Лада с автоматической коробкой передач: LADA XRAY Cross с автоматической трансмиссией – старт продаж

Содержание

Официальный сайт LADA

25.05.2021

Лидеры российского рынка автострахования совместно с АВТОВАЗом запустили массовые программы доступно

«Ингосстрах», «АльфаСтрахование», «Согласие», «Росгосстрах» и «ВСК» запустили специальные программы «умного» страхования (основанное на данных о фактическом использовании или UBI) для автомобилей LADA, подключенных к телематической платформе LADA Connect. Проект направлен на развитие рынка добровольного страхования автомобилей массового сегмента. Первым участником программы станет самый продаваемый в России автомобиль – LADA Granta. Новые массовые программы UBI сделают страхование существенно доступнее. При покупке автомобилей, оснащенных LADA Connect, единоразовая дополнительная скидка на полис КАСКО составит 10%. Кроме того, владельцы «подключенных» автомобилей смогут получать дополнительную скидку при продлении договора страхования до 30% в зависимости от качества вождения (скоринг вождения выполняется автоматически на основе данных телематики LADA Connect). Оливье Морне, вице-президент по продажам и маркетингу марки LADA: «LADA Connect – это новый уровень сервиса и комфорта для наших клиентов. Интеграция технологий Connected Car на этапе производства выполняет еще и важную социальную функцию, повышая доступность добровольного страхования. «Умное» страхование позволяет заметно снизить стоимость полиса. До этого момента его развитие, особенно в массовом сегменте, осложнялось тем, что затраты на установку оборудования могли себе позволить не все автовладельцы и страховые компании. Мы решили данную проблему на системном уровне». Автомобили Granta, оснащенные LADA Connect, уже доступны к заказу в Москве и Московской области, Санкт-Петербурге, Самарской области, Татарстане и в Пермском крае, а в ближайшие месяцы – по всей официальной дилерской сети.Работа LADA Connect основана на техническом решении компании «Лаборатория умного вождения», часть которого – телематическая платформа со специальной системой страхового скоринга обрабатывает данные о вождении и с согласия автомобилиста передает их страховым компаниям. На основе этих данных формируются индивидуальные предложения. Директор по развитию ООО «Лаборатория Умного Вождения» Тимур Кузеев: «Запуск LADA Granta, оснащенных LADA Connect, – эпохальное событие для страхового рынка России. Мы совместно с АВТОВАЗом и лидерами нашего страхового рынка проделали серьезную работу и создали уникальный для массового сегмента продукт, учитывающий лучшие международные практики и опыт, который в перспективе нескольких лет может вывести нашу страну в мировые лидеры по количеству программ UBI. Это значительно повысит инвестиционную привлекательность нашего рынка для глобального автобизнеса». Индивидуализация страховых тарифов выполняет ряд важных общественно значимых функций. По мнению участников рынка, распространение UBI-программ приведет к заметному повышению безопасности движения, сделает страховые продукты доступными для начинающих водителей, прививая им ответственный подход к использованию автомобиля, снизит уровень страхового мошенничества и обеспечит доступ к КАСКО в массовом сегменте, изменяя отношение к страхованию в обществе. Член правления ПАО «Росгосстрах» Елена Белоусенко: «Запуск UBI-программ для LADA Granta, оборудованных LADA Connect, приведет к повышению устойчивости и стимулирует развитие российского рынка автострахования. Индивидуализация скоринга по характеру вождения, позволяет персонализировать оценку. На практике это означает, что для клиента отпадет необходимость платить за чужие риски, и мы сможем предлагать более доступные тарифы, которые сделают КАСКО привлекательным продуктом в массовом сегменте. Мы рады быть участником такого масштабного проекта и считаем, что именно «умное» страхование – это ключевой фактор формирования массового устойчивого страхового рынка».При пролонгации скидка за аккуратное вождение будет суммироваться со стандартным страховым коэффициентом бонус-малус, что снизит стоимость полиса для аккуратных водителей до 50%. Такое снижение цен, как ожидают страховщики, позволит заметно повысить проникновение добровольного автострахования в нашей стране.Директор по маркетингу АО «РН-Банк» Алла Кибизова: «РН Банк, как оператор программ страхования для брендов Альянса, в который входит бренд LADA, видит своей миссией предоставление максимального уровня сервиса клиентам Альянса. Запуск «умного» страхования, с одной стороны, позволит клиентам LADA получать более выгодные условия по страхованию от крупнейших страховщиков, а c другой – выступит драйвером для дальнейшего развития технологий «умного» страхования на российском рынке. Мы видим запуск такого масштабного проекта примером успешной коллаборации крупнейших игроков автомобильного и страхового рынков с целью создать уникальный продукт с высокой клиентской ценностью».Платформа LADA Connect работает по принципу «черного ящика», собирая данные, которые помогают восстанавливать обстоятельства ДТП. Это упрощает и существенно ускоряет процедуру страхового урегулирования, позволяя для удобства автомобилистов частично автоматизировать бюрократические процедуры и переносить их в онлайн. Кроме того, за счет интеграции этой технологии у автовладельцев появится возможность урегулировать убытки без предоставления справок из компетентных органов по событиям, зафиксированным платформой LADA Connect. Заместитель генерального директора по розничному бизнесу СПАО «Ингосстрах» Алексей Власов: «Мы активно работаем с «умными» программами с 2015 года, но их доля в структуре нашего портфеля пока невелика. Причина в достаточно высоких операционных расходах на само оборудование, его установку и подписку на информационный обмен. При этом выгоды таких программ очевидны для нашей компании как в части сбора скоринговых данных и возможности контроля убытков, так и в части развития продуктового предложения «Ингосстраха». Мы крайне позитивно оцениваем внедрение Connected Car с телематическим функционалом от крупнейшего автопроизводителя в стране». Одним из преимуществ LADA Connect является пересекающаяся интеграция данных, которая создает единую экосистему коммуникации между партнерами и участниками проекта. Например, автовладелец сразу после оформления договора страхования сможет видеть условия страховой программы в мобильном приложении LADA Connect. Там же он сможет отслеживать свой текущий скоринговый балл для скидки на пролонгацию. Руководитель практики Affinity ООО «Страховой Брокер Виллис СНГ» Аррожейро Элдер Жорж Мартинью и Генеральный директор ООО «АСТ» (генеральный партнер Willis Towers Watson по розничному автострахованию в России) Каро Карапетян: «Оформление договоров страхования в дилерских центрах LADA реализуется через централизованную IT-систему выпуска полисов, разработанную партнером RCI Group (АО «РН-Банк» — банк Альянса Renault-Nissan-Mitsubishi) международным брокером Willis Towers Watson (NASDAQ: WLTW), внедренную и обслуживаемую совместно с ООО «АСТ». Это позволяет оптимизировать процесс работы со страховой документацией в одной системе, а также вести единую отчетность со страховщиками. Процесс полностью автоматизирован для дилеров и автопроизводителя, что значительно упрощает процесс работы и управления. Внедрение «умных» программ позволит реализовать дополнительную сервисную поддержку для Клиентов и значительно упростит сопровождение при наступлении страховых случаев». Мировая практика развития «умного» страхования предполагает два пути. Первый – интеграция телематических решений страховыми компаниями, которые продают или дают в аренду «черные ящики» автовладельцам на время действия полиса. Второй – формирование страхового продукта на основе данных, собираемых системой, интегрированной на этапе производства. Второй подход привел к бурному росту «умного» страхования в ЕС, США и Китае в последние годы. В России в силу низкого проникновения добровольного автострахования и исторических особенностей рынка первый путь оказался неэффективен. На этом фоне интеграция телематических систем такими крупными производителями, как АВТОВАЗ, будет стимулировать рынок и повлечет за собой существенный рост проникновения не только «умного» КАСКО, но и добровольного автострахования в целом.Заместитель генерального директора по развитию бизнеса ВСК Ольга Сорокина: «Мы рады старту нового проекта с АВТОВАЗом. Недавно мы обновили программу «Умное КАСКО» для удобства потребителей, оптимизировав внутренние процессы компании с интеграцией оператора телематики. Запуск серийного производства автомобилей LADA с телематической платформой Connected Car позволит реализовать специальные страховые программы и предложить новые возможности для наших клиентов. Благодаря проекту аккуратным водителям будут доступны более персонифицированные условия страхования по КАСКО, дополнительная скидка на страховку автомобиля».По данным ЦБ в 2020 году проникновение КАСКО к ОСАГО в России составило 9,6%. Это очень скромный по мировым меркам результат. Для сравнения, в ЕС этот показатель достигает 78%. Распространение «умного» страхования в массовом сегменте рынка позволит увеличить его, не повышая убытки страховых компаний, что в перспективе может привести к еще большей доступности добровольного страхования.Директор департамента андеррайтинга автострахования АО «АльфаСтрахование» Илья Григорьев: «Наша компания стратегически нацелена на развитие современных программ и технологий, позволяющих улучшать качество клиентского сервиса и портфеля. Благодаря запуску LADA Granta, оснащенных LADA Connect, мы видим большие возможности синергии использования сервисов Connected Car и потенциал для развития современных страховых программ». Лежащая в основе принципа работы «умного» страхования индивидуализация страхового предложения происходит на основе данных о фактическом вождении – сколько и где автомобиль ездит, как часто водитель нарушает правила, превышает скорость или совершает опасные маневры. Сбор этих данных происходит тремя путями: через так называемые «черные ящики» – стационарно установленные в авто подключенные к сети интернет-устройства с акселерометром и GPS/ГЛОНАСС чипом, через мобильные приложения или простые GPS-трекеры. АВТОВАЗ пошел по самому технологичному и перспективному пути, выбрав для своих автомобилей продвинутую «подключенную» систему, которые в мировой практике пока редко применяется при производстве автомобилей массового сегмента. Андрей Ковалев, Директор по розничному андеррайтингу и партнерским продажам страховой компании «Согласие»: «ООО «Согласие» является партнером LADA Страхование с момента запуска программ от автопроизводителя в партнерстве с АО «РН-Банк». Мы следили за ходом реализации проекта и ждали запуск LADA Granta, оснащенных LADA Connect. Функционал автомобиля и телематической платформы позволяет нам вести контроль статистики и убытков в режиме онлайн. В наших планах наращивать продажи специальных программ для «подключенных автомобилей» — это позволит вывести управление продуктами на новый современный уровень и предложить для наших клиентов новые сервисные возможности». LADA Connect позволяет владельцу удаленно управлять функциями автомобиля при помощи смартфона, а также получать статистическую информацию об использовании автомобиля, которая помогает контролировать эксплуатационные расходы и вести удаленную коммуникацию с дилерскими центрами LADA и Автопроизводителем. Генеральный директор «Лаборатории Умного Вождения» Михаил Анохин: «Создание современной цифровой экосистемы вокруг автомобилей LADA открывает новые возможности для автовладельцев и связанных с автомобилями бизнесов. Запуск программ доступного UBI-страхования стало одним из первых подобных решений. Надеюсь, что наши совместные разработки послужат надежным связующим звеном между страховыми компаниями и автомобилистами и это позволит покупателям LADA получить самый доступный и удобный страховой продукт на рынке».***Контакты PR-Служб: АО «АВТОВАЗ» — (8482) 75-77-15, +7 (499) 263-08-50, e-mail: [email protected] ПАО «СК «РОСГОССТРАХ» — Бирюков Андрей Аскольдович (Andrey Biryukov), Руководитель блока PR ПАО «СК «РОСГОССТРАХ», Моб.: +7-910-404-94-56, e-mail: [email protected]СПАО «Ингосстрах» — Людмила Мегаворян, Пресс-секретарь, Моб.: +7 915 402 02 10, [email protected] САО «ВСК» — Ларин Павел, Руководитель направления по связям с общественностью Департамент маркетинговых коммуникаций и PR, Блок развития бизнеса, Тел. : +7 (495) 7274444, доб. 2962, Моб.: +7 926 503-17-00, [email protected] ООО «СК «Согласие» — Елена Григорьева, Моб.: +7 903 599 35 59, Олеся Карпова, Моб.: +7 926 911 00 38, e-mail: [email protected]АО «АльфаСтрахование» — Карцева Мария, Руководитель PR-Службы АО «АльфаСтрахование», Моб.: +7 962 923-74-49, e-mail: [email protected] ООО «АСТ» — Наталья Дегтярева, Директор по маркетингу и развитию, Моб.: +7-903- 100-45-72, e-mail: [email protected] ООО «Лаборатория Умного Вождения» — Александр Корольков, +7-915-497-65-75, e-mail: [email protected] ***Группа »АВТОВАЗ» является частью бизнес-подразделения Dacia-LADA в структуре Groupe Renault. Компания производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для 2-х брендов: LADA и Renault. Производственные мощности АВТОВАЗа расположены в Тольятти – АО »АВТОВАЗ”, ОАО “LADA Запад Тольятти”, а также в Ижевске – ООО »LADA Ижевск». Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в более чем 20 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.ПАО СК «Росгосстрах» — флагман отечественного рынка страхования. На территории Российской Федерации действуют около 1 500 офисов и представительств компании, порядка 300 центров и пунктов урегулирования убытков. В компании работает около 50 тысяч сотрудников и страховых агентов. «Росгосстрах» входит в Группу «Открытие» — один из крупнейших финансовых холдингов нашей страны, и является стратегическим провайдером страховых продуктов и услуг в компаниях группы «Открытие».СПАО «Ингосстрах» — работает на международном и внутреннем рынках с 1947 года, занимает лидирующие позиции среди российских страховых компаний.«Ингосстрах» имеет право осуществлять все виды имущественного страхования, добровольное медицинское страхование и страхование от несчастных случаев и болезней, установленные ст.32.9 Закона РФ «Об организации страхового дела в Российской Федерации», а также перестраховочную деятельность. Компания присутствует в 251 населенном пункте РФ. Представительства и дочерние компании страховщика работают в странах дальнего и ближнего зарубежья.Страховой Дом ВСК (САО «ВСК») работает с 1992 года и является универсальной страховой компанией, предоставляющей услуги физическим и юридическим лицам на всей территории России. Компания стабильно входит в ТОП-10 страховщиков страны по сборам в основных сегментах страхового рынка – автостраховании, страховании от несчастных случаев и болезней (НС) и добровольном медицинском страховании (ДМС). На сегодняшний день более 30 млн человек и 500 тысяч организаций воспользовались продуктами и услугами ВСК. Региональная сеть компании насчитывает свыше 500 офисов во всех субъектах России, что дает возможность эффективно сопровождать договоры страхования по всей стране.ООО «СК «Согласие» входит в единую страховую группу с ООО «Согласие-Вита» и успешно ведет свою деятельность на страховом рынке уже более 27 лет. Внутренняя политика Компании позволяет нам уверенно удерживать высокие позиции на страховом рынке и ежегодно увеличивать число страхователей. Группа «АльфаСтрахование» – крупнейшая частная российская страховая группа с универсальным портфелем страховых услуг, который включает как комплексные программы защиты интересов бизнеса, так и широкий спектр страховых продуктов для частных лиц. Услугами «АльфаСтрахование» пользуются более 31 млн человек и свыше 106 тыс. предприятий. Региональная сеть насчитывает 270 филиалов и отделений по всей стране. Надежность и финансовую устойчивость компании подтверждают рейтинги ведущих международных и российских рейтинговых агентств: «ВВ+» по шкале Fitch Ratings, «ВВB-» по шкале S&P и «ruАAA» по шкале «Эксперт РА» и «ААА ru» по шкале «Национального рейтингового агентства».«РН-БАНК» – «Банк Альянса Renault-Nissan-Mitsubishi». Почти вековая история Банковской Группы Рено берет свое начало в 1924 году во Франции. Сейчас Группа представлена в 36 странах мира, а на российском рынке оказывает поддержку клиентам, выбирающим продукцию брендов Альянса, с 2006 года. Приоритетными направлениями деятельности Банка являются: кредитование физических лиц на приобретение автомобилей брендов Альянса, финансирование дилеров брендов Альянса, а также оказание клиентам сопутствующих финансовых услуг. По состоянию на конец 1 квартала 2021 года Банк занимает 52 место по размеру активов среди российских банков по версии Интерфакс, поднявшись на 6 позиций за 15 месяцев.Willis Towers Watson — ведущая международная консалтинговая и брокерская компания, разрабатывающая современные бизнес-решения, которые помогают нашим клиентам по всему миру преобразовывать риски в возможности развития и роста. Наша компания была основана в 1828 г., и в настоящее время насчитывает 45 000 сотрудников, предоставляющих услуги для более чем 140 стран и рынков. «Страховые брокеры «АСТ» — являются одним из ведущих страховых брокеров, оказывающих полный спектр страховых брокерских услуг и услуг в области риск консалтинга с 2007 года. ООО «Страховые брокеры «АСТ» оказывают страховые брокерские услуги по всем видам страхования, а также не противоречащие законодательству Российской Федерации сопутствующие консультационные услуги в области управления рисками.«Лаборатория умного вождения» – российский разработчик универсальной автомобильной телематической платформы и системы LADA Connect. Созданные в «Лаборатории умного вождения» аппаратно-программные решения превращают автомобиль в подключённое к сети Интернет устройство. Специалисты «Лаборатории умного вождения» оказывают адаптированный под каждого клиента набор услуг – от круглосуточного мониторинга состояния автомобиля и защиты от угона до анализа эксплуатационных параметров, контроля расходов и оценки безопасности вождения. Страховым компаниям решения «Лаборатории умного вождения» помогают провести селекцию страхового портфеля и сформировать индивидуальные страховые тарифы для клиентов. Автопроизводителям и автопаркам – внедрить инновационные подходы в бизнесе.

LADA Vesta получит автоматическую трансмиссию

LADA запускает производство автомобилей LADA Vesta с бесступенчатой автоматической трансмиссией. Новая версия автомобиля является частью стратегии Бренда по расширению модельного ряда и повышает комфорт водителя и пассажиров.

Бесступенчатая трансмиссия японской марки Jatco широко применяется на автомобилях Альянса Renault-Nissan, а с июля 2019 года предлагается покупателям на LADA XRAY Cross. Основная особенность автоматической трансмиссии в том, что, помимо клиноременной передачи с мощным стальным ремнём, здесь работает двухступенчатый редукторный сектор. Это решение позволило сделать агрегат компактнее и на 13% легче, чем предыдущие образцы. Такая конструкция повышает тяговые характеристики и при этом не боится морозов, пробуксовок и тяжелых нагрузок, а, кроме того, при уверенном ускорении обеспечивает высокий акустический комфорт и топливную экономичность.

Совместно с автоматической трансмиссией на LADA Vesta впервые установлен 113-сильный двигатель Альянса HR-16. В процессе адаптации трансмиссии для использования на LADA Vesta были разработаны новые калибровки силового агрегата, применена оригинальная система выпуска, новые привода колес, модернизированные опоры силового агрегата. Комплекс инженерных решений позволил сохранить массу автомобиля и дорожный просвет: 178 мм у базовых версий и 203 мм у модификаций Cross. Модели семейства LADA Vesta с данным типом трансмиссии прошли полный цикл испытаний. 39 автомобилей приняли участие в дорожных тестах в суммарном объеме 1 млн километров, а также в лабораторных и климатических испытаниях: в Сургуте — при температуре минус 47 градусов Цельсия и в Тамани при +40С.

Новую коробку передач, существенно повышающую комфорт вождения, получат следующие автомобили семейства: седан и седан Cross, SW и SW Cross. С выходом новой модели в цветовой гамме LADA Vesta появится новый синий цвет »Дайвинг». Подробная информация о ценах и комплектациях модельного ряда Vesta с автоматической трансмиссией будет опубликована позднее.

Группа «АВТОВАЗ» является частью бизнес-подразделения Dacia-LADA в структуре Groupe Renault. Компания производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для 2-х брендов: LADA и Renault. Производственные мощности АВТОВАЗа расположены в Тольятти – АО «АВТОВАЗ”, ОАО “LADA Запад Тольятти”, а также в Ижевске – ООО «LADA Ижевск».

Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в более чем 20 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.

Тест-драйв первой Lada Granta с автоматической коробкой передач

https://ria.ru/20120724/707482729.html

Тест-драйв первой Lada Granta с автоматической коробкой передач

Тест-драйв первой Lada Granta с автоматической коробкой передач — РИА Новости, 29.02.2020

Тест-драйв первой Lada Granta с автоматической коробкой передач

«АвтоВАЗ» начнет продажу Lada Granta с автоматической коробкой передач в августе 2012 года. Смотрите на видео РИА Новости тест-драйв первого отчественного серийного автомобиля с четыресхтупенчатой АКПП.

2012-07-24T11:10

2020-02-29T15:43

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdn24.img.ria.ru/images/sharing/article/707482729.jpg?7075342781582980208

россия

самара

тольятти

самарская область

РИА Новости

internet-group@rian. ru

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2012

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Тест-драйв первой Lada Granta с автоматической коробкой передач

2012-07-24T11:10

true

PT3M11S

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

россия, автопром, самара, тольятти, ситуация в автопроме. июль 2012, экономика. видео — видео, видео, эфир , наука — видео, самарская область

11:10 24.07.2012 (обновлено: 15:43 29.02.2020)

Статьи | Автосалон Гэмбл — официальный дилер LADA в Самаре

Компания «Лада Гэмбл» занимается реализацией автомобилей от ведущих производителей в Самаре. В рамках сотрудничества с отечественными производителями мы получили возможность выступать в качестве официального дилера. Теперь у нас доступен весь модельный ряд Лада. Наши специалисты уделяют большое внимание анализу новостей автомобильной тематики. Самой актуальной новостью в последнее время является автоматическая коробка передач Jatco на «Лада Гранта». Данная модель пользуется большим спросом среди потребителей не только из-за своей низкой стоимости, но и из-за нового формата комплектации, который дополнился автоматической трансмиссией. Купить лада гранта в Самаре можно в нашем автосалоне.

Автоматическая коробка передач является продукцией Японской фирмы Jatco. Ее принято относить к классу «Мини». Она предназначена для использования на небольших автомобилях. Конструкция трансмиссии представлена в формате поперечного расположения, что обуславливает ее применения на автомобилях с передним приводом. Единственное ограничение – объем двигателя, который не должен превышать 1,6 литра. Функционирование коробки передач осуществляется за счет электронного управления. Лада гранта 2020 купить можно в нашем магазине на выгодных условиях.

Режимы коробки передач:

«P» — паркинг;
«N» — нейтральная передача;
«R» — задняя передача;
«D» — движение вперед.

При этом в стандартной комплектации представлены дополнительные режимы. Коробка включается в себя гидроблок, планетарную передачу, трансформатор. Кроме того нельзя забыть о фрикционах и дисках. Купить новую ладу в Самаре по доступным ценам можно в нашем магазине.

Продолжительность работы автоматической передачи определяется на основе соблюдения правил использования и обслуживания трансмиссии. В данном случае речь идет о процедуре замены масла и правильном вождении. Замена масла должна производиться с помощью качественной трансмиссионной жидкости. Также необходимо каждые 200 тыс. км пробега осуществлять замену внешнего фильтра тонкой очистки.

В случае выхода из строя компонентов трансмиссии, рекомендуется обратиться за помощью к квалифицированным специалистам. В большинстве случаев ремонт обходится недорого. Все запчасти можно приобрести в автомагазинах или заказать в интернете. Мы предлагаем своим клиентам весь модельный ряд Лада, в том числе у нас можно приобрести Ладу Веста всех комплектаций.

Ремонт АКПП LADA в Москве, цены на ремонт автоматической коробки передач

Компания АвтоГЕРМЕС является официальным дилером LADA в Москве и предоставляет все услуги по слесарному ремонту моделей бренда.

Автоматическая коробка передач — одна из самых сложных систем современного автомобиля, обеспечивающая его передвижение. Как и любой механизм, трансмиссия нуждается в периодическом проведении диагностики и ремонте. АКПП состоит из множества взаимосвязанных элементов, поэтому доверить эту работу лучше специалистам, имеющим профессиональное оборудование, рекомендуемое заводом-производителем.

Вы получите полный спектр услуг по ремонту автоматической коробки передач Вашей модели LADA в АвтоГЕРМЕС. Опытные автослесари с помощью современного высокоточного оборудования выполнят качественно и быстро следующие виды работ:

Диагностику и обслуживание АКПП;
Ремонт трансмиссии;
Замена масла;
Замену коробки переключения передач и прочее.

Основные признаки неисправности автоматической коробки передач:

Шум или гул в трансмиссии;
Течь масла из КПП;
Рывки или удары при переключении передач;
Нарушение плавности хода.

При появлении первых признаков неисправности отправляйтесь в сервисный центр для диагностики автомобиля.

Преимущества обслуживания в сервисных центрах АвтоГЕРМЕС

Обращаясь в любой из техцентров АвтоГЕРМЕС, Вы можете быть уверены в том, что:

В сервисных центрах работают мастера с отличной профессиональной подготовкой;
Все работы по сервису выполняются в соответствии с требованиями производителя;
Для замены деталей используются исключительно оригинальные запчасти;
Автодилер гарантирует прозрачные цены без скрытых и дополнительных платежей.

Если Вы являетесь корпоративным клиентом, то можете воспользоваться специальной программой, предусматривающей гибкую систему скидок на ряд услуг сервиса.

Приглашаем Вас в сервисные центры официального дилера АвтоГЕРМЕС для ремонта АКПП Вашей LADA! Доверьте эту работу профессионалам!

Две коробки. Какие автоматы Lada и УАЗ теперь ставят на свои машины? | Об автомобилях | Авто

С момента начала продаж Lada Vesta в 2015 году потребители заваливали представителей «АвтоВАЗа» вопросами о том, когда же на машине появится автоматическая коробка передач. Ведь чуть ли не треть всех конкурирующих с ней Hyundai Solaris продаются с современным 6-ступенчатым корейским автоматом.

Покупатели готовы были платить за возможность езды с двумя педалями, однако французские инвесторы и руководство «АвтоВАЗа» не спешили внедрять на Vesta современные коробки. Слишком высокой оказывалась цена, а использовать на флагманской модели старый 4-ступенчатый французский агрегат с Renault они не хотели по маркетинговым соображениям. Немного погодя автомат на Lada все-таки появился. Это был старый японский 4-ступенчатый агрегат Jatco родом из 2000-х годов. Но доступен он был только на Granta, которая в модельной иерархии стоит на ступеньку ниже Vesta. А для флагманской модели бренда по-прежнему предлагался лишь робот AMT, изготовленный путем соединения российской 5-ступенчатой механической ручной коробки с немецким управляющим мехатроником ZF.

Как будут выглядеть новые универсалы Lada Vesta SW Cross и Vesta SW

Как рассказывал бывший генеральный директор Lada Николя Мор, в течение нескольких лет французы старались создать условия для долговременного внедрения на российские машины современных автоматических трансмиссий японского производства. Однако для этого требовалось подготовить возможность их последующего производства в Тольятти.

И вот сейчас такое окно возможностей открылось. Сразу две модели Lada — Vesta и X-Ray — получили японский вариатор Jatco.

Две ступени у вариатора

Крупнейший производитель трансмиссий в Японии — компания Jatco. Она входит в альянс Renault-Nissan, который имеет контрольный пакет акций «АвтоВАЗа». Коробка рассчитывалась специально для использования на машинах с поперечным расположением мотора малой мощности и способна справляться с нагрузкой в 180 Нм. Такой момент развивают обычно 1,6-литровые бензиновые агрегаты. В Россию автоматическая коробка будет поставляться только со 113-сильным 1,6-литровым французским агрегатом, который откалиброван специально для этой трансмиссии.

Коробка имеет двухступенчатый планетарный редуктор, помогающий более эффективно работать в экстремальных режимах езды по раскисшим дорогам. Во время движения по грязи или в снегу, когда часто возникают пробуксовки, включается первая ступень, которая работает как раздатка у внедорожников. Она фактически понижает передаточное отношение бесступенчатого вариатора. В этом случае его металлический ремень не попадает в крайние положения конусов, благодаря чему повышается их ресурс.

Вторая ступень включается на скоростных трассах и переводит вариатор в режим нормальной работы.

Вариатор оснащается блокируемым гидротрансформатором, который помогает плавно стартовать и двигаться без рывков на малых скоростях в дорожных заторах.

Модернизированный вариатор будет устанавливаться на все семейство Vesta, включая внедорожную версию Cross. Эта же коробка сейчас применяется на Logan.

С новой автоматической трансмиссией и мотором Lada Vesta сохранила прежний дорожный просвет, который составляет 178 мм у седанов и 203 мм — у версий Cross.

Из Индии в Ульяновск

Новую автоматическую коробку получил и «УАЗ Патриот». Вместе с усовершенствованным бензиновым агрегатом объемом 2,7 литра и мощностью 150 л. с. теперь будет ставиться индийская автоматическая 6-ступенчатая трансмиссия Powerglide 6L50.

«Буханка» и ещё 8 легендарных автомобилей, которые не сходят с конвейера

Этот агрегат является лицензированной копией автомата General Motors Hydromatic. Лицензия на нее была куплена фирмой Tata. Ранее такие же 6-ступенчатые автоматические трансмиссии устанавливались на пикапы Chevrolet Colorado, на седан Cadillac CTS, а также на другие модели GM. Сейчас они уступили место 8-ступенчатым коробкам Hydromatic.

По заявлениям представителей УАЗ, трансмиссия для российского рынка собирается на заводе Powerglide во французском Страсбурге и поступает на ульяновский завод с маслом Dexron-VI.

Система охлаждения коробки поступает во Францию из Кореи, а блок управления с электроникой — из Китая. Новый автомат комплектуется также индийской раздаточной коробкой Divgi-TTS.

Ресурс у Powerglide 6L50 довольно большой. Агрегат рассчитан на работу с двигателями объемом до 5,3 л, мощностью до 350 л. с. и с крутящим моментом до 500 Нм. Моторесурс эквивалентен пробегу в 200 тысяч километров. С новым автоматом «УАЗ Патриот» стал заметно экономичнее.

Тест-драйв LADA Granta: теперь — на «автомате»

Впервые в практике российского автомобилестроения на рынок вышла массовая модель с АКПП.

Вообще-то любой тест автомобиля — это по-любому драйв. Поэтому на испытания новенькой модели LADA Granta в пятигорском автосалоне «ТСС Кавказ» по ул.Делегатской, 97 собралось немало зрителей. А что в ней, собственно, может быть новенького? А то, что отныне наши российские «Ладушки» будут ездить на автомате. И это с успехом показал тест-драйв, который прошел в минувшие выходные. Могут, и хорошо ездят!

LADA НАША — АВТОМАТ ЯПОНСКИЙ

Как рассказали в салоне, для оборудования наших автомобилей коробкой автоматом АВТОВАЗ выбрал японскую фирму Jatco (дочерняя структура Nissan), которая выпускает АКПП в городе Фуджи. Полная инструкция к карепрост и дримлаш Их АКПП -надежны, проверены, долговечны. Прошлым летом АВТОВАЗ уже начал продажи LADA Granta с «автоматом». Новинка, что называется, пошла, и теперь тольяттинский завод планирует в 2013 году произвести около 60 тысяч автомобилей с АКПП. Аналогичную трансмиссию получит и LADA Kalina второго поколения, производство которой начнется в 2013 году.

Конструктивные особенности новенькой LADA с АКПП заключаются, прежде всего, в том, что автоматическая коробка передач AY-K3 — это классический «автомат», 4-ступенчатый, с гидротрансформатором, управление актуаторами происходит за счет изменения давления масла.

— Для обгонов на трассе и движения в горах есть кнопка отключения овер-драйва, то есть высшей передачи, — рассказал генеральный директор ООО «ТСС Кавказ» Владимир Ястребов. — В этом случае АКПП не переключается выше 3-й передачи. Есть также режимы, когда АКПП не переходит выше первой или выше второй передач. Одна из особенностей АКПП на LADA Granta — «виртуальная пятая передача». Во время движения на 4-й передаче (более 50 км/час) при дальнейшем открытии дроссельной заслонки размыкается конвертер, и автомобиль движется в более щадящих и экономичных режимах. При этом коробка передач снабжена различными системами защиты. К примеру, можно при скорости в 140 км/час перевести селектор из положения D в положение R, и ничего не произойдет — АКПП включит задний ход только после полной остановки автомобиля.

В зимнее время нет необходимости прогревать коробку перед движением — она сама не будет переключать передачи выше второй, пока не прогреется. АКПП рассчитана на крутящий момент в 150 Н/м, но конструктивно есть запас до 180 Н/м. Передаточное число — 4,08.

В НАРОД — БЕЗ ТОРМОЗОВ

Новенькие автомобили сразу же вызвали интерес у пришедших на тест-драйв, так что сотрудники автосалона едва успевали отвечать.

— Ну а что изменилось с установкой в вашей машине коробки передач? — допытывался один из автолюбителей.

— В общей сложности, на автомобиле появилось 30 новых деталей и узлов, — разъяснил заведующий автосалоном ЛАДА Евгений Марданов.

— Стал более объемным и эффективным радиатор охлаждения двигателя (с секцией для охлаждения масла АКПП), появились новые растяжки передней подвески (т. к. АКПП существенно больше по размерам, чем МКПП), новые опоры силового агрегата (т. к. он стал тяжелее на 30 кг), более жесткие пружины передней подвески (аналогичны LADA Kalina Sport), новый литой масляный поддон двигателя (с точками крепления к картеру гидротрансформатора — для большей жесткости силового агрегата). Изменены жгуты проводов, маслозаборник двигателя, введен 6-позиционный тросовый привод АКПП. Увеличена загрузка катколлектора драгметаллами (поскольку нагрузка на мотор повысилась, а эко-нормы Евро-4 выполнять необходимо). Изменены калибровки электронной системы управления двигателем.

МЕЖДУ ТЕМ

После установки «автомата» автомобиль прошел цикл испытаний — ресурсные, ударные… Настройки двигателя и трансмиссии, система охлаждения отрабатывались на стендах, в горных условиях (Алтай), в условиях сильных морозов (Сургут). Совершались заезды по грунтовкам, по специальной булыжной дороге. Особенно это было интересно с учетом более низкого клиренса — практика показала, что проходимость автомобиля практически не пострадала. При этом срок службы АКПП и гарантийный срок — не изменились. Тем временем, специалисты АВТОВАЗ и партнеров постарались сделать работу трансмиссии более осязаемой для водителя. Зачастую автомобили-аналоги по динамике напоминают электровоз — все происходит слишком плавно.

Но первый же проехавшийся на тест-драйвовой новинке доброволец отметил, что интенсивность разгона ощутимо меняется в зависимости от воздействия на педаль акселератора.

Говоря проще: «как давишь, так и едешь», — отметил он. — А в целом здорово, автомобиль от этого только выиграл.

Попробовать прокатиться в этот день на новенькой LADA Granta можно было любому, и конечно, интерес автолюбителей к новинке показал: автомобиль стал удобнее и способен завоевать народное признание.

Подробнее о новом автомобиле можно узнать: ООО «ТСС Кавказ», г. Пятигорск, ул. Делегатская, 97, тел. (8793) 38-37-34

ООО «ТСС Кавказ», г. Пятигорск, Татьяна КОЛИНА

Понимание FRET как инструмента исследования сотовой связи

Измерение FRET, основанное на количественной оценке сенсибилизированного излучения акцептора, является наиболее надежным среди всех методов, основанных на интенсивности. Сенсибилизированное излучение акцептора — это количество излучения акцептора в канале FRET из-за резонансной передачи энергии возбуждения от донора к акцептору [59]. Одновременное измерение индивидуального излучения флуоресценции от донора и акцептора от одного и того же образца, по сравнению с несколькими образцами, исключает проблемы, связанные с вариациями, такие как изменения плотности донора или квантового выхода флуоресценции [59,68].Тем не менее, оценки FRET более точны и их легче выполнять в случае, когда эмиссии донора и акцептора хорошо разделены. В противном случае этот метод предполагает введение нескольких поправочных коэффициентов, связанных с перекрестными помехами флуорофора, , т.е. , взаимным возбуждением донора и акцепторов на длине волны возбуждения другого красителя и просачиванием флуоресцентного излучения донора и акцептор к каналу обнаружения, соответствующему другому красителю. Независимые контрольные образцы донора и акцептора могут помочь решить проблемы, связанные с вышеуказанными проблемами.Многочисленные методы были разработаны с целью количественной оценки сенсибилизированного акцепторного сигнала. Хотя количественные подходы для точного определения эффективности FRET являются предпочтительными [53], полуколичественный метод, обеспечивающий некалиброванные индексы FRET с сомнительной теоретической базой, также имеется в большом количестве в литературе [59]. Индексы FRET — это относительные значения, зависящие от инструмента, разработанные в соответствии с целями исследований. Они являются качественными по своей природе, однако некоторые из них кажутся более чувствительными и последовательными в тех случаях, когда методы, основанные на эффективности FRET, имеют тенденцию страдать, например, когда отношение донора к акцептору ниже 1 [59].Благодаря простой математической структуре эти подходы могут показаться довольно привлекательными для биологов, которые больше озабочены изучением возможности взаимодействия между двумя макромолекулами в простом формате «да» или «нет» или знанием последствий биологической реакции в ассоциации белки в относительном выражении. Основываясь на литературе, методы измерения сенсибилизированного излучения можно разделить на три группы, основным отличием которых является процесс анализа сигналов FRET: (1) двухканальное измерение коэффициента излучения или возбуждения; (2) трехканальное измерение излучения; и (3) спектральный анализ FRET.

Двухканальное измерение коэффициента излучения или возбуждения

Двухканальное измерение коэффициента излучения широко применялось как в микроскопии [74,75], так и в проточной цитометрии [76,77] в качестве датчиков белок-белковых взаимодействий. В основном, практика заключается в освещении образца с двойной меткой (донор и акцептор) длиной волны возбуждения донора, затем сбор сигналов в обоих каналах донора и FRET, , т. Е. ., В диапазоне длин волн, соответствующем пику излучения донор и акцептор соответственно.Индекс FRET, определяемый как отношение интенсивностей флуоресценции в FRET и донорских каналах, широко используется благодаря тому факту, что это соотношение довольно согласовано [19,52,78]. Альтернативное двухканальное измерение отношения возбуждения также было описано ранее, когда измерения на длине волны излучения акцептора проводились при последовательном возбуждении образца FRET с длинами волн донора (канал FRET) и акцептора (канал акцептора). В этом случае параметр, пропорциональный эффективности FRET, выражается как отношение флуоресценции в канале FRET к флуоресценции в акцепторном канале [78,79].В первую очередь, вышеупомянутые методы игнорируют множественные перекрестные помехи и свойства просачивания флуорофоров, такие как прямое возбуждение акцептора на длине волны поглощения донора. Однако эти методы очень полезны до тех пор, пока соотношение концентраций доноров и акцепторов остается постоянным, например, во внутримолекулярных исследованиях FRET [52,54] с использованием FRET-сенсоров.

Трехканальное измерение излучения

Трехканальное измерение излучения требует сбора трех независимых сигналов от одного и того же образца.Эти сигналы различаются либо длиной волны возбуждения, либо спектральным диапазоном детекторов для регистрации. Фактически, этот метод аналогичен двухканальному измерению с дополнительным третьим каналом, что делает возможными строгие выводы о сигналах, отличных от FRET. Были опубликованы многочисленные исследования, представляющие такую схему с различным уровнем строгости в отношении перекрестных помех или сквозных исправлений [59]. Для трехканального измерения оценка FRET была продемонстрирована как с точки зрения индексов FRET [52,53,80,81], так и эффективности FRET [15,54,68,69,82,83].Измерения требуют сбора сигналов только для донора, только для акцептора и для образцов с двойной (донорно-акцепторной) меткой при одних и тех же обстоятельствах. Ниже мы опишем три наиболее популярных трехканальных измерения на основе индекса FRET с терминологией FRET, используемой соответствующими авторами:

(a) Метод исправленного FRET ( F ^c): этот метод был введен Юван и др. ., для эпифлуоресцентного микроскопа [80]. Они просто генерировали изображение FRET с поправкой на флуоресценцию от фона и проступание.Однако вклад взаимного перекрестного возбуждения в донорных и акцепторных каналах, который в их случае был минимальным, при расчетах не учитывался. Точно так же метод не выполняет нормализацию концентрации доноров и акцепторов. Следовательно, он по своей сути страдает проблемами, связанными с изменчивостью концентрации флуорофора. Фактически, даже при одинаковой эффективности FRET сигнал FRET отличается для образцов, в которых используются различные концентрации доноров и акцепторов.Таким образом, он подходит в условиях, когда концентрация донора к акцептору постоянна или известна заранее. Исправленный FRET выражался в следующей форме:

F ^c = F _f — [( F _d/ D _d) × D _f] — [( F _a/ A _a) × A _f]

(6)

В уравнении (6) F , D и A представляют FRET, донорный и акцепторный каналы, соответственно, тогда как индексы « f, d и a представляют собой FRET, донорные и акцепторные образцы соответственно.Спектральное просачивание для донора ( F _d/ D _d) и акцептора ( F _a/ A _a) рассчитывается для образцов только донора и только акцептора соответственно . Также предполагается, что фон из изображений был вычтен в приведенном выше уравнении.

(b) Метод FRET net (FRETN): Gordon et al . представили метод FRETN для преодоления основной проблемы с помощью метода F ^c. F ^c линейно пропорционален концентрации флуорофоров; поэтому они предложили, чтобы уравнение (6) было дополнительно нормировано произведением сигналов донора и акцептора [54]. Этот новый метод, однако, обеспечивает чрезмерную компенсацию путем деления значения F ^c на интенсивность как донора, так и акцептора. Следовательно, значения FRET выравниваются при более высоких интенсивностях доноров и акцепторов, тогда как они довольно чувствительны при низких интенсивностях доноров и акцепторов.Таким образом, этот метод генерирует значения FRET с высокой стандартной ошибкой (80%), зависящие от концентраций доноров и акцепторов [84].

FRETN = F ^c/ G × D _f × A _f

(7)

Обозначения в уравнении (7) аналогичны обозначениям в уравнении (6 ). Константа « G » — это параметр, который связывает потерю донорного сигнала с увеличением акцепторного сигнала в результате FRET (см. Уравнения (15) и (16) для « G », что эквивалентно «Α» в разделе ниже).

(c) Метод нормализованного FRET (N _FRET): чтобы уменьшить несогласованность метода FRETN, Ся и др. Представили процедуру нормализации для F ^c с произведением квадратного корня из сигналов донора и акцептора. [84]. Это делает FRET независимым от локальной концентрации флуорофора. Однако N _FRET по-прежнему не является линейным с изменениями в значениях E и долевой занятости; следовательно, он не подходит для стехиометрических измерений связывающих взаимодействий [85].

Было опубликовано несколько других методов, в которых в основе нормализации значения FRET лежит концентрация акцепторов [81,86].

Экспериментальные результаты, полученные с использованием индексов FRET от разных приборов, несопоставимы, поскольку индексы FRET зависят от параметров системы, таких как интенсивность возбуждения и эффективность обнаружения прибора [21]. Поэтому более уместно выражать FRET через независимый от прибора, но количественный параметр, такой как эффективность FRET.Предполагая, что пара FRET смещена в красную область, что минимизирует автофлуоресценцию [27], а вклад фона незначителен, эффективность FRET можно легко вычислить, решив набор трех линейных уравнений, соответствующих сигналам от образца FRET. Они выражаются как функция от непогашенного донора ( I _D), эффективности FRET ( E ) и интенсивности от акцептора в отсутствие FRET (I _A). Для обеспечения единообразия мы используем терминологию, аналогичную той, что использовалась в наших предыдущих статьях [15,68,69,82].Следующие уравнения основаны на FCET [15,68], хотя мы также реализовали его в микроскопии [69,70]. Во-первых, мы хотели бы ввести поправочные коэффициенты, которые требуют отдельных помеченных образцов донора и акцептора, чтобы было легко следовать уравнениям. Поправочные коэффициенты возникают в результате перетекания и перекрестного возбуждения между донорными и акцепторными флуорофорами, поэтому они необходимы для устранения сигналов, отличных от FRET. В общем случае используются четыре различных коэффициента « S », а именно S ₁, S ₂, S ₃ и S ₄.

S ₁ и S ₃ характеризуют перетекание донорной интенсивности на FRET ( I ₂) и акцепторный ( I ₃) каналы, соответственно, и являются определяется с использованием только меченого донора образца.

S ₂ и S ₄ характеризуют перетекание акцепторной интенсивности на FRET ( I ₂) и донорный ( I ₁) каналы соответственно и являются определяется с использованием только меченного акцептором образца.

где I ₁, I ₂ и I ₃ соответствуют интенсивностям, измеренным в донорном, FRET и акцепторном каналах соответственно. Длина волны возбуждения (_из) и излучения (_из) для каждой из интенсивностей определена в скобках в уравнениях (11) — (13). Например, сокращение в символе (λ _{ex, D}; λ _{em, D}) означает возбуждение на длине волны, соответствующей полосе поглощения донора, и излучение, обнаруженное на длине волны, соответствующей диапазону длин волн излучения донора.Заглавные буквы «D» или «A» в символах обозначают донор и акцептор соответственно.

I1 (λex, D; λem, D) = ID (1 − E) + IA × S4 + ID × E × α × S4S2

(11)

I ₂ (λ _{ex, D}; λ _{em, A}) = I _D (1 — E ) × S ₁ + I _A × S ₂ + I _D × E × α

(12)

I3 (λex, A; λem, A) = ID (1 − E) × S3 + IA + ID × E × α × 1S2 × ϵλAD ϵλDA ϵλDDϵλAA

( 13)

Здесь «ϵ» обозначает молярный коэффициент поглощения молекул «D» и «A», показанный верхними индексами на донорной (λ _{ex, D}) или акцепторной длинах волн (λ _{ex, A}).Часто S ₃, S ₄ и молярный коэффициент поглощения, (ϵλAD ϵλDA ϵλDDϵλAA) пренебрежимо малы, как и в случае пары FRET Cy3-Cy5 при измерении на FACSCalibur (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, США). Таким образом, решение уравнений (11) — (13) даст «E» в следующей форме (см. Ссылки [15,68] для вывода):

E = I2− I1S1− I3S2α I1 + I2− I1S1− I3S2

(14)

Из приведенного выше набора уравнений также ясно, что для вычисления «E» в ратиометрическом FRET требуется определение коэффициента «α», который имеет широко используется как «G» в микроскопии для коррекции различий в квантовом выходе донора и акцептора и в эффективности обнаружения донора в донорном канале и акцептора в канале FRET.«Α» связывает потерю флуоресценции донора с сенсибилизированным излучением акцептора.

Обычно «α» выражается следующим образом:

где « Q _D» и « Q _A» — квантовые выходы флуоресценции донорного и акцепторного флуорофоров соответственно, а «η _D» и «η _A» — эффективности обнаружения. донора в донорном канале и акцептора в канале FRET соответственно. Поскольку как квантовый выход, так и эффективность обнаружения трудно определить или рассчитать, ранее сообщалось о многочисленных способах расчета фактора «α», хотя и не без проблем, связанных с лежащими в основе переменными.Заинтересованные читатели могут обратиться к цитированным ссылкам для изучения различных подходов к определению фактора «α» в микроскопии [21,55,69,70,83,85] и проточной цитометрии [15,55,65,87]. Один из простейших подходов к вычислению «α» основан на маркировке двух отдельных образцов. Один из образцов помечен антителом с донорной меткой, а другой — антителом с меткой акцептора. В таком случае «α» можно рассчитать по следующему уравнению:

α = I2, A I1, D × BD BA × LD LA × ϵλDDϵλDA

(16)

где I _{2, A} и I _{1, D} — интенсивность меченного акцептором образца, измеренная в канале FRET, и интенсивность меченного донором образца, измеренная в донорном канале, соответственно.Аналогичным образом, « B _D» и « B _A» представляют собой среднее количество эпитопов, помеченных конъюгированными с донором и конъюгированными с акцептором антителами соответственно, и « L _D» и « L _A ”обозначают соотношения мечения (, т. Е. , количество флуорофоров / антитело) антител, конъюгированных с донором, и антител, конъюгированных с акцептором, соответственно. Для простоты рекомендуется пометить один и тот же эпитоп антителами, конъюгированными с донором и акцептором, так, чтобы B _D = B _A.К сожалению, описанный выше метод требует измерения большого количества клеток, так что средние значения интенсивности ( I _{2, A} и I _{1, D}) могут быть определены надежно, чего трудно достичь в микроскопии. Альтернативно, «α» можно рассчитать, пометив один и тот же мембранный белок двумя неконкурентными антителами, связывающимися с разными эпитопами, но достаточно далеко, чтобы избежать возникновения FRET. Одно из антител должно быть помечено донорской меткой, а другое — конъюгированным с акцептором.Такой подход гарантирует, что отношение B _D/ B _A равно 1, поскольку интенсивности I _{2, A} и I _{1, D} измеряются на одних и тех же ячейках. Таким образом, «α» можно легко рассчитать по уравнению (16) с B _D/ B _A = 1. Если требование отсутствия FRET не может быть выполнено, передача энергии происходит между донором: и следует принимать во внимание меченные акцептором антитела [55,88].

Несмотря на использование такого систематического метода вычисления «E», удовлетворительные результаты по-прежнему трудно получить для белков с низким уровнем экспрессии. Таким образом, в случаях, когда отношение сигнал / шум очень низкое, для точных расчетов FRET требуется поэтапная коррекция автофлуоресценции и выбор пары FRET с большой длиной волны излучения. Это улучшение уменьшает разброс гистограмм FRET и, таким образом, повышает чувствительность анализа FRET [15,27,69]. Аналогичным образом, мы также недавно ввели эффективный метод, применимый в таких случаях, который называется оценкой максимального правдоподобия (MLE) эффективности FRET.Метод основан на предположении, что детектирование фотонов детекторами следует пуассоновской статистике [63]. Мы разработали вычислительный инструмент, применяя функцию Пуассона к интенсивности I ₂, выраженной как функция от I ₁ и I ₃ после решения уравнений (11) — (13). Таким образом, метод предсказывает совместную вероятность количества фотонов, полученных донорным, FRET и акцепторным каналами. Представленный алгоритм назначает единственную эффективность FRET на основе вероятности всех трех измеренных значений интенсивности для каждого пикселя.Следовательно, выпадающие пиксели с низкой вероятностью для определенной эффективности FRET можно легко исключить из анализа, что значительно повысит точность расчета. Единственный недостаток состоит в том, что MLE FRET требует набора данных по крайней мере из 100 пикселей, что соответствует области 1 мкм × 1 мкм, предполагая размер пикселя 100 нм, для точного определения эффективности FRET; поэтому попиксельное документирование буквы «E» в изображении невозможно. Однако неоднородность пространственных подмножеств из-за биологической дисперсии может быть исследована, когда интересующие области выбираются для анализа в клетке.При физиологических настройках, которые, как известно, имеют низкое количество фотонов из-за слабой экспрессии белков и обилие внешних пикселей как биологического, так и инструментального происхождения, мы отметили, что эффективность MLE FRET превышает производительность как попиксельного, так и основанного на общей интенсивности FRET. подходы. Традиционный метод вычисления «E» страдает от искажения, вызванного шумом детектора, поэтому при вычислении «E» для слабо экспрессируемых белков преобладают неопределенности. Фактически, гистограмма FRET будет широкой и асимметричной с большой дисперсией, делающей букву E бессмысленной.Читатели, интересующиеся теоретическими и математическими основами этого метода, могут ознакомиться с нашей недавно опубликованной статьей [63]. Метод разработан для конфокального микроскопа; однако мы не видим причин, по которым он не может быть адаптирован для проточной цитометрии до тех пор, пока используются детекторы счета фотонов.

Введение в технологию флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и ее применение в биологических науках

Автор : Пол Хелд, Ph.D, Отдел приложений, BioTek Instruments

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — физическое явление, впервые описанное более 50 лет назад, которое сегодня все чаще используется в биомедицинских исследованиях и открытии лекарств. FRET основан на зависящей от расстояния передаче энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору. Из-за своей чувствительности к расстоянию FRET использовался для исследования молекулярных взаимодействий. FRET — это безызлучательная передача энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору.Молекула-донор — это краситель или хромофор, который первоначально поглощает энергию, а акцептор — хромофор, которому впоследствии передается энергия. Это резонансное взаимодействие происходит на расстояниях, превышающих межатомные расстояния, без преобразования в тепловую энергию и без каких-либо столкновений молекул. Передача энергии приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции донора и времени жизни возбужденного состояния, а также к увеличению интенсивности излучения акцептора. Пару молекул, которые взаимодействуют таким образом, что возникает FRET, часто называют парой донор / акцептор.

Несмотря на то, что на FRET влияет множество факторов, основных условий, которые должны быть соблюдены для возникновения FRET, относительно немного. Молекулы донора и акцептора должны находиться в непосредственной близости друг от друга (обычно 10–100 Å). Спектр поглощения или возбуждения акцептора должен перекрывать спектр излучения флуоресценции донора (рис. 1). Степень их перекрытия называется спектральным интегралом перекрытия (J). Ориентации диполей донорного и акцепторного переходов должны быть примерно параллельны.Если предположить, что донорно-акцепторные пары совместимы, наиболее важным элементом, необходимым для возникновения FRET, является близость пар. Фёрстер продемонстрировал, что эффективность процесса (E) зависит от обратного шестого расстояния между донором и акцептором (см. Уравнение 1). [1]

Уравнение 1. E = Ro ⁶ / (Ro ⁶ + r ⁶)

Где Ro — расстояние Ферстера, на котором передается половина энергии, а r — фактическое расстояние между донором и акцептором.Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50%, называется радиусом Ферстера (Ro). Величина Ro зависит от спектральных свойств донора и акцептора. Расстояние Ферстера от 20 до 90 Å наиболее полезно для исследования биологических макромолекул. Эти расстояния сопоставимы с диаметрами многих белков, толщиной биологических мембран и расстояниями между сайтами на мультисубъединичных белках. Любой процесс, который влияет на скорость передачи энергии, позволяет количественно оценить процесс.В результате FRET часто называют спектроскопической линейкой. Обратите внимание, что расстояние Ферстера (Ro) зависит от ряда факторов, включая квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора (fd), показатель преломления раствора (n), дипольную угловую ориентацию каждой молекулы. (k2) и спектральный интеграл перекрытия донора и акцептора (J). См. Уравнение 2.

Уравнение 2. Ro = 9,78 x 10 ³ (n ^-4 * fd * k ² * J) ^1/6 Å

Рисунок 1.Схематическое изображение интеграла перекрытия спектров

В качестве примера влияния расстояния на эффективность передачи энергии можно использовать некоторые произвольные числа для расстояния Ферстера (Ro) и фактического расстояния (r). Если Ro произвольно задан равным 1 (Ro = 1), и расстояние между донором и акцептором также равно 1, тогда r = Ro, и уравнение эффективности будет E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 1 ⁶), что равно 0.5 (т.е. 50%). Эта половина максимального значения и есть то, что определяется как расстояние Фёрстера. Если расстояние в 10 раз меньше (например, r = 0,1Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 0,1 ⁶) = 0,999999, что значительно эффективнее. Однако, если расстояние между донором и акцептором в 10 раз больше (т.е. r = 10Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 10 ⁶) = 0,0000001. Эта чрезвычайная чувствительность к расстоянию — это то, что позволяет использовать FRET для экспериментов с приближением.

Обычно донорная и акцепторная части различаются, и в этом случае FRET можно обнаружить по появлению флуоресценции акцептора или по тушению донорной флуоресценции. Зонд-донор всегда представляет собой флуоресцентную молекулу. Обратите внимание, что люминесцентные молекулы ведут себя как флуоресцентные молекулы в отношении своего излучения. При соответствующем возбуждении его электроны перескакивают из основного состояния (So) на более высокий колебательный уровень. Очень быстро (в течение пикосекунд) эти электроны распадаются на самые низкие колебательные уровни (S1) и, в конечном итоге, распадаются (в течение наносекунд) обратно в состояние So, и излучается фотон света.Когда выполняются условия для возникновения FRET, затухание флуоресценции донора и передача энергии акцептору будут конкурировать за спад энергии возбуждения. При резонансной передаче энергии фотон НЕ излучается, а энергия передается молекуле-акцептору, электроны которой, в свою очередь, возбуждаются, как описано для молекулы-донора. При последующем возврате в основное состояние излучается фотон (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение состояний колебательной энергии электрона, возникающих во время FRET.

Измерение

Обнаружение и количественное определение FRET, безусловно, может быть выполнено множеством различных способов. Поскольку FRET может приводить как к уменьшению флуоресценции молекулы донора, так и к увеличению флуоресценции акцептора, может быть выполнено определение метрики соотношения двух сигналов. Преимущество этого метода заключается в том, что измерение взаимодействия не зависит от абсолютной концентрации датчика.Поскольку не все акцепторные части являются флуоресцентными, их можно использовать в качестве средств для гашения флуоресценции. В этих случаях те взаимодействия, которые приводят к тому, что флуоресцентная донорная молекула приближается к такой молекуле, могут привести к потере сигнала. И наоборот, реакции, устраняющие близость флуоресцентного донора и тушителя, могут привести к увеличению флуоресценции. Одним из таких примеров могут быть анализы протеазы. Эти анализы обычно включают флуоресцентный фрагмент на одном конце и гасящую молекулу на другом конце, разделенные пептидом, содержащим последовательность расщепления протеазой.

Некоторые примеры

Генетически кодируемые флуоресцентные красители, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и родственные молекулы синего, голубого, желтого и красного цветов, обеспечивают способность выполнять FRET in vitro, особенно в живых клетках [2]. Эти белки образуют пары FRET друг с другом, а также с обычными красителями. Они могут быть связаны с другими белками генетически или ковалентно, но при этом сохранять свою флуоресцентную способность. Эти красители могут быть генетическими элементами, которые могут быть связаны с другими генами с образованием химерных белков.Эти химерные белки содержат GFP (или связанный с ним флуоресцентный белковый элемент) и предполагаемый связывающий домен. С различными химерными белками (один донор и один акцептор) можно исследовать белок-белковые взаимодействия. Только когда пары донор / акцептор взаимодействуют посредством белок-белковых взаимодействий, результатом будет FRET. (Рисунок 3)

Рис. 3. Схематическое изображение взаимодействия двух различных химер флуоресцентных белков. Белок-белковые взаимодействия между белками, помеченными A и B, приводят к тому, что синий флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок находятся в достаточно близком расстоянии, чтобы позволить FRET возникать.В этом примере возбуждение синего флуоресцентного белка приводит к испусканию флуоресценции зеленым флуоресцентным белком.

Органические цианиновые красители Cy3, Cy5, Cy5.5 и Cy7, которые излучают в красном диапазоне (> 550 нм), обладают рядом преимуществ. Их диапазон излучения таков, что часто снижается фоновая флуоресценция. Кроме того, большие расстояния (> 100 Å) могут быть измерены в результате высоких коэффициентов экстинкции и хороших квантовых выходов. Даже донорно-акцепторные пары с разделенными спектрами излучения (т.е. низкий интеграл перекрытия) приводят к приемлемым расстояниям Фёрстера. Например, Cy3, который излучает максимум на 570 нм, и Cy5, который излучает на 670 нм, имеют расстояние Ферстера> 50 Å. Большое расстояние между парами позволяет измерять излучение акцептора в результате FRET без помех от излучения донора. Кроме того, эти молекулы могут быть напрямую связаны с определенными участками в синтетически полученных нуклеиновых кислотах, что позволяет использовать FRET для оценки отжига нуклеиновых кислот.

Рисунок 4.Схематическое изображение FRET, возникающего между флуоресцентными фрагментами Cy3 и Cy5 при отжиге меченых олигонуклеотидов.

В примере, изображенном на фиг. 4, два комплементарных олигонуклеотида РНК помечены Cy3 и Cy5 соответственно. Когда эти меченые молекулы не отжигаются (рис. 4A), возбуждение РНК-олигонуклеотида, меченного Cy3, светом с длиной волны 540 нм приводит только к испусканию света Cy3 с длиной волны 590 нм, в то время как комплементарная РНК-олиго, меченная Cy5, не излучает любой свет с длиной волны 590 нм или его истинная длина волны излучения 680 нм.Однако, когда двум олигонуклеотидам позволяют отжигаться, непосредственная близость молекул позволяет происходить переносу FRET. Это приводит к испусканию света с длиной волны 680 нм, когда отожженная молекула возбуждается светом с длиной волны 540 нм. Обратите внимание, что не все излучение Cy3 на длине волны 590 нм теряется, но значительная его часть теряется.

Рис. 5. Схематическая диаграмма активности FRET, используемой ВСП

Зонды с датчиками напряжения

(VSP) — это технология анализа на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), используемая для обнаружения лекарств с высокопроизводительным ионным каналом.Донор FRET представляет собой связанный с мембраной кумарин-фосфолипид (CC2-DMPE), который связывается только с внешней стороной клеточной мембраны. Акцептор FRET представляет собой мобильный отрицательно заряженный гидрофобный оксонол [DiSBAC ₂ (3) или DiSBAC ₄ (3)], который будет связываться с любой стороной плазматической мембраны в ответ на изменения мембранного потенциала (рис. 5). В ВСП используется зависимость от расстояния. FRET может иметь место только тогда, когда акцептор DISBAC ₂ (3) расположен снаружи клеточной мембраны.Покоящиеся клетки обладают относительно отрицательным потенциалом, поэтому два зонда связываются с внешней стороной клеточной мембраны, что приводит к эффективному FRET. Возбуждение донорного зонда CC2-DMPE (при ~ 400 нм) генерирует сильный красный сигнал флуоресценции (при ~ 590 нм) от зонда-акцептора оксонола. Когда мембранный потенциал становится более положительным, как это происходит при деполяризации клеток, оксонольный зонд быстро перемещается (в субсекундном временном масштабе) на другую сторону мембраны (рис. 5). Таким образом, каждый оксонольный зонд «чувствует» и реагирует на изменения напряжения в ячейке.Эта транслокация разделяет пару FRET, поэтому возбуждение донорного зонда CC2-DMPE теперь генерирует сильный синий сигнал флуоресценции (при ~ 460 нм) от зонда CC2-DMPE. Ожидается, что деполяризация клетки, которая заставляет DISBAC ₂ (3) перемещаться на внутреннюю сторону мембраны, приведет к снижению активности FRET.

Соединения лантанидов, такие как европий и тербий, эффективно используются в качестве доноров в реакциях FRET. Эти соединения обеспечивают очень хорошее соотношение сигнал / шум в результате их длительного периода полураспада флуоресценции и спектральных характеристик.Эмиссия этих соединений имеет резко пиковый профиль с большим стоксовским сдвигом от возбуждения. Кроме того, длительный период полураспада флуоресценции позволяет начать измерение после прекращения возбуждающего света. Задержка между возбуждением и измерением (диапазон мсек) позволяет рассеяться фоновой флуоресценции от молекулы органического акцептора с периодом полураспада в наносекундном диапазоне. Таким образом, при соответствующей задержке измеряется только донорно-акцепторная эмиссия.

Донорная молекула не всегда должна включать флуоресцентное соединение.Люминесцентные молекулы излучают фотоны очень похоже на флуоресценцию. Основное различие состоит в том, что электронное возбуждение не является результатом поглощения фотона, а, скорее, высвобождением химической энергии, содержащейся в молекуле. Когда возбужденные электроны возвращаются к своему основному состоянию, энергия может быть высвобождена в виде фотона света или передана через RET молекуле-акцептору, если условия верны. Хотя количество молекул, которые можно использовать, более ограничено, эта технология имеет то преимущество, что отсутствует внешнее возбуждение молекулы акцептора.

Проблемы

При разработке экспериментов FRET необходимо учитывать ряд вопросов. Самая очевидная проблема — это близость. В зависимости от схемы анализа, непосредственная близость будет либо установлена, либо устранена во время анализа, что приведет к изменению сигнала, который можно измерить. Необходимо выбрать подходящие пары донор / акцептор. Пары должны иметь достаточное спектральное перекрытие для эффективной передачи энергии, но при этом иметь достаточную разницу в спектрах, чтобы их можно было отличить друг от друга.Выбор фильтров для выбора длины волны флуоресценции также имеет решающее значение для успеха или неудачи экспериментального обнаружения FRET. Фильтр возбуждения для донора должен иметь возможность избирательно возбуждать молекулу донора, сводя к минимуму прямое возбуждение молекулы акцептора. Загрязняющее прямое возбуждение акцепторной молекулы может быть учтено с помощью соответствующих контролей, но большие количества затрудняют интерпретацию данных. Как показано на рисунке 1, фильтры, используемые для возбуждения Cy3, минимизировали возбуждение Cy5, обеспечивая при этом достаточный сигнал возбуждения для Cy3.

Еще одна важная проблема, связанная с обнаружением FRET, связана с концентрацией аналита. Только те молекулы, которые взаимодействуют друг с другом, приведут к FRET. Если присутствуют большие количества донорных и акцепторных молекул, но они не взаимодействуют, количество происходящего FRET будет довольно низким. В этом примере, хотя донорные и акцепторные молекулы могут быть очень легко обнаружены по отдельности, фактического количества активности FRET может быть недостаточно для обнаружения. Что касается FRET, фактически измеряемым «аналитом» являются пары донор / акцептор, а не отдельные компоненты.Кроме того, как донорные, так и акцепторные молекулы должны иметь достаточную концентрацию для того, чтобы FRET имел место. Большинство связывающих событий — это динамический процесс, который достигает устойчивого состояния. Если одного из компонентов реакции не хватает, то общее связанное количество будет естественно низким. Например, временные трансфекции с двумя разными генетическими элементами, которые приводят к тому, что один из элементов не эффективно транслируется в белок, приведут к низким уровням FRET. Клеточная локализация также может иметь значение.Если одна молекула находится в цитоплазме, а другая — в ядре, взаимодействия друг с другом не будет, несмотря на достаточное количество каждой из них.

Приложения FRET

Структура и конформация белков [3]
Пространственное распределение и сборка белков [4]
Взаимодействия рецептор / лиганд [5]
Иммуноанализы [6]
Структура и конформация нуклеиновых кислот [7]
Анализ ПЦР в реальном времени и определение SNP [8,9]
Гибридизация нуклеиновых кислот [10]
Распределение и транспорт липидов [11]
Анализы слияния мембран [12]
Определение потенциала мембраны [13, 14]
Анализ флуорогенных протеаз [15]
Индикаторы циклического AMP [16]

Узнайте больше о Synergy HTX
Многорежимный считыватель

Список литературы

Förster, T.(1948) Межмолекулярная миграция энергии и флуоресценция Ann. Phys 2: 55-75.
Tsien, R. (1998) Ann. Обзор Biochem, 67: 509-544
Jonsson T, Waldburger CD, Sauer RT, (1996) Нелинейные отношения свободной энергии в разворачивании репрессора дуги подразумевают существование нестабильных, нативных промежуточных продуктов сворачивания. «. Biochemistry 35: 4795-4802.
Watson BS, Hazlett TL, Eccleston JF, Davis C, Jameson DM, Johnson AE. (1995) Расположение макромолекул в аминоацил-тРНК.фактор элонгации Tu.GTP тройной комплекс. Исследование передачи энергии флуоресценции. Биохимия 34: 7904-7912
Бергер В., Принц Х., Стриссниг Дж., Канг Х.С., Хаугланд Р., Глоссманн Х. (1994) Сложный молекулярный механизм связывания дигидропиридина с Ca (2 +) — каналами L-типа, выявленный с помощью резонансной передачи энергии флуоресценции. Биохимия 33: 1875-11883.
Ханна П.Л., Ульман Э.Ф. (1980) 4 ‘, 5’-Диметокси-6-карбоксифлуоресцеин: новый диполь-дипольный акцептор переноса энергии флуоресценции, пригодный для флуоресцентных иммуноанализов.Анал Биохим 108: 156-161.
Клегг Р.М., Мурчи А.И., Лилли Д.М. (1994) Структура раствора четырехстороннего соединения ДНК в условиях с низким содержанием соли: анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии. Biophys J 66: 99-109.
Ли Л.Г., Ливак К.Дж., Мулла Б., Грэм Р.Дж., Винаяк Р.С., Вуденберг TM. (1999) Семицветное, однородное обнаружение шести продуктов ПЦР. «Biotechniques 27: 342-349.
Мякишев М.В., Хрипин Ю., Ху С., Хамер Д.Х. 2001) Высокопроизводительное генотипирование SNP с помощью аллель-специфической ПЦР с универсальными праймерами, меченными переносом энергии.Genome Res 11: 163-169.
Parkhurst KM, Parkhurst LJ. (1995) Кинетические исследования резонансного переноса энергии флуоресценции с использованием олигонуклеотида с двойной меткой: гибридизация с олигонуклеотидным комплементом и одноцепочечной ДНК. Биохимия 34: 285-292.
Николс Дж. У., Пагано РЭ. (1983) Анализ резонансной передачи энергии белково-опосредованного переноса липидов между везикулами. J Biol Chem 258: 5368-5371.
Uster PS (1993) Микроскопия резонансного переноса энергии in situ: мониторинг слияния мембран в живых клетках.Методы Энзимол. 221: 239-246.
Hoffman, R. и Held, P. Примечание по применению BioTek.
Gonzalez JE, Tsien RY. (1995) Измерение напряжения путем резонансного переноса энергии флуоресценции в отдельных клетках. Biophys J 69: 1272-1280.
Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J. (1990) Новые флуорогенные субстраты для анализа ретровирусных протеаз с помощью резонансной передачи энергии ». Science 247, 954-958.
. Адамс С.Р. и др. (1993) Оптические зонды для циклического AMP, флуоресцентные и люминесцентные зонды для определения биологической активности, Mason W.T., Ed.С. 133-149.

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — Общие понятия

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений.Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определяемого критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансного переноса энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. С помощью этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному хромофору без излучения посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную для той, которая выявляется с помощью событий, зависящих от растворителя, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансной передаче энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем краткосрочные эффекты растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредуется испусканием фотонов, и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора.Следовательно, измерения FRET могут использоваться в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофора разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами.Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя флуоресцентный резонансный перенос энергии часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белки с соответствующими флуорофорами.Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутации этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET.Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых мечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса на длине волны максимальной абсорбции будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцептора (GFP) флуоресценции.

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, оптики микроскопов и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к исследованию взаимодействий белков-партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор приблизительно 10 нанометров. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера и подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) — критическое значение Фёрстера расстояние , τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) может быть вычислено из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [

κ
2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6
, в котором κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.
Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:
r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6
и E (T) оценивается как:
ET = 1 — (τDA / τD)
, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих широко применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).
Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.
На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения для обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.
Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, J (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.
Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от изменений J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.
Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET
Донор Акцептор Расстояние Ферстера (нанометры)
Триптофан Дансил 2.1
ИАЭДАНЫ (1) ДДПМ (2) 2,5 — 2,9
BFP DsRFP 3,1 — 3,3
Дансил FITC 3,3 — 4,1
Дансил Октадецилродамин 4.3
CFP GFP 4.7 — 4,9
CF (3) Техасский красный 5.1
Флуоресцеин Тетраметилродамин 4,9 — 5,5
Cy3 Cy5 > 5,0
GFP YFP 5,5 — 5,7
BODIPY FL (4) BODIPY FL (4) 5.7
Родамин 6G Малахитовый зеленый 6.1
FITC Эозин тиосемикарбазид 6,1 — 6,4
B-фикоэритрин Cy5 7.2
Cy5 Cy5.5 > 8,0
(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен
Таблица 1
Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ -квадрат, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.
Из-за связи корня шестой степени с расстоянием Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для отклонения в квадрате κ . Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ -квадрат таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.
Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Большая неопределенность существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.
Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .
Зависимость фактора ориентации ( κ -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:
κ
2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2
, где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D), и θ (A), — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.
Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора являются надежными только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.
Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.
Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансная передача энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрических форм и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.
Применение методов FRET в оптической микроскопии
Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии варьируются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модернизировать для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).Как правило, микроскоп должен быть оснащен охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), связанной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.
Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что дает изображения со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.
Типичная конфигурация микроскопа, позволяющая наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогеновой лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное освещение светлого поля, фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста ( DIC ).Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.
Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального излучения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.
Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:
Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
Фотообесцвечивание необходимо устранить, потому что артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях методом FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
Молекула-донор должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, излучение которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
Поскольку резонансный перенос энергии флуоресценции требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.
Чтобы феномен флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставил значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается сопутствующим уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).
Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора может рассматриваться как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух значений, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и детектирования повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется установившимся режимом , флуоресцентным резонансным переносом энергии.
Подходящие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.
Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены путем слияния с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками
Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может повлиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.
Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.
Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.
Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения донорной эмиссии измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания акцепторной молекулы.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.
Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод коррекции обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы донорных, FRET и акцепторных фильтров предназначены для выделения и максимизации трех специфических сигналов: донорной флуоресценции, акцепторной флуоресценции, относящейся к FRET, и непосредственно возбужденной акцепторной флуоресценции, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.
На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через эмиссионный фильтр.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.
Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, когда регистрируются как интенсивность в установившемся состоянии, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривой затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.
Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:
I (t) = I0 exp (-t / τ )
, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.
Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.
Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.
Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (а)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции получают путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.
На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.
Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.
Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.
В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.
Выводы
В биологических исследованиях наиболее распространенным применением флуоресцентного резонансного переноса энергии является измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.
Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни донора в возбужденном состоянии, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.
Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что FRET-анализ показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.
Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.
Соавторы
Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.
Джозеф Р. Лакович — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.
Thomas J. Fellers and Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.
Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки
Понимание того, как биомолекулы соединяют структурную динамику с функцией, лежит в основе нескольких дисциплин и остается выдающейся целью биологии. Связывание конформационных состояний и их переходов с биохимической функцией требует способности точно определять структуру и динамику биологической системы, которая часто изменяется при связывании лиганда или находится под влиянием химических и физических свойств окружающей среды.Наиболее хорошо зарекомендовавшие себя инструменты структурной биологии предоставили с высоким разрешением «снимки» состояний в кристаллизованной или замороженной форме (например, рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия одиночных частиц, криоЭМ) или усредненное по ансамблю всех конформаций. (например, ядерный магнитный резонанс, ЯМР; малоугловое рассеяние рентгеновских лучей, МУРР; малоугловое рассеяние нейтронов, МУРН; двойной электрон-электронный резонанс, DEER; сшивающая масс-спектрометрия, XL-MS; ансамбль-FRET). В последние годы дальнейшие разработки позволили этим традиционным структурным инструментам обнаруживать конформационную динамику и промежуточные продукты реакции.Например, методы ЯМР (Anthis and Clore, 2015; Clore and Iwahara, 2009; Palmer, 2004; Ravera et al., 2014; Sekhar and Kay, 2019) и методы электронного парамагнитного резонанса (Jeschke, 2018; Jeschke, 2012; Krstić et al., 2011) были продвинуты для изучения конформационной динамики и захвата временных промежуточных соединений. Кристаллографические исследования с временным разрешением использовались для определения функционально значимых структурных смещений, связанных с биологической функцией (Kupitz et al., 2014; Moffat, 2001; Schlichting et al., 1990; Шлихтинг и Чу, 2000; Schotte et al., 2003). Достижения в микрожидкостных устройствах для смешивания и распыления позволили использовать криоЭМ с временным разрешением (Feng et al., 2017; Kaledhonkar et al., 2018) и масс-спектрометрию с поперечными связями (XL-MS или CL-MS) (Braitbard et al., 2019 ; Brodie et al., 2019; Chen et al., 2020; Iacobucci et al., 2019; Murakami et al., 2013; Славин, Калисман, 2018). Прогресс в вычислительных методах также предоставил новые инструменты для изучения биомолекулярной структуры и динамики. Каждое из этих достижений подчеркивает возросшее понимание того, что необходимо напрямую и непрерывно отслеживать динамические свойства отдельных биомолекул, чтобы понять их функцию и регуляцию.
В этом контексте FRET (называемый резонансным переносом энергии флуоресценции или резонансным переносом энергии Фёрстера [Braslavsky et al., 2008]) исследования на ансамблевом и одномолекулярном уровнях стали важными инструментами для измерения структурной динамики по крайней мере на протяжении 12 порядков величины во времени и картирование конформационных и функциональных неоднородностей биомолекул в условиях окружающей среды. FRET изучает затухание флуоресценции на уровне ансамбля (Grinvald et al., 1972; Haas et al., 1975; Хаас и Стейнберг, 1984; Hochstrasser et al., 1992) (FRET с временным разрешением) позволили уже в начале 1970-х годов изучать структурные неоднородности во временных масштабах, превышающих время жизни флуоресценции (несколько нс). Этот подход используется до сих пор (Becker, 2019; Orevi et al., 2014; Peulen et al., 2017) и перенесен в исследования одиночных молекул. Возможность измерения FRET в отдельных молекулах (Deniz et al., 1999; Ha et al., 1996; Lerner et al., 2018a) сделала этот метод еще более привлекательным.Подход одномолекулярного FRET (smFRET) широко использовался для изучения конформационной динамики и биомолекулярных взаимодействий в стационарных условиях (Dupuis et al., 2014; Larsen et al., 2019; Lerner et al., 2018a; Lipman et al. ., 2003; Margittai et al., 2003; Mazal and Haran, 2019; Michalet et al., 2006; Orevi et al., 2014; Ray et al., 2019; Sasmal et al., 2016; Schuler et al., 2005; Schuler et al., 2002; Steiner et al., 2008; Zhuang et al., 2000). Примечательно, что во многих механистических исследованиях достаточно использовать FRET для различения различных конформаций и определения кинетических скоростей, так что абсолютные эффективности FRET и, следовательно, расстояния не нужно определять.Однако возможность точного измерения расстояний и кинетики с помощью smFRET привела к его появлению в качестве важного инструмента в эту новую эру «динамической структурной биологии » для картирования биомолекулярных неоднородностей и измерения структурной динамики в широком диапазоне временных масштабов (Lerner et al., 2018a; Mazal, Haran, 2019; Sanabria et al., 2020; Schuler, Hofmann, 2013; Weiss, 1999).
Одномолекулярные методы FRET (smFRET) имеют много преимуществ в качестве метода структурной биологии, в том числе:
чувствительность к макромолекулярным расстояниям (2.5–10 нм),
способность разрешать структурные и динамические неоднородности,
высококачественные измерения с низким потреблением образцов интересующих молекул (низкие концентрации и низкие объемы), поскольку образец анализируется по одной молекуле за раз,
определение структурных переходов в состоянии равновесия, следовательно, без необходимости синхронизации,
возможность обнаружения (очень) редких событий.Действительно, в биологии наиболее интересными молекулами для изучения часто являются редкие, функционально активные молекулы среди моря неактивных молекул,
высокая чувствительность и специфичность для меченых молекул. Поскольку только меченая молекула вносит уникальный вклад в детектируемый сигнал, эти индикаторы также могут применяться в качестве FRET-репортеров в тесноте (Dupuis et al., 2014; Soranno et al., 2014; Zosel et al., 2020b) (отсюда smFRET может использоваться для проверки результатов, полученных изолированно, или обнаружения модуляции конформационных предпочтений и / или структурной динамики посредством так называемых пяти взаимодействий [Guin and Gruebele, 2019]), и
высокая специфичность в отношении остатков / доменов за счет специфического мечения.Биомолекулы могут быть специально помечены уникальной парой красителей, что позволяет проводить измерения smFRET для всех размеров молекул, включая большие сложные сборки (см. Рисунок 1 [Kilic et al., 2018]), активные биологические машины (например, рибосомы) ( Dunkle et al., 2011) и даже на целых нативных вирионах (Lu et al., 2019; Munro et al., 2014).
Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.
( A ) Интеграционное моделирование требует структурной и динамической информации. Предварительная информация из традиционных подходов (рентген, ЯМР, криоЭМ) вместе с вычислительными инструментами определяет пространство возможных решений для структурного моделирования с помощью FRET. Комбинация структурной (расстояния между красителями) и динамической информации (кинетическая связь и обменные курсы) позволяет идентифицировать непротиворечивую модель. ( B ) Изучение структуры и динамики хроматиновых волокон.Комбинированное TIRF и конфокальное FRET исследование структуры и динамики хроматиновых волокон с использованием трех позиций маркировки FRET (DA1-3) для двух пар красителей с различными расстояниями Ферстера. Расстояния Фёрстера (определены в разделе Расстояния между красителями, уравнение 6). Предварительная структурная информация, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии (вверху слева) (Song et al., 2014) и рентгеновской кристаллографии (вверху, справа PDB ID: 1ZBB Schalch et al., 2005), объединена со структурной и динамической информацией. полученные в результате экспериментов FRET на иммобилизованных молекулах, измеренных с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), и на свободно диффундирующих молекулах с помощью конфокальной микроскопии (Kilic et al., 2018). На основе объединенной информации получается согласованная модель конформаций хроматиновых волокон со смещенными регистрами, которые связаны медленными (> 100 мс) и быстрыми процессами декомпакции (150 мкс), которые не протекают напрямую, а скорее через открытое волокно. конформация. Рисунок 1B был воспроизведен с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018, Nature Communications с разрешения, опубликованном под Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0; https: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /).
© 2018, Kilic et al. Панель B была воспроизведена с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018 с разрешения, опубликованного в соответствии с Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0.
Несколько методов были использованы для определения структурных ансамблей, таких как ЯМР, одночастичная криоЭМ или XL-MS, а недавно также smFRET в интегративном / гибридном (I / H) подходе с компьютерным моделированием для преодоления разреженности экспериментальных данных. относительно атомистического описания (Берман и др., 2019; де Соуза и Пикотти, 2020; Димура и др., 2020; Gauto et al., 2019; Кукос и Бонвин, 2020; На и Пэк, 2020; Тан и Гонг, 2020; Webb et al., 2018). Структурные модели I / H, полученные из экспериментов smFRET с использованием расстояний между красителями в качестве ограничений, были описаны для гибких свернутых белков (Brunger et al., 2011; Hellenkamp et al., 2017; Margittai et al., 2003; McCann et al., 2012). ), конформационные ансамбли неупорядоченных / неструктурированных и развернутых белков (Borgia et al., 2018; Holmstrom et al., 2018; Schuler et al., 2020), нуклеиновые кислоты и комплексы белок-нуклеиновая кислота (Craggs et al., 2019; Craggs, Kapanidis, 2012; Kalinin et al., 2012; Lerner et al., 2018b; Muschielok et al., 2008). ; Возняк и др., 2008).
Еще одним уникальным аспектом исследований smFRET является то, что структурная, кинетическая и спектроскопическая информация о больших и сложных системах может быть записана одновременно в одном измерении. Это облегчает объединение динамической и структурной информации в интегративный подход к (рис. 1A) (Hellenkamp et al., 2017; Килич и др., 2018; Ли и др., 2020b; Санабрия и др., 2020; Вассерман и др., 2016; Янез Ороско и др., 2018):
.
определяют количество возможных структур, согласующихся с данными,
потенциально снижает неоднозначность между различными структурными моделями, совместимыми с экспериментальными данными, а
раскрывают структурно разрешенные динамические пути обмена.
В качестве примера на рисунке 1B показан результат мультимодального исследования smFRET конформационного ландшафта 12-мерного массива хроматина (~ 2.5 MDa) (Kilic et al., 2018) с динамикой, происходящей во временных масштабах от наносекунд до часов. SmFRET эксперименты могут обнаруживать гибкие конформации хроматина (Рисунок 1B, средняя панель), показывая их динамическую структурную неоднородность (Рисунок 1B, нижняя панель), в отличие от хорошо упорядоченных статических структур хроматиновых волокон (Рисунок 1B, верхняя панель). Эти гибкие, частично открытые и открытые конформации, которые довольно многочисленны в растворе (популяция> 70%; рис. 1B, нижняя панель), не были разрешены ранее, хотя они необходимы для правильной организации и функции гена.Они представляют собой центральный узел взаимопревращений для отдельных регистров стэкинга хроматина и их трудно обнаружить с помощью других структурных методов. Такой подход к визуализации биомолекул в действии в условиях окружающей среды подчеркивает важность их динамической природы путем разрешения переходов между различными конформационными состояниями, что во многих случаях способствует их функции (Aviram et al., 2018; Henzler-Wildman et al., 2007; Iljina et al., 2020; Lerner et al., 2018b; Sanabria et al., 2020; Tassis et al., 2020).
Измерения
SmFRET обычно выполняются с использованием двух подходов: с использованием иммобилизованных на поверхности молекул с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) и обнаружения на основе камеры или со свободно диффундирующими молекулами в растворе с использованием конфокальной микроскопии и точечных детекторов. Экспериментальные системы имеются в продаже, но обычно их изготавливают самостоятельно. Образцы подготавливаются, а данные собираются с использованием протоколов для конкретных лабораторий, где данные хранятся в различных форматах файлов и анализируются с использованием набора все более мощного программного обеспечения.Для полевых исследований в целом и для структурных исследований в частности важно продемонстрировать, что smFRET как метод воспроизводим и надежен независимо от того, где и как измеряется образец. С этой целью под руководством Торстена Хугеля двадцать лабораторий объединились для измерения smFRET на нескольких конструкциях дцДНК (Hellenkamp et al., 2018a). Изучая шесть различных образцов с разными красителями и различными расстояниями между красителями, средняя эффективность FRET, полученная участвующими лабораториями, показала удивительно высокую степень согласия (ΔE между 0.02 и 0,05 в зависимости от деталей образца). Количественная оценка и воспроизводимость измерений smFRET на основе интенсивности и обсуждение анализа данных стали важной вехой. Эти стандарты дцДНК FRET теперь доступны для ежедневной калибровки и особенно полезны для новых групп, присоединяющихся к сообществу.
Вдохновленный идеями, полученными в ходе вышеупомянутой попытки FRET (Hellenkamp et al., 2018a), были начаты новые многолабораторные слепые исследования.Следующее сравнительное исследование FRET, проведенное Thorben Cordes, исследует надежность и надежность экспериментов smFRET на белках, претерпевающих индуцированные лигандом конформационные изменения (Gebhardt et al., В стадии подготовки). В этом исследовании используются два различных модельных белка для оценки воспроизводимости и точности smFRET на основе белков для измерения расстояния между красителями. Белковые системы ставят новые задачи, включая статистическую маркировку красителей, специфические для сайта свойства красителей, стабильность белков, транспортировку, хранение и конформационную динамику.Следовательно, в исследовании также оценивается способность smFRET обнаруживать и количественно оценивать динамику в различных временных масштабах от микросекунд до секунд. Еще одна задача FRET, инициированная Соней Шмид, — это программа kinSoftChallenge (http://www.kinsoftchallenge.com, Götz et al., В стадии подготовки), которая оценивает существующие инструменты для извлечения кинетической информации из временных траекторий одиночных молекул. Эта задача направлена на: (1) продемонстрировать способность кинетического анализа на основе smFRET точно выводить динамическую информацию и (2) предоставить сообществу средства оценки различных доступных программных инструментов.
Одним из важных результатов различных исследований FRET в нескольких лабораториях было то, что, хотя согласие было хорошим, его можно было улучшить еще больше. В частности, анализ данных и, в частности, исправления могут повлиять на определенную эффективность FRET и результирующие расстояния. Следовательно, открытое обсуждение того, какие подходы работают наиболее надежно, при каких условиях необходимо. Доступ к первичным данным и возможность их обработки с помощью различных подходов к анализу были и останутся наиболее прозрачным способом продвижения вперед в этой области.В настоящее время это сложно, учитывая множество вариантов используемых методов, их документации, форматов файлов и экспериментальных процедур, применяемых в разных лабораториях, для установления оптимальных условий, рабочего процесса и передовых практик даже для существующих, хорошо протестированных методов, поскольку сравнение этих методов является сложной задачей требует много времени, а необходимая информация во многих случаях недоступна. С расширением открытых научных практик и представлением опубликованных данных в репозитории необходим консенсус относительно того, какие данные и метаданные следует хранить и в каких возможных форматах, чтобы их могло легко использовать сообщество.
В связи с этими соображениями и множеством возможностей для роста сообщества smFRET, несколько лабораторий, обладающих опытом в FRET, без претензии на исчерпывающий или исключительный характер, собрались, чтобы поддержать эти усилия и предложить шаги по организации сообщества вокруг последовательной и открытой науки. практики. Это действие переводится в общие методологические рекомендации или предложения, которые мы представляем после типичного рабочего процесса эксперимента smFRET, включая подготовку и определение характеристик образцов, описание установки, сбор и сохранение данных, а также анализ данных.Эти рекомендации о том, как «практиковать» smFRET, являются не попыткой систематизировать сообщество, а скорее первоначальным предложением, которое направлено на поощрение открытого диалога о существующих методах в нашей области и приводит к более высокой воспроизводимости результатов экспериментов smFRET. Затем мы обсуждаем практику открытой науки, а также первые шаги, которые были предприняты для формирования международного сообщества FRET. В завершение мы выделим несколько областей, в которых smFRET окажет большое влияние в различных областях науки в ближайшем будущем.
Когда использовать пониженную передачу | Советы по вождению в Центральном Иллинойсе
Когда использовать пониженную передачу | Советы по вождению в Центральном Иллинойсе | Сэм Леман Automotive Group Сохраненные автомобили
СОХРАНЕННЫЕ ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДСТВА
У вас нет сохраненных машин!
Ищите эту ссылку в избранном:

Если вы когда-нибудь задавались вопросом, когда использовать пониженную передачу, или спрашивали себя: «Что такое пониженная передача в машине?» мы можем сказать вам, что вы не одиноки.Несмотря на то, что почти все автомобили с автоматической коробкой передач имеют пониженную передачу, многие не знают точно, что это такое и каково ее предназначение. Не волнуйтесь: понять низкую передачу не так уж и сложно, и вы будете ценить информацию, когда будете проезжать мимо.
Если вам когда-либо говорили, что вам следует переключиться на более низкую передачу, вашей первой реакцией могло быть замешательство. Ведь у вас коробка автомат! Низкая передача — это настройка, которая может помочь уменьшить количество топлива, используемого вашим двигателем.За счет снижения частоты вращения двигателя и последующего увеличения крутящего момента пониженная передача позволяет вам преодолевать сложные препятствия или плохие дорожные условия, с которыми вы можете столкнуться при проезде через или.
Теперь вы узнали, что такое пониженная передача в автомобиле, и, возможно, захотите попробовать это. Однако сначала вы должны знать, когда использовать низкую передачу, а когда оставить настройку в покое. Водитель автомобиля с автоматической коробкой передач может переключиться на пониженную передачу по двум основным причинам:
Буксировка тяжелого груза : Если вы буксируете прицеп, лодку или другое транспортное средство, вам может потребоваться немного дополнительной мощности, чтобы начать движение.Естественно, вы можете не возражать против того, чтобы двигаться немного медленнее, поэтому имеет смысл отпустить педаль газа и начать движение на пониженной передаче. Дополнительный крутящий момент от нижней передачи позволяет максимально использовать мощность вашего автомобиля.
Движение под уклоном : Были ли у вас проблемы с подъемом на длинный крутой холм? Если это так, вам, вероятно, следовало позволить вашей коробке передач переключиться на пониженную передачу. Ваш двигатель будет усердно работать, чтобы поднять вас вверх по склону, а дополнительный крутящий момент двигателя позволяет каждому всплеску мощности поднять вас чуть дальше.
Район рядом и вряд ли известен своими холмами, но если вы планируете буксировать крупногабаритные грузы, неплохо сначала попрактиковаться в переключении на низкую передачу. Это позволит вам лучше понять свои ограничения и возможности. Ищете новый автомобиль, который поможет вам продвинуться дальше? В нашем новом каталоге автомобилей вы найдете множество мощных автомобилей с автоматической коробкой передач, грузовиков и внедорожников.
По более подробным техническим вопросам о том, когда использовать пониженную передачу, обращайтесь к специалистам нашего сервисного отдела.Пока вы занимаетесь этим, вы можете узнать, как использовать лепестковые переключатели, а также когда заменять свечи зажигания. Мы также будем рады обсудить лучшие дизельные двигатели или важность GVWR.
Обладая репутацией надежного производителя и надежных буксировщиков, RAM 1500 разработан для решения задач на вашей рабочей площадке в Центральном Иллинойсе.Если вам нужен пикап, который является настоящей рабочей лошадкой, вам стоит взглянуть на комплектацию RAM 1500 2021 года, чтобы выбрать модель…
Jeep Renegade — одна из самых популярных моделей в линейке Jeep, предлагающая высокие характеристики и превосходные внедорожные качества. Наряду с этими надежными характеристиками этот компактный внедорожник Jeep также оснащен удобными функциями, которые улучшат любую поездку в районе Центрального Иллинойса.Возможно, лучше всего будет Jeep Renegade 2021 года…
Если вы покупаете универсальный и хорошо оборудованный внедорожник, который может выполнять двойную работу в качестве комфортного пассажира пригородных поездов и путешественника по бездорожью, новый Jeep Cherokee идеально подходит для вас. На выбор предлагается девять различных конфигураций Jeep Cherokee, включая варианты Jeep Cherokee 4 × 4, а также широкий спектр функций, которые добавляют…
.
ИДТИ
Сохранено
СОХРАНЕННЫЕ ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДСТВА
У вас нет сохраненных машин!
Ищите эту ссылку в избранном:

СОВЕТЫ АВТОНОМУ 30 июля 2019
Советы по вождению автомобиля с ручным переключением передач
Рукоять — это навык, которым должен владеть каждый водитель.Однако многим автомобилистам просто не хватает уверенности в том, чтобы учиться. Хотя управление механической коробкой передач может показаться немного пугающим, на самом деле это не так уж и сложно, когда вы к ней привыкнете.
Вот несколько советов, которые следует иметь в виду, прежде чем попробовать:
Практика там, где никто не занят
Если в подростковом возрасте вы брали уроки вождения, вас не бросили на волю. Скорее всего, вы начали с парковки или на тихой дороге и продвигались вверх по мере того, как уроки прогрессировали.Такой же подход следует использовать и для вождения клюшки. Начните медленно и успокойтесь, прежде чем выйдете на оживленные улицы.
Не волнуйтесь, если вы остановитесь
Если вы только учитесь водить клюшку, это почти гарантия того, что вы заглохнете из-за слишком быстрого нажатия сцепления. Не волнуйтесь, если это произойдет, так как это происходит со всеми, когда они только начинают. Просто обязательно тренируйтесь, когда дороги не загружены, так как это может стать реальной проблемой, если вы едете по дороге от бампера к бамперу.
Используйте обе ножки
Использование обеих ног за рулем может быть непривычным ощущением, если вы годами водили только правой рукой.
К счастью, вы по-прежнему будете использовать правую ногу для торможения и ускорения, поэтому здесь ничего не изменится. Единственная разница будет заключаться в использовании левой ноги для регулировки сцепления. Помните, что сцепление необходимо для плавного переключения передач.
Перед запуском проверьте переключатель передач
Перед запуском двигателя обязательно удерживайте сцепление и убедитесь, что ваш автомобиль находится на нейтрали, прежде чем включать зажигание.Ваш переключатель передач будет в центре, если он уже находится в нейтральном положении. Если это не так, переместите его туда перед запуском.
Вы также должны убедиться, что задействован стояночный или аварийный тормоз.
Удачи
Причина, по которой многие водители предпочитают водить джойстик, заключается в том, что это обычно делает поездку немного более приятной. Это также может помочь вам не потерять сознание за рулем, поскольку в этом виноваты многие автомобилисты, использующие автоматическую коробку передач.
Знайте, когда нужно переключать передачи
Важно знать, когда нужно переключать передачи.
Вообще говоря, вы должны переключаться с первого на второй со скоростью 15 км / ч, со второго на третий со скоростью 30 км / ч, с третьего на четвертый со скоростью 50 км / ч, с четвертого на пятый со скоростью 60-65 км / ч и с пятого на шестое при 75 км / ч. Этот процесс тот же, что и при переключении на пониженную передачу, только наоборот.
Помните, что всякий раз, когда вы переключаете передачу, вы должны при этом нажимать сцепление полностью до пола. Не волнуйтесь, если это покажется сложным. Может потребоваться несколько раз, чтобы привыкнуть к переключению передач, но со временем вы это почувствуете.
Как работает автоматическая коробка передач?
По словам Майнеке, в большинстве автомобилей используется автоматическая трансмиссия, называемая гидравлической планетарной автоматической трансмиссией, которая также используется в увеличенной версии в некотором промышленном и коммерческом оборудовании и большегрузных транспортных средствах. Фрикционная муфта заменена гидравлической муфтой, и система определяет набор диапазонов передач в зависимости от потребностей автомобиля. Когда вы ставите автомобиль на стоянку, все передачи блокируются, чтобы предотвратить скатывание автомобиля вперед или назад.
Менее распространенным вариантом является автоматическая механическая коробка передач (AMT). Эта модель, которую иногда называют полуавтоматической трансмиссией, объединяет сцепления и шестерни механической трансмиссии с набором исполнительных механизмов, датчиков, процессоров и пневматики. AMT работают как автоматические трансмиссии, обеспечивая при этом преимущества механической коробки передач по доступной цене и экономии топлива. С этим типом трансмиссии водитель может вручную переключать передачи или выбирать автоматическое переключение. В любом случае ему или ей не нужно использовать сцепление, которое приводится в действие гидравлической системой.
История автоматической трансмиссии
General Motors и REO выпустили полуавтоматические трансмиссии для транспортных средств в 1934 году. Эти модели создавали меньше проблем, чем традиционная механическая трансмиссия, но все же требовали использования сцепления для переключения передач. Коробка передач GM была первой в своем роде, в которой использовалась планетарная коробка передач с гидравлическим управлением, позволяющая переключать передачи в зависимости от скорости движения автомобиля.
Планетарная трансмиссия была одним из важнейших достижений на пути к современной автоматической трансмиссии.Хотя GM была первой, кто использовал версию с гидравлическим управлением, эта технология на самом деле восходит к изобретению Уилсона-Пилчера в 1900 году. Это нововведение состояло из четырех передач переднего хода на двух поездах, которые можно было переключать одним рычагом.
Работа автоматической коробки передач
Наиболее распространенный тип автоматической трансмиссии использует гидравлическую энергию для переключения передач. Согласно How Stuff Works, это устройство сочетает в себе преобразователь крутящего момента или гидравлической муфты с зубчатыми передачами, которые обеспечивают желаемый диапазон передач для транспортного средства.Гидротрансформатор соединяет двигатель с трансмиссией и использует жидкость под давлением для передачи мощности на шестерни. Это устройство заменяет ручное фрикционное сцепление и позволяет автомобилю полностью останавливаться без остановки.
Информация от Art of Manliness описывает работу автоматической коробки передач. Когда двигатель передает мощность насосу преобразователя крутящего момента, насос преобразует эту мощность в трансмиссионную жидкость, которая приводит в действие турбину преобразователя крутящего момента. Этот аппарат увеличивает мощность жидкости и передает еще большую мощность обратно на турбину, что создает вихревое вращение, которое вращает турбину и прикрепленный к ней центральный вал.Мощность, создаваемая этим вращением, затем передается от вала к первой планетарной передаче трансмиссии.
Этот тип трансмиссии имеет так называемое гидравлическое управление. Трансмиссионная жидкость нагнетается масляным насосом, который позволяет изменять скорость в зависимости от скорости автомобиля, оборотов шин в минуту и других факторов. Шестеренчатый насос расположен между планетарной передачей и гидротрансформатором, где он вытягивает трансмиссионную жидкость из картера и повышает ее давление.Вход насоса ведет непосредственно к корпусу преобразователя крутящего момента, прикрепленному к гибкой пластине двигателя. Когда двигатель не работает, трансмиссия не имеет давления масла, необходимого для работы, и, следовательно, автомобиль не может быть запущен нажатием кнопки.
Планетарный редуктор — это механическая система, в которой шестерни соединены с помощью набора лент и муфт. Когда водитель переключает передачу, ленты удерживают одну передачу неподвижно, вращая другую, чтобы передавать крутящий момент от двигателя и увеличивать или уменьшать передачи.
Различные шестерни иногда называют солнечной шестерней, коронной шестерней и планетарной шестерней. Расположение шестерен определяет, сколько мощности будет передаваться от одной передачи к другой и передаваться на трансмиссию транспортного средства при переключении передач.
Шестерни автоматической коробки передач
Шестерни автоматической коробки передач включают следующее:
Согласно «Как работает автомобиль», когда вы переключаете свой автомобиль на движение, вы включаете все доступные передаточные числа передних передач.Это означает, что трансмиссия может переключаться между полным диапазоном передач по мере необходимости. Шестиступенчатые автоматические коробки передач — это наиболее распространенное количество передач, но старые автомобили и компактные автомобили начального уровня могут по-прежнему иметь четыре или пять автоматических передач.
Третья передача либо блокирует трансмиссию на третьей передаче, либо ограничивает ее передаточными числами первой, второй и третьей передач. Это обеспечивает мощность и тягу, необходимые для подъема или спуска, а также для буксировки лодки, дома на колесах или прицепа. Когда двигатель достигает заданного уровня оборотов в минуту (об / мин), большинство транспортных средств автоматически переключает третью передачу, чтобы двигатель не повредился.
Вторая передача либо блокирует трансмиссию на второй передаче, либо ограничивает ее передаточными числами первой и второй передач. Эта передача идеально подходит для подъемов и спусков на скользкой дороге, а также для езды на льду, снегу и в других ненастных погодных условиях.
Первая передача используется, когда вы хотите заблокировать трансмиссию на первой передаче, хотя некоторые автомобили автоматически выключают эту передачу для защиты двигателя при определенных оборотах. Как и вторую и третью передачи, эту передачу лучше всего использовать для буксировки, движения в гору или под гору, а также при движении по скользкой или обледенелой дороге.
Преимущества автоматической трансмиссии
Согласно How Stuff Works, самым большим преимуществом автоматической трансмиссии является способность двигаться без сцепления, как это требуется для механической трансмиссии. Лица с различными формами инвалидности могут управлять автомобилем с использованием автоматической коробки передач, поскольку для этого требуются только две пригодные для использования конечности.
Отсутствие сцепления также устраняет необходимость уделять внимание ручному переключению передач и контролю тахометра, чтобы сделать необходимые переключения, что дает вам больше внимания, чтобы сосредоточиться на задаче вождения.
Многим водителям также легче управлять автоматической коробкой передач на низких скоростях, чем механической коробкой передач. Гидравлическая автоматическая трансмиссия создает явление, называемое проскальзыванием на холостом ходу, которое заставляет автомобиль двигаться вперед даже на холостом ходу.
Информация и исследования в этой статье проверены сертифицированным специалистом ASE Duane Sayaloune из YourMechanic.com . Для любых отзывов или запросов на исправление, пожалуйста, свяжитесь с нами по телефону research @ caranddriver.ком .
Источники:
https://www.meineke.com/blog/how-an-automatic-transmission-works/
https://auto.howstuffworks.com/automatic-transmission.htm
https: //www.howacarworks.com/basics/how-automatic-gearboxes-work
Gearhead 101: Understanding Automatic Transmission
https://auto.howstuffworks.com /automatic-transmission12.htm
Этот контент создается и поддерживается третьей стороной и импортируется на эту страницу, чтобы помочь пользователям указать свои адреса электронной почты.Вы можете найти больше информации об этом и подобном контенте на сайте piano.io.
.
No related posts.

Официальный сайт LADA

Лидеры российского рынка автострахования совместно с АВТОВАЗом запустили массовые программы доступно

LADA Vesta получит автоматическую трансмиссию

Тест-драйв первой Lada Granta с автоматической коробкой передач

Статьи | Автосалон Гэмбл — официальный дилер LADA в Самаре

Ремонт АКПП LADA в Москве, цены на ремонт автоматической коробки передач

Преимущества обслуживания в сервисных центрах АвтоГЕРМЕС

Две коробки. Какие автоматы Lada и УАЗ теперь ставят на свои машины? | Об автомобилях | Авто

Как будут выглядеть новые универсалы Lada Vesta SW Cross и Vesta SW

Как будут выглядеть новые универсалы Lada Vesta SW Cross и Vesta SW

Две ступени у вариатора

Из Индии в Ульяновск

«Буханка» и ещё 8 легендарных автомобилей, которые не сходят с конвейера

«Буханка» и ещё 8 легендарных автомобилей, которые не сходят с конвейера

Тест-драйв LADA Granta: теперь — на «автомате»

Понимание FRET как инструмента исследования сотовой связи

Двухканальное измерение коэффициента излучения или возбуждения

Трехканальное измерение излучения

Введение в технологию флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и ее применение в биологических науках

Измерение

Некоторые примеры

Проблемы

Приложения FRET

Список литературы

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — Общие понятия

Вводные понятия

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

Таблица 1

Соавторы

Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки

Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.

Когда использовать пониженную передачу | Советы по вождению в Центральном Иллинойсе

СОХРАНЕННЫЕ ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДСТВА

Что такое пониженная передача в автомобиле?

Когда использовать низкую передачу

Посетите Sam Leman Automotive Group, чтобы узнать больше

Ещё от Sam Leman Automotive Group

2021 RAM 1500 Уровни отделки салона

2021 Jeep Renegade Цена

2021 Уровни отделки салона Jeep Cherokee

Поиск по ключевому слову

Поиск по фильтрам

Добавить комментарий Отменить ответ

Рубрики