мы предполагаем, что на поверхности зрелого вириона присутствуют пики как до, так и после слияния, и соотношение между ними может варьироваться. Показана диаграмма вириона. Пики после слияния на вирионе образуются S2 после диссоциации S1 в отсутствие ACE2. ( B ) ACE2-зависимые структурные перестройки.Структурный переход от конформации до слияния к конформации после слияния, вызывающий слияние мембран, вероятно, происходит поэтапно следующим образом. Во-первых, FPPR зажимает RBD через CTD1 в тримере S перед слиянием (это исследование), но иногда смещается со своего места и позволяет RBD отбирать образцы восходящей конформации (PDB ID: 6vyb). Во-вторых, связывание RBD с ACE2 (PDB ID: 6m17) создает гибкий FPPR, который позволяет выявить сайт расщепления S2 ‘непосредственно перед соседним FP. Расщепление по сайту S2 ‘, и, возможно, также по сайту S1 / S2, снимает структурные ограничения на слитый пептид и инициирует каскад событий рефолдинга в S2, вероятно, сопровождаемый полной диссоциацией S1.В-третьих, образуется длинная центральная трехцепочечная спиральная катушка, и HR2 отгибается. Наконец, формируется постфузионная структура S2 (это исследование), которая объединяет две мембраны, облегчая формирование поры слияния и проникновение вируса.

Слияние мембран

Мы идентифицируем структуру около слитого пептида, FPPR, которая может играть критическую роль в слитых структурных перестройках S-белка. По-видимому, между RBD и FPPR существует перекрестное взаимодействие, опосредованное CTD1, потому что структурированный FPPR зажимает RBD, тогда как конформация RBD-up нарушает FPPR.Более того, FPPR находится близко к границе S1 / S2 и сайту расщепления S2 ‘и, таким образом, может быть центром активности, связанной с конформационными изменениями в S. Одна возможность состоит в том, что один FPPR иногда смещается из положения из-за внутренней динамики белка, позволяя RBD отбирать верхнюю конформацию. Колебание такого рода приведет к разрыхлению всего тримера S, как это наблюдается в модифицированных конструкциях растворимого тримера S ( 22 , 23 ). Как только RBD фиксируется в верхнем положении за счет связывания с ACE2 на поверхности клетки-мишени, гибкий FPPR может сделать возможным экспонирование сайта расщепления S2 ‘непосредственно перед соседним слитым пептидом.Фенотип мутации D614G, по-видимому, согласуется с представлением о том, что FPPR участвует в слиянии мембран ( 39 , 40 ). Расщепление по сайту S2 ‘снимает структурные ограничения на слитый пептид, который может инициировать каскад событий рефолдинга в S2, включая образование длинной центральной трехцепочечной спиральной спирали; откидная спинка HR2; и в конечном итоге слияние мембран. Расщепление по сайту S1 / S2 делает возможным полную диссоциацию S1, что также может способствовать рефолдингу S2.

Вопросы относительно слияния мембран остаются, потому что области около вирусной мембраны все еще не видны на реконструкциях. Однако все эти регионы играют важнейшие структурные и функциональные роли. Например, консервативная гидрофобная область, непосредственно предшествующая домену TM, и, возможно, сам TM, как было показано, имеет решающее значение для тримеризации S-белка и слияния мембран ( 31 ). Считается, что цитоплазматический хвост, содержащий пальмитоилированную, богатую цистеином область, участвует в сборке вирусов и слиянии клеток ( 32 — 35 ).Могут ли другие вирусные белки, такие как белок М, помочь стабилизировать спайк за счет взаимодействия с HR2, остается открытым вопросом. Таким образом, нам все еще нужна структура с высоким разрешением интактного S-белка в контексте мембраны и других вирусных компонентов, чтобы ответить на эти вопросы.

Соображения по поводу разработки вакцины

Безопасная и эффективная вакцина — это основной медицинский вариант снижения или устранения угрозы, исходящей от SARS-CoV-2. Первый цикл вакцин-кандидатов с различными формами S-белка вируса быстро проходит доклинические исследования на животных моделях и клинические испытания на людях.Наше исследование вызывает несколько потенциальных опасений по поводу текущих стратегий вакцинации. Во-первых, вакцины, использующие полноразмерную последовательность S-белка дикого типа, могут продуцировать различные формы in vivo, которые мы здесь наблюдали. Конформации после слияния могут открывать иммунодоминантные, не нейтрализующие эпитопы, которые отвлекают иммунную систему хозяина, как это было зарегистрировано для других вирусов, таких как ВИЧ-1 и RSV ( 46 , 47 ). Во-вторых, подход к стабилизации конформации до слияния путем введения мутаций пролина в остатки 986 и 987 может быть неоптимальным, поскольку мутация K986P может разрушить солевой мост между протомерами, который способствует стабильности тримеров.Полученная в результате структура S-тримера с расслабленной вершиной может индуцировать антитела, которые не могут эффективно распознавать шипы S-тримера на вирусе, хотя она может быть более эффективной в индукции нейтрализующих ответов против RBD, чем закрытая форма. В-третьих, учитывая возможность того, что постфузионный S2 присутствует на инфекционных вирионах, вакцины с использованием вирусов, инактивированных β-пропиолактоном, могут потребовать дополнительных тестов контроля качества. Хотя PiCoVacc, по-видимому, обеспечивает защиту от проблем у нечеловеческих приматов после трех иммунизаций ( 44 ), неясно, как минимизировать количество тримеров S2 после слияния, чтобы избежать вариаций партии.Дизайн иммуногена на основе структуры может быть особенно важным, если SARS-CoV-2 становится сезонным и возвращается с дрейфом антигенов, как и вирусы гриппа ( 48 ).

Благодарности: Мы благодарим М. Ляо за щедрый совет; команду SBGrid за техническую поддержку; и С. Харрисону, М. Ляо, А. Карфи и Д. Баруху за критическое прочтение рукописи. Данные отрицательного окрашивания и крио-ЭМ были собраны в отделении молекулярной электронной микроскопии и Гарвардском крио-ЭМ центре структурной биологии, соответственно, в Гарвардской медицинской школе. Финансирование: Эта работа была поддержана грантами NIH AI147884 (для BC), 3R01AI147884-01A1S1 (для BC), AI141002 (для BC) и AI127193 (для BC и Джеймса Чоу), а также награды COVID-19 от Массачусетский консорциум по готовности к патогенам (MassCPR; до Британской Колумбии). Вклад авторов: г. до н. Э. и Ю. задумал проект. Y.C. и H.P. экспрессировали и очищали полноразмерный S-белок. T.X. экспрессировали и очищали растворимый ACE2 и проводили эксперименты по SPR и слиянию клеток. Ю.К. и Дж. З. выполнили EM-анализ с отрицательным окрашиванием. J.Z. подготовили крио-ЭМ сетки и выполнили сбор ЭМ данных при участии С.М.С. и R.M.W. J.Z. обработал крио-ЭМ данные и построил и уточнил атомные модели для тримера S до слияния и тримеров S2 после слияния. Y.C. обработал данные S1. S.R. участвовал в обработке данных для S1 и оказывал вычислительную поддержку. С.Р.-В. способствовал культивированию клеток и производству белка. Все авторы проанализировали данные. B.C., Y.C., J.Z. и T.X. написал рукопись при участии всех других авторов. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Координаты атомной структуры были депонированы в RCSB Protein Data Bank (PDB) под номерами доступа 6XR8 и 6XRA, а карты электронной микроскопии были депонированы в банке данных электронной микроскопии (EMDB) под инвентарные номера EMD-22292 и EMD-22293. Все материалы, полученные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора в соответствии с соглашением о передаче материалов с Бостонской детской больницей.Эта работа находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Эта лицензия не распространяется на рисунки / фотографии / произведения искусства или другой контент, включенный в статью, приписываемый третьей стороне; получить разрешение от правообладателя перед использованием такого материала.

Tokyo сообщает о вирусах для жителей после всплеска новых случаев

Подпишитесь на нашу ежедневную рассылку о коронавирусе, чтобы узнать, что вам нужно знать, и подпишитесь на наш подкаст Covid-19 для получения последних новостей и анализа.

Токио впервые предупредил жителей, призвав к дополнительным мерам предосторожности против пандемии коронавируса после всплеска новых случаев.

В японской столице во вторник было зарегистрировано 34 новых случая заражения, что является максимальным показателем за один день за более чем три недели.Губернатор Токио Юрико Койке инициировала то, что она назвала «Токийским предупреждением», с целью повысить осведомленность жителей Токио о состоянии пандемии, что может привести к тому, что столичные предприятия снова попросят закрыть свои двери, если всплеск продолжится.

«Число заболевших сегодня — это уровень, на котором нам следует проявлять осторожность», — сказал Койке на заседании рабочей группы правительства Токио по вспышке. «Предупреждение в Токио — это шаг, чтобы проинформировать жителей Токио о статусе вспышки и призвать их проявлять осторожность.”

Радужный мост подсвечен красным, что означает, что «Тревога Токио» включена, 2 июня.

Фотограф: Такаши Аояма / Getty Images

Хотя само предупреждение не приведет сразу к новым ограничениям, если случаи заболевания продолжат расти в городе. Правительство заявило, что может возобновить призыв к закрытию компаний и пребыванию жителей дома.

Из 34 случаев заражения во вторник 13 произошли из кластера в больнице в Коганее на западе города, где на сегодняшний день зарегистрировано более 30 случаев заражения.Коике также сказал, что многие случаи заражения за последнюю неделю произошли из районов с ночной жизнью Токио, причем десятки случаев заражения были связаны с районами, где расположены клубы для хостес и другие подобные развлекательные заведения.

Красная тревога

Токио предупреждает жителей, призывая к осторожности после того, как число случаев коронавируса выросло до самого высокого уровня за более чем три недели

Источник: Токийское столичное правительство

Три критерия были изложены для выдачи предупреждения: более 20 новых зарегистрированных случаев за день, половина из которых невозможно отследить, а также рост числа случаев инфицирования с предыдущей недели.В настоящее время город отвечает всем трём. Живописный Радужный мост на севере Токийского залива будет освещен красным светом с 23:00. по местному времени, чтобы повысить осведомленность о пандемии.

«Уже ожидается»

Скачок количества случаев произошел через неделю после отмены национального чрезвычайного положения в районе Токио. Поскольку количество недавно подтвержденных случаев заболевания снизилось до однозначных цифр, посещаемость основных станций и количество пассажиров в поездах начали возвращаться к уровню, близкому к докандемическому, при этом в понедельник в рамках второго шага учебные заведения вновь открывают свои двери от спортзалов до школ. план города по возобновлению бизнеса.

Коике сказал, что город не будет немедленно откатываться к более раннему этапу своего плана повторного открытия, но высказал предостережение при переходе к третьему этапу плана. Она призвала компании продолжать продвигать удаленную работу, отметив возрождение переполненной среды, такой как поезда в час пик, и призвала жителей как можно больше избегать переполненных мест.

Токийские спортзалы вновь открываются, школы возвращаются после двухмесячного закрытия

Власти Японии не имеют юридических полномочий для обеспечения соблюдения ограничений изоляции из-за гражданских свобод, закрепленных в послевоенной конституции.Несмотря на то, что во время семинедельного чрезвычайного положения продолжалось активное сотрудничество, страна стремилась снять ограничения как можно быстрее, чтобы минимизировать дальнейший экономический ущерб. Япония заняла прагматичный подход: официальные лица заявляют, что вирус невозможно уничтожить, и стремятся возобновить экономическую деятельность, пока медицинская система сможет справиться с любым ростом инфекций.

«Учитывая природу этого вируса, на данный момент невозможно снизить уровень передачи до нуля», — сказал в понедельник, перед самым последним, Сигеру Оми, заместитель главы экспертной группы, консультирующей правительство Японии. шип.«После отмены чрезвычайной ситуации произошло несколько случаев, особенно в Токио и Фукуоке. Такой небольшой всплеск случаев уже ожидался ».

— При содействии Лизы Ду

(обновления с объявлением от Koike)

Прежде чем оказаться здесь, он находится на терминале Bloomberg.

УЧИТЬ БОЛЬШЕ

Ожидается, что расходы на отопление в Миннесоте вырастут, но еще не для плательщиков

Регулирующие органы штата изучают, как большой скачок цен на природный газ на прошлой неделе может повлиять на потребителей в Миннесоте.

Оптовые цены во многих частях страны резко выросли примерно до 100 раз, поскольку необычно низкие температуры препятствовали производству в южных штатах и ​​привели к огромному спросу на большей части страны.

Жители Миннесоты в значительной степени пережили резкое похолодание на прошлой неделе, так как их газоснабжение было бесперебойным. Котлы и печи работали на полную мощность, чтобы прогнать отрицательный двузначный холод. Но крупные энергетические компании штата, Xcel и Centerpoint, заявили регулирующим органам во вторник, что заплатили своим поставщикам гораздо больше, чем ожидалось, за поддержание потока углеводородов.

На заседании Комиссии по коммунальным предприятиям Эми Либерковски, директор Xcel по нормативному ценообразованию и анализу, заявила, что компания предсказывала, что средний потребитель в жилищном секторе в этом месяце сожжет природного газа на сумму около 50 долларов. Этот прогноз был низким.

«Предварительно мы думаем, что мы потратили около 300 долларов на каждого потребителя, чтобы закупить этот природный газ для его обслуживания», — сказал Либерковски.

Руководители Centerpoint заявили, что его расходы наравне с расходами Xcel, хотя энергетическая компания все еще работает над цифрами.

Это не обязательно означает, что коммунальные предприятия передадут эти огромные счета жителям Миннесоты в ближайшем будущем.

Финансовый аналитик PUC Боб Хардинг сказал, что на данный момент клиенты будут платить цену, которую их коммунальные предприятия первоначально прогнозировали на февраль. В Миннесоте любые большие расходы, которые несут компании, решаются позже в этом году.

«Потребителям будет выставлен счет за использованный в феврале объем газа по февральскому курсу. В ежемесячной корректировке закупочного газа предусмотрена отсрочка до сентября на случай возникновения дополнительных расходов в феврале », — сказал Хардинг.

Обычно потребители газа оплачивают эти дополнительные расходы за 12 месяцев. Либерковски из Xcel сказала, что она готова распространять это и дальше. А вице-президент Centerpoint по поставкам газа Майлз Кенни сказал, что клиентам не нужно иметь дело с большими колебаниями цен.

«Мы хотим избежать того, что произошло на прошлой неделе, и убедиться, что это не повторится снова. И мы очень открыты для поиска решений для защиты наших клиентов от того, что произошло на рынке разведки и добычи », — сказал Кенни.

PUC изучает, как газовые компании планируют потенциальные скачки цен во время экстремальных явлений и как облегчить бремя для потребителей с низкими доходами.

Они могут найти ответы в том, что, казалось, правильно сделала одна небольшая компания.

Кристин Андерсон сказала, что клиенты Greater Minnesota Gas, принадлежащей Faribault, не увидят скачков цен, потому что компания закупила достаточно газа заранее и избежала завышенных оптовых цен на прошлой неделе.

«Мы смогли использовать наши долгосрочные контракты и наш газ для хранения, поэтому нам не приходилось иметь дело со спотовыми ценами на газ, и мы могли оставаться вне этого спотового рынка газа, когда цены были особенно высокими», — сказал Андерсон.

Сенатор Тина Смит, штат Миннесота, прибывает, когда начинаются первые аргументы в суде по делу об импичменте бывшего президента Дональда Трампа 10 февраля в Вашингтоне. Она призвала к федеральному расследованию высоких цен на природный газ.

Дж. Скотт Эпплвайт | AP

В минувшие выходные сенатор от Миннесоты Тина Смит призвала к федеральному расследованию того, как цены выросли так высоко, и нарушил ли кто-либо закон.

В своем заявлении губернатор Тим Уолц сказал, что штат ощутит последствия повышения цен на газ, и сосредоточил внимание на муниципальных коммунальных службах, которым может потребоваться помощь в результате широкого колебания.Губернатор также сказал, что федеральное правительство должно помочь миннесотцам, у которых возникнут проблемы с оплатой счетов за электроэнергию.

Вы делаете новости MPR возможными. Индивидуальные пожертвования лежат в основе ясности освещения событий нашими репортерами по всему штату, историй, которые нас связывают, и разговоров, которые раскрывают точки зрения. Помогите обеспечить, чтобы MPR оставался ресурсом, объединяющим жителей Миннесоты.

Сделайте пожертвование сегодня. Подарок в 17 долларов имеет значение.

Разработка противовирусного препарата на основе механизма открытия спайкового гликопротеина в SARS-CoV-2

Новый коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) проникает в клетку-хозяина после того, как рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина шипа (S) вируса связывается с человеческим ангиотензин-превращающим ферментом 2 (hACE2).Это связывание требует, чтобы RBD претерпел конформационное изменение из закрытого в открытое состояние. В настоящем исследовании была идентифицирована ключевая пара солевых мостиков, образованных боковыми цепями K537 и E619, остатками на интерфейсах SD1 и SD2, соответственно, чтобы способствовать открытию RBD. Мутации K537Q и E619D уменьшили длину их боковых цепей и устранили эту пару солевых мостиков; в результате раскрытие RBD не наблюдалось при моделировании MD. Таким образом, блокирование образования этой пары солевых мостиков является многообещающим подходом для лечения нового коронавирусного заболевания 2019 года (COVID-19).Одобренные FDA молекулы лекарств были проверены по их способности блокировать образование ключевой пары солевых мостиков, достигаемой за счет их позиционной стабильности в полости, содержащей боковые цепи K537 и E619, образованных на границе раздела между SD1 и SD2. Симепревир, иматиниб и налдемедин были идентифицированы как обладающие желаемой способностью с наиболее благоприятной энергией взаимодействия.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

Сильное связывание нового шипового белка коронавируса 2019 года специфическим человеческим моноклональным антителом к ​​коронавирусу SARS

РЕЗЮМЕ

Недавно идентифицированный новый коронавирус 2019 года (2019-nCoV) вызвал более 11 900 лабораторно подтвержденных инфекций среди людей, в том числе 259 смертельных случаев. серьезная угроза здоровью человека.Однако в настоящее время не существует специфического противовирусного лечения или вакцины. Учитывая относительно высокую идентичность рецепторсвязывающего домена (RBD) в 2019-nCoV и SARS-CoV, необходимо срочно оценить перекрестную реактивность антител против SARS CoV с белком шипа 2019-nCoV, что может иметь важные последствия для быстрая разработка вакцин и терапевтических антител против 2019-nCoV. Здесь мы впервые сообщаем, что человеческое моноклональное антитело CR3022, специфичное для SARS-CoV, может эффективно связываться с RBD 2019-nCoV (KD = 6.3 нМ). Эпитоп CR3022 не перекрывается с сайтом связывания ACE2 в RBD 2019-nCoV. Эти результаты предполагают, что CR3022 может иметь потенциал для разработки в качестве терапевтического кандидата, отдельно или в сочетании с другими нейтрализующими антителами, для профилактики и лечения инфекций 2019-nCoV. Интересно, что некоторые из наиболее мощных нейтрализующих антител, специфичных для SARS-CoV (например, m396, CR3014), которые нацелены на сайт связывания ACE2 SARS-CoV, не смогли связать спайковый белок 2019-nCoV, что означает, что разница в RBD SARS-CoV и 2019-nCoV имеет решающее значение для перекрестной реактивности нейтрализующих антител, и что все еще необходимо разработать новые моноклональные антитела, которые могли бы специфически связываться с RBD 2019-nCoV.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: 2019-nCoV, SARS-CoV, ACE2, моноклональные антитела, RBD

Совсем недавно в Ухане, Китай, появился новый коронавирус, который был временно назван «новым коронавирусом 2019 года (2019-nCoV)» [1] . По состоянию на 1 февраля 2020 года в результате 2019-nCoV в Китае было зарегистрировано 11821 лабораторно подтвержденная инфекция среди людей, в том числе 259 смертельных случаев и 132 случая экспортирования в 23 страны за пределами Китая (https://www.who.int/emergencies / болезни / новый-коронавирус-2019 / ситуационные отчеты).В настоящее время нет вакцины или эффективного противовирусного лечения от инфекции 2019-nCoV.

На основании филогенетического анализа (регистрационный номер GISAID EPI_ISL_402124) [2], 2019-nCoV принадлежит к линии бета-коронавируса B и имеет высокую идентичность последовательности с таковой у летучих мышей или тяжелого острого респираторного синдрома человека, связанного с коронавирусом, связанным с коронавирусом (SARSr-CoV). и коронавирус типа SARS летучих мышей (SL-CoV) ((a)). В предыдущих исследованиях был идентифицирован ряд мощных моноклональных антител против коронавируса SARS (SARS-CoV) [3–7].Эти антитела нацелены на спайковый белок (S) SARS-CoV и SL-CoV, который является трансмембранным гликопротеином типа I и опосредует проникновение в респираторные эпителиальные клетки человека, взаимодействуя с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) рецептора клеточной поверхности [8 ]. Более конкретно, рецептор-связывающий домен (RBD) длиной 193 аминокислоты (N318-V510) в S-белке является критической мишенью для нейтрализации антител [9]. Некоторые из антител распознают разные эпитопы на RBD; например нейтрализующие SARS-CoV антитела CR3014 и CR3022 неконкурентно связывались с SARS-CoV RBD и нейтрализовали вирус синергическим образом [5].Мы предсказали конформацию RBD 2019-nCoV, а также его сложные структуры с несколькими нейтрализующими антителами и обнаружили, что результаты моделирования подтверждают взаимодействия между RBD 2019-nCoV и некоторыми антителами SARS-CoV ((b)). Это может быть связано с относительно высокой идентичностью (73%) RBD в 2019-nCoV и SARS-CoV ((c)). Например, остатки в RBD SARS-CoV, которые осуществляют полярные взаимодействия с нейтрализующим антителом m396, на что указывает сложная кристаллическая структура [10], неизменно сохраняются в RBD 2019-nCoV ((d)).В структуре SARS-CoV-RBD-m396, R395 в RBD образовал солевой мостик с D95 m396-VL. Соответственно, электростатическое взаимодействие также наблюдалось в модели 2019-nCoV-RBD-m396, образованной R408 (RBD) и D95 (m396-VL). Этот анализ показывает, что некоторые моноклональные антитела, специфичные для SARS-CoV, могут быть эффективными для нейтрализации 2019-nCoV. Напротив, взаимодействия между антителом F26G19 [11] или 80R [12] и RBD в 2019-nCoV значительно снизились из-за отсутствия солевых мостиков, образованных R426-D56 в SARS-CoV-RBD-F26G19 или D480-R162 в SARS-CoV-RBD-80R соответственно.Кроме того, хотя большинство связывающих 80R остатков на RBD SARS-CoV не консервативны на RBD 2019-nCoV ((c)), маловероятно, что антитело 80R могло бы эффективно распознавать 2019-nCoV. Поэтому крайне необходимо экспериментально определить перекрестную реактивность антител против SARS-CoV со спайк-белком 2019-nCoV, что может иметь важные последствия для быстрой разработки вакцин и терапевтических антител против 2019-nCoV.

(a) Филогенетический анализ гликопротеина шипа 2019-nCoV из его белковых последовательностей BLAST.Дерево соединения соседей было построено с использованием MEGA X, протестировано методом начальной загрузки 2000 повторов и отредактировано онлайн-инструментом iTOL (v5). (b) Смоделированная модель связывания RBD 2019-nCoV с антителами, специфичными для SARS-CoV-RBD (m396, 80R и F26G19). (c) Выравнивание белковых последовательностей 2019-nCoV и SARS-CoV RBD, показывающее преобладающие остатки, которые участвуют во взаимодействиях с ACE2 или антителами, специфичными для SARS-CoV. (d) Сравнение сложных структур антител, специфичных для SARS-CoV-RBD и SARS-CoV-RBD (показано в первом ряду), и моделей антител, специфичных для 2019-nCoV-RBD и SARS-CoV-RBD (показано во втором ряду).(e) Связывание моноклональных антител с RBD 2019-nCoV, определенное с помощью ELISA. (f) Профили связывания RBD 2019-nCoV с ACE2 и антителами, и (g) конкуренция CR3022 и ACE2 с RBD 2019-nCoV, измеренная с помощью BLI в OctetRED96. Кинетику связывания оценивали с использованием модели связывания Ленгмюра 1: 1 с помощью программного обеспечения ForteBio Data Analysis 7.0.

В этом исследовании мы впервые экспрессировали и очистили белок RBD 2019-nCoV. Мы также предсказали конформацию RBD 2019-nCoV и его комплекса с предполагаемым рецептором ACE2 человека.Сравнение взаимодействия между комплексом ACE2 [13] и SARS-CoV RBD и моделью гомологии ACE2 и 2019-nCoV RBD выявило сходные способы связывания (данные не показаны). В обоих комплексах петля β5 – β6 и петля β6 – β7 образуют обширный контакт, включающий по крайней мере семь пар водородных связей, с рецептором. Примечательно, что R426 на четвертой α-спирали в SARS-CoV RBD создает солевой мостик с E329 и водородную связь с Q325 на ACE2. Однако мутация аргинина (R426 в RBD SARS-CoV) и аспарагина (N439) в RBD 2019-nCoV устраняет сильные полярные взаимодействия, которые могут вызывать снижение аффинности связывания между RBD и рецептором.Интересно, что замена валина (V404 в RBD SARS-CoV) лизином (K417 в RBD 2019-nCoV) на β6 образовала дополнительный солевой мостик с D30 на ACE2, который может восстановить связывающую способность. Эти данные показывают, что RBD в S-белке 2019-nCoV может связываться с ACE2 с таким же сродством, как SARS-CoV RBD. Действительно, мы измерили связывание RBD 2019-nCoV с человеческим ACE2 с помощью анализа биослойного интерферометрического связывания (BLI) и обнаружили, что RBD 2019-nCoV сильно связывается с ACE2. Расчетное сродство (K _D ) RBD 2019-nCoV с человеческим ACE2 составило 15.2 нМ ((f)), что сопоставимо с таковой у шипованного белка SARS-CoV с человеческим ACE2 (15 нМ) [14]. Эти результаты показывают, что ACE2 может быть потенциальным рецептором нового коронавируса и что экспрессированный белок RBD 2019-nCoV является функциональным [2].

Затем мы экспрессировали и очистили несколько репрезентативных SARS-CoV-специфических антител, которые, как сообщалось, нацелены на RBD и обладают мощной нейтрализующей активностью, включая m396 [3], CR3014 [4], CR3022 [5], а также MERS -CoV-специфические человеческие моноклональные антитела m336, разработанные нашей лабораторией [15], и измеряли их способность связываться с RBD 2019-nCoV с помощью ELISA ((e)).Неожиданно мы обнаружили, что большинство этих антител не проявляли очевидного связывания с RBD 2019-nCoV. Чтобы подтвердить этот результат, мы дополнительно измерили кинетику связывания с помощью BLI. Нерелевантное антитело к CD40 использовали в качестве отрицательного контроля. Точно так же антитело m396, которое, как было предсказано, связывало RBD 2019-nCoV ((d)), показало лишь небольшое связывание при наивысшей измеренной концентрации (2,0 мкМ). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы решить структуру RBD 2019-nCoV с высоким разрешением и понять, почему эти антитела не могут распознать ее.

В частности, было обнаружено, что одно антитело, специфичное для SARS-CoV, CR3022, эффективно связывается с RBD 2019-nCoV, как определено с помощью ELISA и BLI ((e, f)). Он последовал за быстрым включением ( k _на из 1,84 × 10 ⁵ Ms ⁻¹ ) и замедлением ( k _от из 1,16 × 10 ⁻³ с ⁻¹ ) кинетика связывания, в результате чего K _D составлял 6,3 нМ ((f)). Это антитело было выделено из крови выздоравливающего пациента с SARS и не конкурировало с антителом CR3014 за связывание с рекомбинантным S-белком [5].Для дальнейшего выяснения связывающих эпитопов CR3022 мы измерили конкуренцию CR3022 и человеческого ACE2 за связывание с RBD 2019-nCoV. Биосенсоры стрептавидина, меченные биотинилированным RBD 2019-nCoV, были насыщены человеческим ACE2 в растворе с последующим добавлением тестируемых антител в присутствии ACE2. Как показано на (g), антитело CR3022 не показало конкуренции с ACE2 за связывание с RBD 2019-nCoV. Эти результаты предполагают, что CR3022, в отличие от двух других антител против SARS-CoV, распознает эпитоп, который не перекрывается с сайтом связывания ACE2 RBD 2019-nCoV.

RBD 2019-nCoV в значительной степени отличается от SARS-CoV по остаткам С-конца ((c)). Наши результаты предполагают, что такая разница не привела к резким изменениям в способности взаимодействовать с рецептором ACE2, но оказала решающее влияние на перекрестную реактивность нейтрализующих антител. Некоторые из наиболее мощных нейтрализующих антител, специфичных для SARS-CoV (например, m396, CR3014), которые нацелены на сайт связывания рецептора SARS-CoV, не смогли связать спайковый белок 2019-nCoV, что указывает на необходимость разработки новых моноклональных антител, которые могли бы связываться специально для РБР 2019-нКоВ.Интересно, что сообщалось, что антитело CR3022 полностью нейтрализовало как вирус SARS-CoV дикого типа, так и ускользающий вирус CR3014 в концентрации 23,5 мкг / мл, и что с CR3022 не могло быть создано никаких вариантов ускользания [5]. Кроме того, смесь CR3022 и CR3014 нейтрализовала SARS-CoV синергетическим образом, распознавая разные эпитопы на RBD [5]. Эти результаты предполагают, что CR3022 может быть разработан как терапевтический кандидат, отдельно или в комбинации с другими нейтрализующими антителами, для профилактики и лечения инфекций 2019-nCoV.Мы ожидаем, что в ближайшее время будет выявлено больше перекрестно-реактивных антител против 2019-nCoV и SARS-CoV или других коронавирусов, что будет способствовать разработке эффективных противовирусных терапевтических средств и вакцин.

Потенциальная роль интегринов в проникновении SARS-CoV-2 в клетки-хозяева

С декабря 2019 года новый коронавирус (nCoV) животного происхождения начал заражать людей, что вызвало серьезную вспышку в Китае. Этот вирус, получивший название «Коронавирус 2, связанный с тяжелым острым респираторным синдромом» (SARS-CoV-2), может вызывать тяжелое и даже смертельное респираторное заболевание, называемое коронавирусной болезнью-19 (COVID-19), и вызывать острый респираторный дистресс-синдром. (ОРДС).Вирус очень заразен, и передача происходит предположительно воздушно-капельным путем и фекально-оральным путем ( ^{Zhang et al., 2020} ). SARS-CoV-2 принадлежит к роду Betacoronavirus большого семейства Coronaviridae ( ^{«Betacoronavirus ~ ViralZone», н.д.} ). Этот род состоит в основном из респираторных вирусов позвоночных, в том числе HCoV-OC43, который вызывает 10% обычных простудных заболеваний ( ^{McIntosh et al., 1970,} ), и SARS, вызвавшего эпидемию в 2003 году с более чем 8000 инфицированными людьми в 30 странах. стран ( ^{Guan et al., 2004} ). Геном SARS-CoV-2 в настоящее время секвенирован: его близкое сходство с SARS предполагает, что он возник из того же резервуара, а именно из летучих мышей ( ^{Zhou et al., 2020} ).

Спайковый белок (S) SARS-CoV-2 является основной молекулой, присутствующей на поверхности вириона. Этот большой гликопротеин собирается в тримеры, которые образуют короноподобную структуру на оболочке, которая дает этому семейству вирусов его название (корона = корона) ( ). Спайковый белок — это многофункциональный белок, который способствует связыванию рецептора хозяина, клеточному тропизму и патогенезу.Он действует путем связывания рецепторов хозяина с клетками-мишенями, индуцируя эндоцитоз вирионной частицы, а затем катализирует слияние между мембранами хозяина и вируса, обеспечивая проникновение генома вируса в цитоплазму хозяина. Это также основная мишень для иммунной системы хозяина, усиливая избирательное давление на этот сложный механизм. Ангиотензинпревращающий фермент II (ACE2) является известным клеточным рецептором SARS у человека и летучих мышей, а также используется SARS-CoV-2 ( ^{Zhou et al., 2020} ). Мы предполагаем, что SARS-CoV-2 может также использовать интегрины в качестве клеточных рецепторов в одном или нескольких видах хозяев, связываясь с ними через консервативный мотив RGD (403-405: Arg-Gly-Asp), который присутствует в рецептор-связывающем домене. белков-шипов всех последовательностей SARS-CoV-2, проанализированных на сегодняшний день ( ).Мотив был идентифицирован сканированием PROSITE, которое включало мотивы с высокой вероятностью появления (PDOC00016) ( ^{Sigrist et al., 2013} ). Он отсутствует во всех других шиповых белках коронавируса (n = 30) и во всех протестированных последовательностях SARS (n = 155). Мотив RGD представляет собой минимальную пептидную последовательность, необходимую для связывания белков семейства интегринов, которые обычно используются в качестве рецепторов многими вирусами человека ( ^{Hussein et al., 2015} ). Связывание с интегрином мотива RGD необходимо для метапневмовируса человека (HMPV) ( ^{Chang et al., 2012 ; Wei et al., 2014} ), аденовирус человека типа 2/5 ( ^{Wickham et al., 1994} ), цитомегаловирус человека (HHV-5) ( ^{Feire et al., 2004} ), ассоциированный с саркомой Капоши вирус (HHV-8) ( ^{Hussein et al., 2015} ), вирус Эпштейна-Барра (HHV-4) ( ^{Xiao et al., 2008} , p. 2), ротавирус (RV) ( ^{Zárate et al. ., 2004,} ) и вируса Коксаки А9 (^{, Williams et al., 2004,} ). Сохранение мотива и его локализация в рецептор-связывающей области шипового белка SARS-CoV-2 предполагает, что интегрины могут быть альтернативными рецепторами для этого вируса.Это может расширить тропизм клеток и потенциально повлиять на вирусную патогенность и передачу.

Схематическое изображение S-белка SARS-CoV-2 с акцентом на рецептор-связывающий домен. Последовательности 12 бета-коронавирусов были выровнены с помощью MAFFT ( ^{Katoh et al., 2019} ). Рецептор-связывающий домен и рецептор-связывающая область ACE2 окрашены в синий и голубой цвет соответственно. Мотив RGD SARS-CoV-2 выделен цветом. Цифры относятся к последовательности белка шипа SARS-CoV-2.

Для связывания интегрина мотив должен присутствовать на поверхности белка. Чтобы оценить локализацию мотива RGD в белке шипа, мы проанализировали его трехмерную модель из SWISS-MODEL ( ^{Waterhouse et al., 2018} ). Эта модель была получена на основе моделирования гомологии гликопротеиновой последовательности шипа SARS-CoV-2 из UniProt ({«type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: «P0DTC2», «term_id»: «1835922048) «,» term_text «:» P0DTC2 «}} P0DTC2; SPIKE_WCPV) с трехмерной структурой гликопротеина SARS (PDB 6ACD) в качестве шаблона ( ^{Berman et al., 2000} ). Мотив RGD и другие известные связывающие области были визуализированы с помощью Jmol, Java-программы для просмотра химических структур в 3D с открытым исходным кодом (http://www.jmol.org/).

Спайковый гликопротеин SARS-CoV-2 RGD находится в рецептор-связывающем домене (аминокислоты с 319 по 541) () на границе субдомена (аминокислоты с 437 по 508), который специфически участвует в связывании с человеческим ACE2. ( ^{Li et al., 2005 ; Xiao et al., 2003} ). В несвязанном состоянии, т.е.е. «вниз» или грибовидная конформация, мотив RGD гликопротеина шипа SARS-CoV-2 определяет небольшую петлю (ограниченную мотивом) между двумя вторичными структурами, β-цепью и α-спиралью, около поверхности спайк протеин ( а и б). Недавно стали доступны структуры шиповых белков SARS-CoV-2, связанных с мотивом рецептора ACE2 ( ^{Lan et al., 2020,} , стр. 2; ^{Yan et al., 2020,} ). Связывание ACE2 вызывает драматические конформационные изменения, затрагивающие один из рецептор-связывающих доменов тримера.Он принимает выступающую «вверх» конформацию, обнажая субдомен связывания ACE2, а также область, содержащую RGD (c и d). Однако по связыванию ACE2 трудно предсказать, как будет выглядеть связывание интегрина. Он может вызывать различные конформационные изменения рецептор-связывающего домена, подвергая мотив RGD связыванию интегрина.

A) и B) Модель структуры SARS-CoV-2 предоставлена ​​SWISSMODEL и визуализирована с помощью Jmol. А) Грибовидная складка модели является классической при отсутствии связывания лиганда.Связывание лиганда вызывает резкое конформационное изменение, ведущее к выступу одного из тримерных связывающих доменов, дополнительно обнажая RGD-петлю. Рецептор-связывающий домен был окрашен в синий цвет, с фокусом голубого цвета на части, связывающей рецептор ACE2. Мотив RGD окрашен в красный цвет. Б) Увеличенный вид рецептор-связывающего домена. Участок, который, как было продемонстрировано, связывает ACE2, а также RGD-петли, расположены на поверхности домена даже в отсутствие лиганда. Те же цвета, что и у А.C) и D) Модель структуры SARS-CoV-2 в конформационном состоянии связывания ACE2, предоставленная SWISSMODEL и визуализированная с помощью Jmol. C) Рецептор-связывающий домен тримера находится в конформации «вверх», обнажая мотив RGD. Тот же цвет, что и в; ACE2 не представлен. D) Увеличенное изображение рецептор-связывающего домена, подчеркивающее расположение мотива RGD на самой поверхности домена. Те же цвета, что и в A.

Интегрины представляют собой гетеродимерные рецепторы клеточной поверхности, которые играют роль в клеточной адгезии, миграции клеток и процессах передачи сигналов клеток ( ^{Hynes, 2002,} ).Вирусные белки с мотивами RGD способствуют инфицированию, связывая гетеродимеры интегрина, такие как αVβ1, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, α5β1, α8β1 и αIIbβ3 ( ^{Hussein et al., 2015} ), активируя пути трансдукции с участием фосфатидилинозит-3 3K) или митоген-активирующая протеинкиназа (MAPK), которые способствуют проникновению вируса и инфицированию клетки-хозяина. Аденовирусы серотипов 2 и 5 обладают такими белками, как и метапневмовирус человека ( ^{Chang et al., 2012 ; Wei et al., 2014} ). Этот вирус наиболее близок к SARS-CoV-2 по тропизму органов и симптомам, хотя в основном поражает детей. Интересно, что мотив RGD метапневмовирусного белка F принимает складку, аналогичную таковой у SARS-CoV-2, с небольшой петлей, вставленной между двумя вторичными структурами (в данном случае двумя β-листами) ( ^{Cox et al., 2012} ). Учитывая это очевидное сходство, вполне вероятно, что SARS-CoV-2 приобрел интегрин-связывание, чтобы способствовать проникновению вируса в клетки-хозяева, но требуется экспериментальное доказательство этого.Связывание с интегрином может играть дополнительную роль в связывании ACE2, например, в облегчении эндоцитоза посредством передачи сигналов через интегрин. С другой стороны, вирус может инфицировать различные клетки-мишени, связываясь с ACE2 или интегринами.

В настоящее время существует несколько противовирусных молекул, эффективных против SARS-CoV-2 ( ^{Wang et al., 2020} ). Агенты, блокирующие связывание интегрина, могут стать многообещающим направлением исследований. Известные блокаторы связывания интегрина включают антитело натализумаб (антагонист интегрина α4β1 / β7) для лечения рассеянного склероза / болезни Крона, низкомолекулярный тирофибан (ингибитор αIIbβ3) для лечения острого коронарного синдрома, а также ингибиторы αV. RGD-связывающий интегрин ( ^{Hatley et al., 2018} ). Фармакотерапия анти-интегрином, безусловно, возможна, хотя пока нет лечения, предотвращающего связывание вируса с интегрином, что позволяет предположить, что необходимы дальнейшие исследования для нейтрализации этих патогенов.

Биохимическая перспектива неструктурных белков (NSP) и шипованного белка SARS CoV-2

Часть 1: Ферменты, являющиеся неструктурными белками (NSP) из гена ORF1ab

Результаты по гену ORF1ab SARS CoV-2 в экспрессии полипептида, который расщепляется на 16 неструктурных белков [1].Из гена ORF1ab SARS CoV-2 содержит два фермента протеазы: NSP3 (папаин-подобная протеаза) и NSP5 (3C-подобная протеаза), РНК-полимераза, которая копирует вирусную РНК: NSP12, фермент 5′-РНК-трифосфатазы: NSP13, гуанозин. N7-метилтрансфераза: NSP14, эндорибонуклеаза: NSP15 и 2′- O -рибоза-метилтрансфераза (NSP16). Эту группу ферментов обычно можно разделить на разные подгруппы: (i) протеазы (NSP3 и NSP5), (ii) ферменты, участвующие в 5′-кэпирующей модификации вирусной РНК — посттрансляционная модификация вирусной РНК (чтобы позволить вирусной РНК чтобы избежать врожденной иммунной системы хозяина) (NSP13, NSP14, NSP15 и NSP16), (iii) репликация РНК (NSP12) и (iv) другие активности, модифицирующие РНК, такие как посттрансляционная модификация белков (активность ADP рибозофосфатазы NSP5) и активность экзорибонуклеазы / эндорибонуклеазы (активность NSP14 / NSP15).

NSP3 (папаин-подобная протеаза)

NSP3 (папаин-подобная протеаза) представляет собой многофункциональный белок с 1945 аминокислотными остатками. Папаин-подобный домен катализирует реакцию, которая расщепляет пептидные связи между: (i) NSP1 и NSP2, (ii) NSP2 и NSP3 [7], и (iii) NSP3 и NSP4 (Таблица 1) [8]. Этот фермент расщепляет консенсусную последовательность LXGG [8]. NSP3 из SARS CoV-2 был кристаллизован и биохимически охарактеризован [9]. Каталитическая триада NSP3 SARS CoV-2 находится в следующих остатках: D286, h372 и C111.Эта недавняя группа экспрессировала PLpro-Ubl домен NSP3 (аминокислотные остатки 746-1060) [9]. Было показано, что SARS CoV-2 NSP3 предпочтительно расщепляет убиквитин-подобный интерферон-стимулированный белок гена 15 (ISG15). Это отщепление ISG15 от фактора интерферона 3 (IRF3) ослабляет ответ интерферона типа I. Другая группа сообщила о кристаллической структуре (PDB ID: 7CMD) — структура показана на рис. 1 [10]. Было предпринято много усилий по изучению кристаллической структуры NSP3 и разработке эффективных ингибиторов для этой протеазы — например, акцепторы Майкла были сконструированы для образования ковалентных тиоэфирных связей с активным центром остатка цистеина [11].В таблице 1 показаны последовательности, которые NSP3 расщепляет своей каталитической триадой. Реакция, катализируемая NSP3, показана на схеме 1.

Рис. 1

Кристаллическая структура папаин-подобного протазного домена NSP3 (PDB ID: 7CMD). Увеличенная область каталитической триады NSP3 (аспартат-286, гистидин-272 и цистеин-111)

Схема 1

Химическая реакция, катализируемая NSP3 (папаин-подобная протеаза или PLpro) и NSP5 (3C-подобная протеаза или 3CLpro). См. Также Ref. [105] для получения дополнительной информации.NSP3 имеет каталитическую триаду (цистеин-гистидин-аспартат), тогда как NSP5 имеет каталитическую диаду (цистеин-гистидин) [106]. Для NSP3 ключевыми остатками являются: D286, h372 и C111, а для NSP5 остатки активного сайта: h51 и C145

Помимо протеазной активности, NSP3 также имеет другие домены, которые придают другие активности. Например, есть домен рибозо-фосфатазы. Кристаллическая структура домена ADP рибозо-фосфатазы NSP3 была выяснена (PDB ID: 6w02) [12]. Структура домена рибозофосфатазы АДФ представлена ​​на рис.2. SARS CoV имеет необходимый аспарагин-41 для активности АДФ-рибозо-1ʺ-фосфатфосфатазы [7]. Эта дерибозилирующая активность АДФ связана с избеганием иммунной системы хозяина [7].

Рис. 2

Кристаллическая структура ADP-рибозофосфатазного домена NSP3 (PDB ID: 6W02) [12]. Красные сферы — это молекулы воды (Цветной рисунок онлайн)

NSP5 (3C-подобная протеаза)

NSP5 расщепляется в 11 различных сайтах полипротеина ORF1ab с 306 аминокислотами после удаления из полипротеина [13].Активный центр NSP5 (3C-подобная основная протеаза) имеет каталитическую диаду из остатка цистеина-145 и остатка гистидина-41. Сообщалось о кристаллической структуре NSP5 (PDB ID: 6Y2E) [14]. Структура NSP5 показана на рис. 3. Сообщалось о других структурах с ингибиторами, связанными с NSP5 [15, 16] [17]. На рисунке 3 также показана структура NSP5 с ингибитором, связанным с GC376 (PDB ID: 6WTT) [18]. В таблице 2 показаны последовательности, которые расщепляются NSP5.

Таблица 1 Известно, что каталитическая триада NSP3 расщепляет сайты между NSP1 – NSP2, NSP2 – NSP3 и NSP3 – NSP4 Рис.3

a Кристаллическая структура NSP5 (идентификатор PDB: 6Y2E). b Увеличено с учетом каталитической диады (цистеин-145 и гистидин-41) справа (PDB ID: 6Y2E) [14]. c Кристаллическая структура NSP5, связанного с ингибитором GC-376 (PDB ID: 6WTT) [18]. d Увеличено с учетом каталитической диады с ингибитором, связанным с остатком цистеина (C145). e Наложенные структуры ( a ) и ( b ). (белок апо красный). f Увеличено с учетом наложенных структур.Расстояния между гистидином и серой цистеина в формах, связанных с апо-белком и ингибитором, составляют 3,6 и 4,0 ангстрем, соответственно.

NSP12 — РНК-полимераза

NSP12 — это РНК-полимераза с 932 аминокислотами, которая копирует вирусную РНК. Сообщалось о структуре NSP12 [19]. Структура NSP12, который образует комплекс с матрицей РНК и NSP8, показана на рис. 4. Интересно, что показано, что NSP8 стабилизирует матрицу РНК с его положительно заряженными остатками, координирующими отрицательно заряженный фосфатный остов матрицы РНК (рис.5, увеличенный вид фиг. 4). Ремдесивир — это современный противовирусный препарат, используемый для лечения SARS CoV-2, и этот препарат является пролекарством, которое метаболизируется до активной формы и включается NSP12 в матрицу РНК для остановки репликации [20]. В тестах ингибирования комплекса SARS CoV-2 RdRp с ремдезивиртрифосфатом исследователи использовали ремдезивир в концентрации 100 нМ, чтобы продемонстрировать ингибирование активности РНК-полимеразы [20]. Для сравнения трифосфат ремдесивира против РНК-зависимой РНК-полимеразной активности вируса Эбола, концентрации 33 мкМ показали эффект ингибирования [21].В клетках Vero E6 ремдесивир блокировал инфекцию SARS CoV-2 с половинной максимальной эффективной концентрацией (EC ₅₀ ) 0,77 мкМ [22]. Ремдезивир трифосфат подавляет репликацию вируса Эбола в клетках HMVEC / TERT (эндотелиальные клетки микрососудов человека) с половинной максимальной эффективной концентрацией (EC ₅₀ ) 0,06 мкМ [23]. Схема 2 показывает общий механизм того, как РНК-полимераза реплицирует вирусный геном.

Таблица 2 Сайты расщепления NSP5 — 3C-подобной протеазы [97] Рис.4

Структура комплекса РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp): РНК-полимераза NSP12 (красный) из SARS CoV-2 (PDB ID: 6YYT) [19]. Зеленые белки — это два белка NSP8 (NSP8 и NSP8 ‘), которые, как полагают, взаимодействуют и стабилизируют РНК. NSP7 показан синим цветом (Цветной рисунок онлайн)

Рис. 5

На NSP8 и NSP8 ‘(K37, K36, K40, K46, R51, R57, K58, K61) есть положительно заряженные аминокислотные остатки, которые стабилизируют отрицательно заряженные фосфатные группы в матрице РНК (PDB ID: 6YYT) [19]

Схема 2

Механизм реакции РНК-полимеразы, включающий новую РНК (РНТФ) в цепь праймера

Структура NSP12 с ремдезивиром в активном центре имеет вид доступно (PDB ID: 7BV2) [24].Эта структура представляет собой комплекс между NSP12 с NSP7 и NSP8 (фиг. 6 и см. Фиг. 7 для увеличенного изображения активного сайта NSP12 со связанным ремдезивиром).

Рис. 6

a Структура NSP12 (красный), также называемая: РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) в комплексе с NSP7 (зеленый) и NSP8 (синий) (PDB ID: 7BV2). b NSP12 отдельно с матрицей РНК (NSP7 и NSP8 скрыты для ясности). Различные домены NSP12 [98] — нуклеотидилтрансфераза, ассоциированная с RdRp нидовируса (NiRAN): 51–249 (красный), интерфейс: 250–365 (зеленый), пальцы: 366–581 и 621–679 (серый), Palm: 582 –620 и 680–815 (синий) и Thumb: 816–932 (голубой) (Цветное изображение онлайн)

Рис.7

Активный сайт NSP12 с включенным ремдесивиром (PDB ID: 7BV2). Красная сфера у C222 — это молекула воды (Цветной рисунок онлайн)

Механизм действия ремдесивира заслуживает обсуждения, поскольку на основе этого препарата и фавипиравира можно разработать больше противовирусных препаратов на основе нуклеозидов [25, 26]. Ремдесивир является пролекарством — он метаболизируется в активную форму после того, как проникает через клеточную мембрану (рис. 8). Ферменты, катепсин A (CatA) и карбоксиэстераза 1 (CES1), превращают ремдезивир в его метаболит аланина, который затем подвергается гидролизу ферментом, связывающим нуклеотид-протеин 1 гистидиновой триады (HINT1), в монофосфат [27].Монофосфат, наконец, модифицируется киназами с образованием ремдезивира трифосфата (также называемого GS441326 или RDV-TP) [20], субстрата для комплекса РНК-полимеразы (NSP12) для включения в цепь праймера [28].

Рис. 8

Метаболизм ремдесивира в его трифосфатный метаболит, субстрат NSP12. Также для сравнения показана структура аденозина. Показана структура фавипиравира, другого противовирусного пролекарства.

После включения ремдезивира трифосфата (RTP) в праймер РНК — ингибирование комплекса NSP12 происходит за счет терминации цепи, как показано на рис.9. Ремдесивир заменяет аденозин и инкорпорируется противоположно уридину из цепи матрицы. Предполагается, что серин-861 из NSP12 имеет стерическое противоречие с C1′-нитрильным фрагментом единицы ремдезивира только после включения трех дополнительных нуклеотидов. Это стерическое взаимодействие было определено с помощью модели [20]. Более того, хотя не было экспериментальных доказательств нуклеофильного присоединения (т. Е. Ковалентной аддукции) сериновой гидроксигруппы (S861) к углероду нитрильного фрагмента, это может быть разумной возможностью, а также электростатического взаимодействия между O – H остатка серина и неподеленной концевой азотной пары нитрила.

Рис. 9

Как включение ремдесивира в праймер РНК ингибирует РНК-зависимую активность РНК-полимеразы (комплекс NSP12 – NSP7 – NSP8) за счет терминации цепи. После включения ремдесивира в цепь праймера комплекс РНК-полимеразы включает еще три нуклеотида перед остановкой. Гипотетическая последовательность для матрицы показана выше, чтобы проиллюстрировать, что три NTP включаются после включения ремдезивира в праймер, в то время как четвертый NTP не включается [20]

В клинике ремдесивир был лучше, чем плацебо, у взрослых, которые были госпитализирован с COVID-19.Эти пациенты получали ремдесивир в дозе 200 мг в первый день, а затем по 100 мг каждый день в течение дополнительных 9 дней [29].

NSP13 — геликаза и 5′-трифосфатаза РНК

NSP13 с 601 аминокислотой обладает множественной ферментативной активностью — активностью геликазы, 5′-трифосфатазы РНК [30] и NTPase [31].

РНК-кэппинг

-кэппинг и метилирование РНК — это процесс, который посттрансляционно модифицирует вирусную РНК, чтобы помочь вирусной РНК скрыться от распознавания врожденной иммунной системой хозяина [32].Это кэппирование также обеспечивает связывание с рибосомой хозяина для трансляции белков. На рис. 10 показана общая химическая структура 5′-кэп-модификации РНК. Этот процесс у коронавирусов состоит из 4 этапов [33].

Рис. 10

Структура 5′-кэпа РНК, процессируемая вирусными белками SARS CoV-2. 5′-кэп вирусной РНК предотвращает распознавание врожденной иммунной системой хозяина и способствует трансляции рибосомой.

(i) РНК-трифосфатазная активность с помощью NSP13, что включает удаление 5′-гамма-фосфатной группы мРНК.

(ii) Активность гуанилилтрансферазы — включая перенос группы GMP на оставшийся 5′-дифосфатный конец (фермент, который переносит эту группу GMP, все еще неизвестен).

(iii) N7-метилтрансферазная активность NSP14 — эта активность ограничивает N7-азот гуанозина на 5′-конце (образуя структуру «cap-0» — ^7Me GpppN).

(iv) 2′-O-метилтрансферазная активность NSP16.

Активность РНК 5′-трифосфатазы важна для запуска процесса кэппирования РНК.Эта активность NSP13 является региоселективной в отношении гидролиза γ-фосфатной группы на 5′-конце вирусной РНК (схема 3). Последующая стадия гуанилилтрансферазы (стадия (ii) в процессе 5′-кэппирования) вводит гуанозинмонофосфатную (GMP) группу на этом образующемся дифосфатном конце. Однако фермент, который катализирует реакцию включения GMP, неизвестен. Интересно отметить, что другой белок, белок бакуловируса LEF-4 (фактор поздней экспрессии-4), как известно, обладает множественной активностью, включая активность РНК 5′-трифосфатазы, нуклеозидтрифосфатазы и гуанилилтрансферазы [34].

Схема 3

Реакция, катализируемая NSP13, включающая активность РНК-5′-фосфатазы для инициации 5′-кэпирования мРНК. Предполагается, что аминокислотные остатки K288 и D374 играют роль в стимулировании выхода концевого фосфата и депротонировании гидролизующейся молекулы воды соответственно. Подтверждение этой гипотезы показано структурным анализом на рис. 11 (PDB ID: 6XEZ и 6YJT)

С точки зрения активности 5′-трифосфатазы для NSP13 [30] ключевые остатки в активном сайте были идентифицированы. в SARS CoV-1 [35].Было предложено, чтобы этот активный сайт был тем же самым сайтом для активности NTPase. Ключевые аминокислотные остатки в активном центре были определены как K288, S289, D374, Q404 и R567 [35]. Когда любой из этих аминокислотных остатков заменяли на остатки аланина, активность прекращалась [35]. Эти аминокислотные остатки консервативны в SARS CoV-2. Основываясь на выравнивании последовательностей между NSP13 SARS CoV-1 и SARS CoV-2, только одна аминокислота из 601 отличается (положение-570 является изолейцином в SARS CoV-1 и валином в SARS CoV-2) [ 1].Схема 3 показывает предложенный механизм того, как NSP13 может региоселективно гидролизовать γ-фосфатную группу своего субстрата с помощью ключевых аминокислотных остатков (K288 и D374), что подтверждается структурой, показанной на рис. 11.

Рис. 11

a Структурная суперпозиция между NSP13 SARS CoV-2 и SARS CoV-1 (PDB ID: 6XEZ и 6YJT). В соответствии с опцией Matchmaker в программном обеспечении Chimera эталонная цепь была настроена на цепь F (зеленый) из 6XEZ (комплекс NSP13 из SARS CoV-2 PDB ID), а соответствующая цепочка была установлена ​​на цепочку A (красная) из 6YJT (PDB). ID для NSP13 SARS CoV-1, апо-белок). b Сфокусированный вид активного сайта 5′-трифосфатазы. c Другой угол SARS CoV-2 NSP13 (зеленый, отдельно, PDB ID: 6XEZ) для ясности. d Расширенный вид активного центра SARS CoV-2 NSP13 (зеленый) — показана молекула AlF ₃ , которая имитирует концевой монофосфат. Зеленые сферы в b и d представляют собой ионы Mg ²⁺ (они идентичны) (Цветной рисунок онлайн)

Сообщалось, что структура NSP13 для SARS CoV-2 представляет собой комплекс с NSP12 – NSP7– NSP8 (идентификатор PDB: 6XEZ) [36].Чтобы сфокусироваться на активном сайте 5′-трифосфатазы в структуре NSP13, был взят комплекс NSP13-NSP12-NSP7-NSP8 (ID PDB: 6XEZ), и был показан только NSP13 (т.е. NSP12, NSP7 и NSP8 скрыты ) на фиг. 11. Эта структура (6XEZ) содержит фрагмент АДФ, связанный с активным сайтом. Доступная структура апо-формы NSP13 SARS CoV-1 также доступна (PDB ID: 6YJT). Используя структуру NSP13 из SARS CoV-1 и знание остатков активного сайта (K288, S289, D374, Q404 и R567), две структуры были наложены друг на друга, чтобы показать активный сайт NSP13 для SARS CoV-2.

На фиг. 12 показана структура NSP13 SARS CoV-2 (PDB ID: 6XEZ) в виде комплекса с РНК-полимеразой, которая имеет отношение к его геликазной активности [36]. Эта структура была использована, чтобы показать активный сайт активного сайта РНК-5′-трифосфатазы NSP13 на фиг.11. На следующем рисунке (фиг.13) показан NSP13 в комплексе с РНК-зависимым комплексом РНК-полимеразы (RdRp комплекс: NSP12 – NSP7 – NSP8) с цепью РНК, встроенной в блок NSP13 ‘(PDB ID: 7XCM) [37], что предположительно соответствует матрице РНК, которую геликаза «раскручивает» для репликации.

Рис. 12

Структура NSP13 (серый) в комплексе с NSP7 (синий), NSP8 (зеленый) и NSP12 (красный), связанными с матрицей РНК (PDB ID: 6XEZ). (Есть два блока NSP13 (NSP13 и NSP13 ′), два блока NSP8 (NSP8 и NSP8 ′), один блок NSP12 и один блок NSP7) (Цветной рисунок онлайн)

Рис.13

Структура NSP13 (серый, геликаза) в комплексе с NSP12 (красный), NSP7 (синий), NSP8 (зеленый) и РНК (PDB ID: 7XCM) [37]. (Есть два блока NSP13 (NSP13 и NSP13 ′), два блока NSP8 (NSP8 и NSP8 ′), один блок NSP12 и один блок NSP7).NSP13 ‘имеет часть связанной матрицы РНК, которая показывает геликазную активность этого белка (цветная диаграмма онлайн)

NSP14 — гуанозин N7-метилтрансфераза и экзорибонуклеаза

Было показано, что NSP14, состоящий из 527 аминокислот, обладает двумя активностями: Активность N7-метилтрансферазы, а также активность экзорибонуклеазы. В первом случае метильная группа S -аденозилметионина переносится на N7-группу концевого гуанозина [33]. На схеме 4 показано, как NSP14 метилирует N7-положение гуанозина на 5′-кэпе РНК.

Схема 4

Реакция, катализируемая NSP14, включающая N 7-метилирование гуанозинового остатка 5′-кэпа вирусной РНК. Субстратом метилирования является S -аденозилметионин (SAM), который превращается в S -аденозилгомоцистеин (SAH)

. Хотя о структуре NSP14 не сообщалось, структура NSP14 в комплексе с NSP10 для SARS CoV-1 имеет сообщалось (PDB ID: 5C8T) [38]. На рис. 14 показана кристаллическая структура NSP14 для SARS CoV-1.

Рис. 14

Структура NSP14 для SARS CoV-1 в комплексе с NSP10 (PDB ID: 5C8T). NSP14 — желтовато-коричневый (справа), а NSP10 — красный (слева). Лиганд S-аденозилметионина (SAM) (зеленый) показан в комплексе (обведен кружком). Зеленая сфера представляет собой ион магния (II), координированный с остатками D90 и E191 NSP14 (цветной рисунок онлайн)

Сообщается, что NSP14 также обладает эксорибонуклеазной активностью. Было показано, что инактивация активности экзорибонуклеазы (ExoN) приводит к летальному исходу для SARS CoV-2 [39].

NSP15 — эндорибонуклеаза

NSP15 (также называемая EndoU) с 346 аминокислотами представляет собой фермент эндорибонуклеаз, который расщепляет 5′-полиуридиновый мотив вирусной РНК с отрицательным смыслом [40]. Полиуридиновый хвост возникает из-за шаблонного полиА-процессинга, который происходит для матричной РНК (мРНК) [41]. Предполагается, что остатки гистидина участвуют в катализе активного центра эндорибонуклеаз [42]. На схеме 5 показана эндорибонуклеазная активность NSP15.

Схема 5

Эндорибонуклеазная активность NSP15

Сообщалось о структуре NSP15 [43].Ключевые остатки активного сайта NSP15: His235, His250, Lys290 и Thr341 [43]. На рис. 15 показана структура NSP15 (идентификатор PDB: 6VWW). Более того, доступна структура NSP15 с уридин-3 ‘, 5’-дифосфатом (PDB ID: 7K1O) (фиг. 15c, d).

Рис. 15

a Структура апо NSP15 (зеленый, PDB ID: 6VWW) [43]. b Структурное выравнивание апоформы NSP15 (зеленый, PDB ID: 6VWWL: 6VWW) и формы, связанной с дифосфатом уридина (красный, PDB ID: 7K1O) [99]. c Структура NSP15 из SARS CoV-2, связанного с дифосфатом уридина (красный, PDB ID: 7K1O). d Расширенный вид активного сайта NSP15 со связанным уридиндифосфатом (PDB ID: 7K1O). Зеленые сферы в a и b представляют собой молекулы воды (Цветной рисунок онлайн)

NSP16-2′-

O -Рибоза-метилтрансфераза

Последний 5′-блокирующий фермент, который охватывает этот обзор, — это NSP16, содержащий 298 аминокислоты. Этот фермент метилирует 2′-положение рибозы первого транскрибируемого нуклеотида с помощью S -аденозилметионина [44].Сообщается о структуре NSP16 (PDB ID: 6YZ1), и эта структура показана на рис. 16 [45]. Реакция, катализируемая NSP16, показана на схеме 6.

Рис. 16

a Структура комплекса NSP10 – NSP16 со связанным синефунгином (PDB ID: 6YZ1). NSP16 — зеленый. NSP10 желто-коричневый. Структура синефунгина показана в левом верхнем углу. b показывает расширенный вид активного сайта NSP16 (зеленый) со связанным синефунгином (красный). Красные сферы — это молекулы воды (Цветной рисунок онлайн)

Схема 6

Реакция, катализируемая NSP16.NSP16 переносит метил из S -аденозилметионина в положение 2′- O в 5′-кэпе вирусной РНК

Часть 2: Спайковый белок SARS CoV-2

Спайковый белок представляет собой тримерный гликопротеин экспрессируется ORF2 в вирусном геноме. Недавно было высказано предположение, что штамм SARS CoV-2, содержащий вариант белка шипа D614G, имеет более широкое распространение, чем исходный штамм с остатком аспартата в положении-614 [46]. Этот вариант 614G не связан с повышенной серьезностью инфекции, но было высказано предположение, что вариант 614G имеет повышенную инфекционность по сравнению с вариантом D [47].Чтобы объяснить повышенную вирусную нагрузку мутантного штамма D614G [46], был проведен тщательный структурный анализ белка-шипа.

Структурные сравнения шипового белка SARS CoV-2 с другими известными коронавирусами, заражающими людей (SARS CoV-1, HCoV-299E, MERS CoV, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63)

Рисунки 17, 18 , 19, 20, 21 и 22 показаны отдельные первичные выравнивания последовательностей между спайковым белком SARS CoV-2 и 6 спайковыми белками из других коронавирусов человека: (i) SARS CoV-1 (β-коронавирус), (ii) человеческий коронавирус 229E или HCoV-299E (α-коронавирус), (iii) коронавирус ближневосточного респираторного синдрома или MERS CoV (β-коронавирус), (iv) человеческий коронавирус OC43 или HCoV-OC43 (β-коронавирус) [48], (v ) Коронавирус человека HKU1 [49] или HCoV-HKU1 (β-коронавирус линии А) и (vi) Коронавирус человека-NL63 или HCoV-NL63 (α-коронавирус).Все идентичности и сходства последовательностей, показанные в таблице 3, были определены с использованием программного обеспечения LALIGN (см. Вспомогательную информацию для выравнивания) [50]. SARS CoV-1 и HCoV-NL63 [51], как известно, взаимодействуют с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2), тогда как HCoV-229E [52] и MERS CoV [53] взаимодействуют с аминопептидазой N (APN) и дипептидилпептидазой. 4 (DPP4) рецепторов соответственно. Фактически, было высказано предположение, что DPP4 также может действовать как рецептор для белка-шипа SARS CoV-2 [53].Кроме того, было выполнено структурное выравнивание доступных крио-ЭМ структур из банка данных белков (PDB) белков-шипов, чтобы получить представление о сходстве и различии между некоторыми из этих вирусов (идентификатор вируса / PDB: SARS CoV-2 / 7JJJ [54], SARS CoV-1 / 5XLR [55], HCoV 229-E / 6U7H [52], MERS CoV / 5X5U [56], HCoV OC43 / 6OHW [52], HCoV HKU1 / 5I08 [57], HCoV NL63 / 5СЗС [58]).

Рис.17

a Первичное выравнивание последовательностей SARS CoV-2 (GenBank: BCA87361.1) и SARS CoV-1 (GenBank: AAP13441.1). b Структурное сравнение белков-шипов из SARS CoV-2 (красный, PDB ID: 7JJJ) и SARS CoV-1 (голубой, PDB ID: 5XLR) [55]. AAP13441.1 (теперь устаревший, но ранее использовавшийся: NP_828851.1 [1], где позиция S577A). c Повернутое изображение (Цветной рисунок онлайн)

Рис.18

a Первичное выравнивание последовательностей SARS CoV-2 (GenBank: BCA87361.1) и HCoV-229E (GenBank: QOP39313.1). b Структурное сравнение белков-шипов из SARS CoV-2 (красный, PDB ID: 7JJJ) и HCoV-229E (PDB ID: 6U7H) [52]. c Повернутое изображение (Цветной рисунок онлайн)

Рис.19

a Первичное выравнивание последовательностей SARS CoV-2 (GenBank: BCA87361.1) и MERS-CoV (GenBank: ASU91305.1). b Структурное сравнение белков-шипов из SARS CoV-2 (красный, PDB ID: 7JJJ) и MERS CoV (PDB ID: 5X5U, открытая конформация RBD) [56]. c Повернутое изображение ( a ) (Цветной рисунок онлайн)

Рис.20

a Первичное выравнивание последовательностей SARS CoV-2 (GenBank: BCA87361.1) и HCoV OC43 (GenBank: AAA03055.1). b Структурное сравнение белков-шипов из SARS CoV-2 (красный, PDB ID: 7JJJ) и HCoV OC43 (PDB ID: 6OHW) [52]. c Повернутое изображение ( a ) (Цветной рисунок онлайн)

Рис.21

a Первичное выравнивание последовательностей SARS CoV-2 (GenBank: BCA87361.1) и HCoV HKU1 (GenBank: ADN03339.1 ). b Структурное сравнение белков-шипов из SARS CoV-2 (красный, PDB ID: 7JJJ) и HCoV HKU1 (PDB ID: 5I08) [57]. c Повернутое изображение (Цветной рисунок онлайн)

Рис. 22

a Первичное выравнивание последовательностей SARS CoV-2 (GenBank: BCA87361.1) и HCoV NL63 (GenBank: AGT51394.1). b Структурное сравнение белков-шипов из SARS CoV-2 (красный, PDB ID: 7JJJ) и HCoV NL63 (PDB ID: 5SZS) [58]. c Повернутое изображение ( a ) (Цветной рисунок онлайн)

Таблица 3 Сводка идентичностей последовательностей и сходства между SARS CoV-2 (идентификатор GenBank: BCA87361.1 ) и других коронавирусов человека [50]. Перекрытие АА: перекрытие аминокислот

Структурный анализ спайкового белка SARS CoV-2

Спайковый белок существует как тример. На рисунках 23 и 24 показаны три протомера, которые объединяются, чтобы сформировать тример белка шипа (PDB ID: 7JJJ) [54]. На рис. 24 показаны различные доменные организации белка-шипа (рецептор-связывающий домен, единица S1 и единица S2). Сайт S1-S2 — это место, где расщепляется протеаза фурин. Единица S1 связывается с рецептором ACE2 [59], а единица S2 опосредует слияние вирусной и клеточной мембран [60].Более подробное обсуждение представлено в следующем разделе.

Рис. 23

Структура тримерного белка шипа из SARS CoV-2 (PDB ID: 7JJJ). Каждый протомер имеет свой цвет (например, красный, зеленый или синий) (Цветной рисунок онлайн)

Рис. 24

Структура шипового белка (PDB ID: 7JJJ, цепочка a : красный, цепочка b : синий, цепь c : зеленый) и выделены различные домены связывания рецептора (RBD, положения 319–541) для каждого протомера (зеленый, синий и красный). a Вид сбоку (вверху) и повернутый вид (внизу) RBD белка шипа. b Фрагмент S1 (положение 14–685) белка-шипа выделен для каждого протомера (красный, синий и зеленый), где протеаза, фурин, расщепляется (вид сбоку, вверху) (вид повернутый, внизу) и c S2-фрагмент (686–1273) белка-шипа (вид сбоку, вверху) (вид повернутый, внизу) (Цветной рисунок онлайн)

Роль белка-шипа в проникновении вируса в клетку-хозяин

Со многими конформациями спайк-белков, выявленных с помощью криоэлектронной микроскопии [61, 62], позволяет лучше понять динамический процесс проникновения вируса.Первоначально рецептор-связывающий домен (RBD) открывается (стадия (i) на Фигуре 28), чтобы легко связываться с белком ACE2 (стадия (ii)) на клетке-хозяине. Получающийся в результате белок-спайк связывается еще с двумя белками ACE2 с образованием белка-спайка, связанного с тремя белками ACE2 (стадии (iv) и (v)). Наконец, комплекс белка-шипа расщепляется фурином и TMPRSS2 с высвобождением фрагментов ACE2-S1 (этап (vi)) — фурин расщепляется по сайту S1 / S2 (см. Рис. 25, положение: 685–686), а TMPRSS2 расщепляется по участок S2 ′ (см. рис.25, позиция 816) [63, 64]. После расщепления остается домен S2 белка-шипа, который теперь подготовлен для проникновения вируса в клетку-хозяин [63].

Рис. 25

Последовательность спайкового белка SARS CoV-2. Выделены 22 остатка аспарагина (N), которые подвергаются гликозилированию. Субъединица S1: 14–685 [100], субъединица S2: 686–1273, сайт расщепления S2 ‘[61]: 816. NTD N-концевой домен, RBD рецепторный связывающий домен, слитый пептид FP , HR1 гептапептидный повтор (или гептадный повтор) последовательность 1, HR2 гептадный повтор 2, TM трансмембранный домен , CT домен цитоплазмы [101].»Отмечает расположение варианта 501Y.V1 красным цветом (H69, V70, Y144, (N501Y), A570D, P681H, T761I, S982A, D1118H — N501Y уже отмечен серым знаком« # »для варианта 501Y.V2) (Цветной рисунок онлайн)

Гликозилированных остатков на белке-спайке:

Белок-спайк имеет 22 различных сайта гликозилирования [65] на каждом протомере: N17, N61, N74, N122, N149, N165, N234, N282, N331, N343 , N603, N616, N657, N709, N717, N801, N1074, N1098, N1134, N1158, N1173, N1194 (позиции 1158, 1173 и 1194 недоступны в структуре, PDB ID: 7JJJ).Гликаны играют важную роль в укладке белков и уклонении от иммунной системы хозяина. Последовательность белка-шипа была отформатирована с помощью ProtParam и показана на рис. 25 [66]. Кроме того, сайты гликозилирования выделены желтым цветом в одном из протомеров на фиг. 26 (PDB ID: 7JJJ). Понимание сайтов гликозилирования важно, потому что было показано, что спайковый белок, продуцируемый вакциной, и спайковый белок вируса имеют разные паттерны гликозилирования [67].Помимо остатков аспарагина, O-связанное гликозилирование белков-шипов также наблюдалось по остаткам S325 и T323, что было определено с помощью масс-спектрометрии [68].

Рис. 26

Структура белка-шипа (протомера) с остатками аспарагина, которые подвергаются гликозилированию, выделены желтым (ID PDB: 7JJJ) (цветной рисунок онлайн)

Спайк-белок, связанный с ангиотензин-превращающим ферментом-2 (ACE2 )

Ангиотензин-превращающий фермент-2 (ACE2) является предполагаемым рецептором для SARS CoV-2, и недавно было показано, что человеческий рекомбинантный растворимый ACE2 блокирует инфицирование SARS CoV-2 в тканях человека [69].Сообщалось также о структуре белка-шипа со связанным ACE2 (PDB ID: 7A98) [70]. Для сравнения комплекса ACE2-шип-белок (PDB ID: 7A98) и шипового белка (PDB ID: 7JJJ) наложение структур показано на рис. 27 [60]. Более того, различные конформации, которым белок спайк претерпевает при связывании ACE2, были обнаружены с помощью криоэлектронной микроскопии [70]. Эти последовательные стадии тримера включают: (i) закрытую конформацию, (ii) открытую конформацию (только один рецептор-связывающий домен (RBD) указывает «вверх», два других RBD остаются «закрытыми»), но не связаны с ACE2 (аналогично MERS. Спайковая структура CoV с идентификатором PDB: 5X5U), (iii) один ACE2, связанный с RBD одного протомера, (iv) два ACE2, связанные с двумя протомерами в RBD, (v) три ACE2, связанные с тремя протомерами в RBD, и (vi) высвобождение мономерного комплекса S1-ACE2 (звено S1 включает остатки 14–685).Единица S1 сначала отщепляется протеазой фурином [59, 64] от клетки-хозяина [63, 71]. Сериновая протеаза, трансмембранная протеаза серин 2 (TMPRSS2), также известна как инициатор спайкового белка для входа в клетку путем расщепления в сайте S2 ‘(положение 816) [61]. Использование ингибитора TMPRSS2, мезилата камостата, блокировало управляемое SARS-2-S проникновение в клетки Caco-2 и Vero-TMPRSS2 (рис. 28) [72].

Рис. 27

Наложенные структуры (i) белка-спайка со связанным ACE2 (белок-спайк имеет голубой цвет, а белок ACE2 оранжевый, PDB ID: 7A98) и (ii) несвязанный белок-спайк (красный, PDB ID: 7JJJ ).Открытое состояние белка-шипа можно увидеть, когда белок ACE2 (оранжевый) связывается в RBD белка-шипа (голубой). a Вид сбоку и b повернутый вид ( a ) (Цветной рисунок онлайн)

Рис.28

Иллюстрация проникновения SARS CoV-2 в клетку-хозяин через ACE2-B0AT1 (B0AT1 также называется SLC6A19 , член семейства 6 растворимых носителей 19, натрийзависимый переносчик нейтральных аминокислот) [102] (PDB ID: 6M18) [102]. (i) Один рецептор-связывающий домен (RBD) (или два RBD — PDB ID: 7A93) [70] белка шипа ориентируется в открытой конформации (PDB ID: 6ZGG) [103] из закрытой конформации (PDB ID: 6VXX. ) [60], (ii) белок ACE2 связывается с RBD белка-шипа (PDB ID: 7KNE) [104], (iii) второй RBD «открывается» (PDB ID: 7A96) [70], (iv ) второй белок ACE2 связывается со вторым RBD белка-шипа (PDB ID: 7KMZ) [104], (v) третий белок ACE2 связывается с конечным RBD (PDB ID: 7KNI) [104], (vi) фурин и TMPRSS2 расщепляется по сайту S1-S2 и сайту S2 ‘белка-шипа, высвобождая комплекс ACE2-S1 (PDB ID: 7A92) [70] и, в свою очередь, оставляя домен S2 (PDB ID: 6XRA) [61] , который предназначен для входа в клетку-хозяин.В тримере домена S2 (PDB ID: 6XRA) показана последовательность белка-шипа из T912-N1173 и Q1180-L1197. Интересно, что белок-шип с двумя единицами RBD в открытой конформации также наблюдался с помощью крио-ЭМ (PDB ID: 7A93) [70] (цветной рисунок онлайн)

Спайковый белок, связанный с антителами

Существовали структуры спайковый белок, связанный с антителами. Эти антитела связываются с RBD белка шипа. Одно исследование показало, что антигенсвязывающий фрагмент (Fab) фрагмент нейтрализующего антитела (C105) образует комплекс с рецептор-связывающим доменом (RBD) белка-шипа (PDB ID: 6XCM) [73].В другом исследовании сообщалось о спайковом белке в комплексе с Fab-фрагментом нейтрализующего антитела S2A4 (PDB ID: 7JVC). Эти структуры доступны, как определено с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), и их суперпозиции с несвязанным белком-шипом (PDB ID: 7JJJ) показаны на рисунке 29.

Рисунок 29

a Spike белок ( голубой), связанный с Fab-фрагментом нейтрализующего антитела C105 (оранжевый) (PDB ID: 6XCM), наложенный на спайковый белок (красный, PDB ID: 7JJJ). b Повернутое изображение ( a ). c Спайковый белок (голубой), связанный с S2A4-нейтрализующим антителом Fab-фрагмент (зеленый) (PDB ID: 7JVC), наложенный на спайковый белок (красный, PDB ID: 7JJJ) (цветной рисунок онлайн)

Вариант спайка D614G Белок

Судя по первичному выравниванию последовательностей белков-шипов, остаток D614 консервативен как в SARS CoV-1, так и в SARS CoV-2. Тем не менее, штамм SARS CoV-2, содержащий остаток глицина (G) в положении 614, считается более распространенным во всем мире.Доступна структура этого варианта без рецепторсвязывающего домена (RBD), и было высказано предположение, что вариант D614G (PDB ID: 6XS6) белка шипа чаще принимает открытую конформацию по сравнению с вариантом D614 [74]. Структура варианта G614 белка-шипа, в котором отсутствует RBD (PDB ID: 6XS6), наложена на версию белка-шипа D614 на рис. 30.

рис. 30

Наложение структуры белка-шипа D614 ( красный, PDB ID: 7JJJ) и G614 (голубой, PDB ID: 6XS6).Жёлтым кружком обозначено местонахождение D614. Крио-ЭМ структура варианта G614 не имеет RBD, но находится в немного более «открытой» конформации. a — вид сбоку на спайковый белок, а b — повернутый вид (цветное изображение онлайн)

Если внимательно посмотреть на структуру спайкового белка, D614 образует солевой мостик с R634 (2,9 ангстрем, см. Рис. 31b). Кроме того, остаток лизина (K854) расположен на отдельном протомере, который, по-видимому, взаимодействует с D614 (на расстоянии 7,4 ангстрем).В варианте G614 эти солевые мостики отсутствуют, что свидетельствует о том, что тример белка шипа удерживается вместе менее плотно, когда аспартат (D) представляет собой глицин (G). Эта «более свободная» конформация с вариантом G614, возможно, могла бы объяснить, почему штамм D614G более заразен, чем штамм дикого типа. Более того, в комплексе ACE2 и шипа (PDB ID: 7A98) ионное взаимодействие между D614 и K854 усиливается, когда измеренное расстояние составляет 4,1 ангстрем (рис. 31d). В структуру комплекса ACE2-spike (PDB ID: 7A98) остаток R634 не включен.Это отсутствие взаимодействия между D614 и R634 в комплексе ACE2-шип подтверждает, что остаток D614 играет роль в сохранении «компактного» белка шипа, так что рецептор-связывающий домен (RBD) с меньшей вероятностью дойдет до связывания с Белок ACE2. Напротив, с вариантом G614, в котором отсутствуют эти межспиральные солевые мостиковые взаимодействия, белок-спайк более свободен в «открытой» конформации для взаимодействия с рецептором ACE2.

Рис. 31

a Показан солевой мостик между D614 и R634 в одном и том же протомере (красный цвет) спайкового белка.Другая аминокислота K854 из другого протомера (зеленый) взаимодействует с D614 (на расстоянии 7,4 ангстрем) (PDB ID: 7JJJ). b — увеличенная область взаимодействий солевого мостика (D614-R634 и D614-K854). Красный цвет — это один протомер, а зеленый цвет — второй протомер (K854 находится на отдельном протомере от остатка D614 на красном протомере — они находятся на расстоянии 7,4 ангстрем). Каждый протомер в тримере имеет разный цвет: красный, зеленый, синий. c В белке-шипе, связанном с ACE2, D614, K854 показан ближе к D614 (4.1 ангстрем), что указывает на стабилизирующую роль этого солевого мостика (PDB ID: 7A98). d Увеличенное изображение солевого мостика между D614 и K854 в комплексе спайк-ACE2 (на расстоянии 4,1 ангстрем) (цветное изображение онлайн)

Вариант 501Y.V1 белка Spike

В дополнение к штамму, который содержал изменение D614G в белке-шипе, другой штамм SARS CoV-2, обладающий N501Y (изменение аспарагина на тирозин в положении-501), был зарегистрирован в Соединенном Королевстве как на 10% более трансмиссивный, чем исходный штамм (линия 501N).Фактически, сообщалось о еще более трансмиссивном штамме, который на 75% более трансмиссивен, чем линия 501N, с дополнительными изменениями в последовательности белка-шипа помимо N501Y: делеция H69 и V70, делеция Y144, N501Y, A570D, P681H, * T716I, S982A и D1118H [75]. Эти позиции для этого варианта выделены на рис. 32. Этот конкретный штамм назывался 501Y.V1 и также обозначается как 501.V1, B.1.1 [76] или 20B (номенклатура Nextrain [77, 78]) [79 ]. Можно предположить, что делеция аминокислотных остатков H69 и V70 может потенциально усекать домен S1, что, в свою очередь, может заставлять белок-шип чаще оставаться в открытой конформации.Эта открытая конформация с большей вероятностью будет связываться с белком ACE2 на поверхности клетки-хозяина. Интересно, что позиция P681 является местоположением сайта расщепления фурином белка-шипа, и неясно, может ли изменение пролина на гистидин в этом штамме играть роль в влиянии на эту активность [59].

Рис. 32

a Спайковый белок (PDB ID: 7JJJ), протомеры которого окрашены по-разному (красный, зеленый и синий). Аминокислотные остатки, которые изменены в 501Y.Вариант V1 выделен желтым цветом. b Повернутое изображение. Желтым выделены: H69 и V70 (делеция), Y144 (делеция), N501 (Y), A570 (D), T716 (I), S982 (A) и D1118 (H) — положение P681 (H) не включен в структуру (Цветной рисунок онлайн)

Вариант 501Y.V2 белка-шипа

Недавно было сообщено о другом штамме SARS CoV-2, названном «501Y.V2», содержащем изменения в аминокислотных остатках белка-шипа. быть широко распространенным [80]. Этикетка 501Y.V2 взаимозаменяем с 501.V2, как это указано в литературе. Изменения этого варианта расположены в N-концевом домене: L18F, D80A, D215G, R246I, рецепторсвязывающем домене (RBD): K417N, E484K и N501Y, а также в позиции A701V. Эти конкретные положения выделены на фиг. 33. На границе раздела RBD с белком ACE2 выделены три остатка (K417N, E484K и N501Y). Интересно, что изменение в положении 501 аспарагина на тирозин (N501Y) вводит возможное катион-pi-взаимодействие между ароматическим остатком тирозина-501 на белке-шипе с положительно заряженным остатком лизина-353 на белке ACE2 (рис.34а). Остаток K417 находится на расстоянии 9,3 ангстрем от K26 в белке ACE2, что позволяет предположить, что преобразование остатка K417 в аспарагин (K417N), вероятно, приведет к водородной связи между карбонильным кислородом аспарагина (N417) на шиповом белке и лизином (K26). протон ACE2. Кроме того, изменение E484K потенциально может ввести солевой мостик между остатком K484 и E35 белка ACE2. Как показано на фиг. 31b, E484 находится на расстоянии 8,8 ангстрем от E35 белка ACE2. Следовательно, изменение положительного заряда в положении 484 остатка лизина (K484) должно усилить взаимодействие между белком-шипом и белком ACE2.Из-за более сильного взаимодействия между RBD (рецептор-связывающий домен) белка-шипа и ACE2 этот новый штамм SARS CoV-2 (501Y.V2) потенциально улучшает способность вируса проникать в клетки-хозяева. Хотя единственное сходство в последовательности белка-шипа между штаммом 501Y.V1 и штаммом 501Y.V2 — это остаток N501Y, вероятно, что другие аминокислотные изменения способствуют повышенной инфекционности каждого штамма. Например, изменение E484K в 501Y.V2 (которое отсутствует в 501Y.V1) вводит потенциальный солевой мостик (K484 белка шипа с E35 белка ACE2).С другой стороны, 501Y.V1 имеет делецию H69, V70 и Y144, которая потенциально может усекать NTD белка-шипа, заставляя белок-шип чаще принимать открытую конформацию. Факты о том, что (i) эти появляющиеся штаммы SARS CoV-2 (501Y.V1, 501Y.V2 и D614G) имеют изменения в последовательности белка-шипа и (2) недавние вакцины разработаны против белка-шипа исходного штамма, дает повод сосредоточить усилия на понимании того, чем эти новые штаммы отличаются от исходных.Интересно отметить, что было проведено исследование, в котором сыворотки 20 пациентов с вакциной BNT162b2 на основе мРНК COVID19 успешно нейтрализовали спайковый мутант SARS CoV-2 N501Y [81]. Однако этот конкретный мутант SARS CoV-2 обладал только мутацией N501Y, а не другими изменениями, присутствующими в 501Y.V1 или 501Y.V2. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования, посвященные всему набору аминокислотных вариаций, принадлежащих этим более трансмиссивным штаммам, для уверенной оценки эффектов изменений.

Рис. 33

a Структура белка-шипа с изменениями аминокислотных остатков варианта 501Y.V2 выделена: L18F, D80A, D215G, R246I, K417N, E484K, N501Y и A701V. b Повернутое изображение (Цветной рисунок онлайн)

Рис. 34

a Комплекс белок-белок ACE2 (PDB ID: 7A98). Сосредоточение внимания на остатках недавно описанного варианта: K417N, E484K и N501Y показаны в b и c . b E484 (шип) с K31 (ACE2) (расстояние также измеряется до E35 ACE2). c Показан N501 (спайк) с K353 (ACE2)

Избранные обновления исследований SARS CoV-2 — 23 новых белка SARS CoV-2

В одном примечательном отчете недавно были идентифицированы 23 ранее не идентифицированные вирусные открытые рамки считывания (ORF) ( Таблица 4), предполагая, что есть много других неизвестных свойств этого вируса, которые еще предстоит изучить [82]. Первоначальный подход к идентификации генов SARS CoV-2 был основан на сравнении последовательностей других известных бета-коронавирусов, особенно SARS CoV.Эти гены были идентифицированы путем определения местоположения последовательных открытых рамок считывания (ORF), которые начинаются с последовательности стартового кодона: AUG (также см. Вспомогательную информацию, раздел II, для стартовых кодонов AUG, которые были выделены в геноме SARS CoV-2) [83]. Однако вполне вероятно, что некоторые гены были пропущены в исходной характеристике по двум причинам: (i) тот факт, что некоторые стартовые кодоны AUG могут быть встроены в первоначально идентифицированные ORF (т.е. перекрывающиеся ORF) и (ii) некоторые стартовые кодоны имеют другая последовательность помимо канонической последовательности AUG [82] (например, CUG, ACG, AUU, AUC, UUG и AUG — см. Таблицы 4 и 5).Поэтому, чтобы идентифицировать новые белки, исследователи провели эксперименты по профилированию рибосом [84], в которых клетки Vero E6 (клетки почек африканской зеленой мартышки) и клетки Calu-3 (клетки рака легких человека) были инфицированы SARS CoV-2. По прошествии определенного времени клетки обрабатывали харрингтонином или лактимидомицином, которые останавливают инициирование рибосомами кодонов на мРНК и обеспечивают библиотеки инициации трансляции. Альтернативно, клетки обрабатывали циклогексимидом, который генерировал библиотеки элонгации трансляции (вместо библиотек инициации трансляции).В частности, лактимидомицин связывается с пустым E-сайтом большой 80S рибосомы, что позволяет изолировать рибосому строго в стартовом кодоне [85]. С другой стороны, связывание циклогексимида с рибосомой обратимо, и когда циклогексимид диссоциирует, рибосомы продолжают трансляцию мРНК, что делает возможным захват рибосомы ниже инициирующего кодона [86]. МРНК, которая была встроена в рибосому, была выделена и секвенирована, чтобы выявить новые белки. Комбинация библиотек инициации трансляции и библиотек удлинения трансляции позволила идентифицировать новые белковые последовательности.Таблицы 4 и 5 показывают 23 новых белка, идентифицированных в результате этого исследования. Среди недавно идентифицированных белков были внутренние ORF в рамке считывания (iORF), расположенные в пределах известных ORF (например, S.iORF1 (таблица 4, запись 6) — это внутренняя ORF, расположенная ниже стартового кодона AUG S-ORF), расположенные выше ORF ( uORF), внутренние трансляции вне рамки считывания и расширенные ORF (такие как M.ext, расширение ORF-M из 13 аминокислот, см. Таблицу 4, запись 11). Кроме того, это исследование показало, что трансляция вируса доминирует над трансляцией хозяина из-за повышенных уровней вирусных транскриптов.Идентификация белков может иметь важное значение при разработке новых вакцин и выяснении новых биохимических свойств SARS CoV-2.

Таблица 4 23 новых белка, идентифицированных в SARS CoV-2 в результате исследования профиля рибосом [82] клеток, инфицированных SARS CoV-2 (продолжение к Таблице 5) Таблица 5 23 новых белка, идентифицированных в SARS CoV-2 из исследования профилирования рибосом [82] клеток, инфицированных SARS CoV-2 (продолжение таблицы 4)

Вакцины

Самой многообещающей новостью стал успех вакцины против SARS CoV-2 (BNT162b1), которая показала свою эффективность быть 95% [87] эффективными [4].Эта вакцина представляет собой вакцину на основе РНК. BNT162b1 представляет собой РНК-вакцину с липидными наночастицами, которая кодирует тримеризованный домен связывания рецептора SARS CoV-2 (RBD) [3]. Вторая мРНК-вакцина (мРНК-1273), которая кодирует спайковый белок перед слиянием SARS CoV-2, также демонстрирует эффективность в выработке ответов антител [5, 88]. И даже другая вакцина (ChAdOx1 nCoV-19) также проходит 2/3 фазы клинических испытаний с многообещающими результатами [89]. ChAdOx1 — это вектор аденовируса шимпанзе, и исследователи разработали вакцину для доставки оптимизированного по кодонам полноразмерного спайкового белка SARS CoV-2 [90].По данным клинических исследований, ChAdOx1 nCoV-19 имел приемлемый профиль безопасности и был эффективен против симптоматического COVID-19 [91]. Новые вакцины становятся доступными [92] одновременно с появлением других вариантов SARS CoV-2. Эти недавние штаммы (D614G и 501Y.V2), возможно, обладают повышенной инфекционностью и стабильностью вирионов по сравнению с первоначально идентифицированным штаммом [93, 94]. Хотя предполагается, что эти новые мутации штаммов SARS CoV-2 не обладают повышенной трансмиссивностью [95], эта область исследований остается высокоприоритетной во всем мире.