Лада 4х4 новой генерации фото: первые подробности и изображения :: Autonews

первые подробности и изображения :: Autonews

Выход «Нивы» совершенного нового поколения отложен с 2022 на 2024 год. При этом автомобиль третьей генерации не будет похожим на концепт 4×4 Vision, представленный летом 2018-го года на автосалоне в Москве. Autonews.ru публикует рендеры серийной Lada Niva 2024 модельного года с предположительной внешностью модели.

Ретро-дизайн в стиле классической «Нивы»

Дизайн новой машины не будет иметь практически ничего общего с концепт-каром 4×4 Vision, представленным в 2018-м году на автосалоне в Москве. Хотя новый главный дизайнер АвтоВАЗа Жан-Филлип Салар уже пообещал, что некоторые фамильные черты нынешнего «икс»-стиля Lada, которые были придуманы прошлым стилистом марки Стивом Маттином, конечно же, останутся в облике Lada.

Вместе с тем на недавнем мероприятии Renaulution был представлен первый скетч грядущей Niva и, судя по всему, внешность новой машины будет очень сильно перекликаться с классическим автомобилем, который теперь называется Lada Niva Legend.

При этом наряду с новой моделью текущие версии автомобиля с приставкой Travel и Legend будут продолжать продаваться. А это значит, что Niva станет своего рода суббрендом Lada, в который будет входить целое семейство из внедорожников и кроссоверов. Более того, они станут международными и будут доступны на многих рынках мира, включая европейские.

Машина сохранит фамильные черты декоративных прорезей-воздухозаборников на задних стойках. При этом новая «Нива» будет предлагаться исключительно в пятидверном варианте, а трехдверка останется лишь в линейке модификаций Niva Legend. (Фото: Autonews.ru)

Вероятнее всего, машина сохранит фамильные черты декоративных прорезей-воздухозаборников на задних стойках. При этом новая «Нива» будет предложена исключительно в пятидверном варианте, а трехдверка останется лишь в линейке модификаций Niva Legend.

Новая платформа от группы Renault и унификация с Dacia

Новое поколение автомобиля будет построено на совершенно новой платформе, которую компания Renault специально разработала для своих дочерних брендов. Эта «тележка» называется CMF-B и уже используется румынской Dacia на новых Logan и Sandero. Она более современная, чем прежняя устаревший платформа B0, однако не столь передовая, как CMF-A, которая лежит в основе новых Clio, Megan и европейского Captur.

Руководство Renault уже не раз заявляло о том, что марки Dacia и Lada будут теснее взаимодействовать в разработке новых моделей, поэтому, конечно же, в новой «Ниве» стоит ждать много унификаций с Dacia Duster и Renault Duster для нашего рынка.

Например, от них «Нива» позаимствует систему полного привода. Трансмиссия 4х4 будет осуществлена по той же схеме, которая сейчас используется на «Дастере». В ее основе окажется многодисковая электронно-управляемая муфта, которая может блокироваться для распределения тяги в различных пропорциях между осями автомобиля.

Автомобиль «Нива» третьей генерации не будет похожим на концепт 4×4 Vision, представленный летом 2018-го года на автосалоне в Москве. (Фото: АвтоВАЗ)

По умолчанию в режиме 2WD «Нива» будет переднеприводной, а при переходе в автоматический режим трансмиссии AUTO крутящий момент между осями будет перераспределятся исходя из дорожного покрытия под колесами и их проскальзывания и пробуксовки.

Кроме того, будет и режим LOCK, в котором межосевая муфта будет блокироваться и делить момент между передом и задом поровну в пропорции 50:50.

Впрочем, не исключено, что «Ниве» будет уготовлен имидж самого внедорожного автомобиля во всей линейке моделей группы Renault. Поэтому высока вероятность, что инженеры АвтоВАЗа добавят к имеющейся трансмиссии еще и пониженную передачу.

Турбомотор и двухпедальная версия

Линейка двигателей также будет унифицирована с другими моделями Renault и Dacia. Базовым мотором, скорее всего, станет 1,6-литровый «атмосферник» мощностью 114 лошадиных сил, который уже сейчас устанавливается на младшей модели Renault в России, а также на Lada Vesta. Этот двигатель будет сочетаться как с механикой, так и с вариатором.

Старшим силовым агрегатом, скорее всего, станет новый 1,3-литровый турбомотор, который был разработан «реношниками» совместно с концерном Daimler и уже устанавливается на второе поколение российского Duster, а также на кроссовер Arkana. Этот мотор также будет работать как с механической коробкой с шестью передачами, так и с вариатором.

Судя по представленному на мероприятии Renaulution скетчу, внешность новой машины будет очень сильно перекликаться с классическим автомобилем, который теперь называется Lada Niva Legend.

(Фото: АвтоВАЗ)

Так что наличие бесступенчатых трансмиссий в активе Lada говорит о том, что в первые в истории в гамме Niva появится двухпедальная версия.

Интерьер в стиле Tesla и куча опций

Оформление салона новой Niva будет максимально простым и функциональным. Но при этом машина получит ряд технологических игрушек, которые в корне будут менять восприятие интерьера Lada.

Например, передняя панель будет оформлена в стиле обновленной Lada Vesta с использованием мотивов из автомобилей Tesla и Volvo с вертикально-ориентированным дисплеем медиасистемы, а также большим количеством сенсорных поверхностей. Кроме того, помимо опций комфорта новая Niva получит достаточно широкую линейку водительских ассистентов и систем превентивной безопасности, большая часть которых будет ориентирована как раз на помощь во время езды по бездорожью.

Среди опций будет доступна система помощи при старте на подъеме, а также система спуска с горы.

Lada Niva 2024 получит и систему камера кругового обзора, которая позволит не только облегчить маневрирование на парковке в ограниченном пространстве, но также будет служить очень полезным ассистентом на бездорожье.

Оформление салона новой Niva будет максимально простым и функциональным. Но при этом машина получит ряд технологических игрушек, которые в корне будут менять восприятие интерьера Lada. (Фото: www1.fips.ru)

5 вариантов новой Нивы — какой вам по душе? — журнал За рулем

Вспоминаем, как на АВТОВАЗе придумывали новую Ниву и почему сегодняшний вариант вызывает дежавю.

Материалы по теме

Первое поколение Нивы, теперь известное под названием Niva Legend, появилось в модельном ряду ВАЗа в далеком 1977 году. С тех пор модель пережила две крупные модернизации и несколько «косметических операций», а также породила второе поколение внедорожников, теперь именуемое Niva Travel.

У нас есть изображение, указывающее на внешность третьего поколения, которое в 2024 году станет еще одной моделью в семействе Нива — все три генерации будут выпускаться параллельно как минимум до 2026 года.

Вероятно, у многих в момент показа тизера новой Niva возникло ощущение, что где-то такое уже попадалось. Конечно, представленная внешность опирается на облик классического ВАЗ-2121 Нива, но как будто дело не только в этом.

Создание облика внедорожника новой генерации на АВТОВАЗе началось еще до прихода Стива Маттина. И даже когда британец уже находился в статусе главного дизайнера Лады, за новую Lada 4×4 (тогда бренд Niva принадлежал GM) он взялся далеко не сразу, ограничившись освежением внешности старой и представив Lada 4×4 Urban.

Новая Нива. Начало (2012–2014)

Что касается так называемой Lada 4×4 New, то на АВТОВАЗе она некоторое время виделась брутальным, немного угловатым автомобилем, наследницей прежнего стиля. Поговаривали, что в плане конструктива есть пересечения со вторым поколением Chevrolet Niva, которому, как мы теперь знаем, не суждено было появиться.

Из утечек информации с предприятия было известно также, что планируется две версии — трех- и пятидверная. Один из поисковых вариантов (на фото выше) в 2014 году засветился на шпионских изображениях.

А спустя целых три года в Сети появилось еще одно фото, относившееся к тому же 2014 году — так трехдверная Lada 4×4 изображалась тогда в презентации по развитию модельного ряда:

Нива из параллельной Вселенной (2012–2017)

Все эти годы представить новый вазовский внедорожник пытались и независимые дизайнеры. Вариантов сделано множество, но один из них наделал шума — и запомнился — больше остальных. Именно работа дизайнера Дмитрия Дьяченко, творящего под псевдонимом Hexxen, вызывает сегодня этот эффект узнавания: кажется, что Жан-Филипп Салар, новый дизайнер Lada, изрядно «вдохновился» проектом Hexxen.

Представитель сообщества Новая Lada Niva 2024 связался с Дмитрием Дьяченко, и вот как он сам рассказывает о своей работе и комментирует это разительное сходство: «Вдохновением служила, многим сложно в это поверить, — Нива! Через это любой другой проект Нивы, автор которого бережно отнесся к оригиналу, будет так или иначе похож на мой». С 2012 по 2017 годы Дьяченко нарисовал несколько вариантов разной степени проработки, публикуя их на сайте cardesign.ru. Тем временем официальный фирменный стиль АВТОВАЗа уверенно свернул в сторону маттиновского X-face.

Эпоха Маттина — Lada 4×4 Vision (2018–2021)

В 2018 году концепт Lada 4×4 Vision произвел эффект разорвавшейся бомбы — казалось, что поклонники вазовских внедорожников готовы простить все: и более чем вероятный переход на «паркетную» платформу Renault Duster, и даже эти, вызывающие столько споров подштамповки на боковинах. Ведь, несмотря на все свойственные Стиву Маттину изыски (понятные и вполне объяснимые на концепте), внешность получилась весьма гармоничной и обнаруживающей фамильное сходство с оригинальной Нивой.

Нива-2024: какой она будет на самом деле

Однако вера в такое вероятное будущее российских внедорожников оказалась недолгой. На момент написания этого материала (январь 2021 года) Lada 4×4 Vision все еще значится среди концептов на официальном сайте Lada, однако уже понятно, что даже там, в «диджитале», дни ее сочтены. По неофициальным данным, стиль X-face не жаловал сам новый глава Renault Лука де Мео — якобы именно с этим связан и уход Маттина, и тотально перекроенный вид внедорожника — показанного на тизере 14 января 2021 года уже как Lada Vision.

Материалы по теме

Проект новой Нивы появился на АВТОВАЗе еще в начале 2010-х, хотя отдельные «заходы на тему» возникали и задолго до этого. За это время бренд Lada сменил по меньшей мере трех главных дизайнеров — Евгений Лобанов, Стив Маттин, Жан-Филипп Салар.

На сегодняшний день официально подтверждено, что новая Niva будет иметь французскую платформу CMF-B (равно как и остальные новинки Lada до 2025 года) и внешность, общие черты которой показаны на последнем изображении. И, как и прежде, запланированы две версии — трех- и пятидверная. В серийное производство Niva должна запуститься в 2024 году.

Придется ли по душе поклонникам новая внешность? Нет ли у них ощущения, что в какой-то момент эволюция дизайна Нивы свернула не туда? Или, напротив, сделала очень правильный поворот? Ждем ваших комментариев по теме.

Фото: carobka.ru, kolesa.ru, Дмитрий Дьяченко/Hexxen, АВТОВАЗ, Renault

Запатентован дизайн новой Lada 4х4 Vision

В мировой паутине пестрят фотографии нового усовершенствованного внедорожника марки LADA, выпуски автомобильных журналов нарекли его как новую генерацию модели 4×4. В раскрытой графе Федерального института индустриального имущества обоснованно возникло свидетельство за гос. номером 114433, патентообладателем интеллектуальной собственности которой значится Публичное акционерное общество «АВТОВАЗ». На самом деле, отечественный гигант по производству автомобилей просто оформил патент на новый концепткар Lada 4х4 Vision, который был представлен осенью прошлого года на Московском международном автосалоне MMAC.

Внешний вид автомобиля нового уровня будет не значительно отличаться от представленного на выставке. Для экспозиции пропорции внедорожника были специально изменены: удлинили насколько это возможно капот, поставили большие колеса и уменьшили пространство остекления.

Преемника старой доброй Нивы на конвейер планируется поставить в пяти дверном исполнении, а задние, даже в серийной версии, будут весьма малогабаритными. Изобразить новую генерацию внедорожника «визуально трех дверным» конструкторам предложили маркетологи, чтобы развести между собой марки “Lada” и  «Reno».  Duster будет завлекать автолюбителей зрелого возраста, а Niva наоборот.

Важно напомнить, что московский концепт был разработан на шасси полноприводной версии «Дастера». Без всяких колебаний можно сказать, что новый автомобиль будет строиться на платформе альянса Renault-Nissan для среднеразмерных автомобилей под названием CMFB-LS, это означает, что новая модель внедорожника Lada 4х4 Vision технически не будет ничем отличаться от популярного внедорожника марки «Рено». За счет этого ценовая политика будет весьма приемлемой. Производство нового поколения модели Нивы планируется наладить не раньше 2021 года. Такую информацию ранее озвучил бывший президент АВТОВАЗа Николя Мор.

Раздел: Нива 4х4 Vision

Чем будет «нафаршировано» новое поколение LADA 4х4 » LADA 4×4 Club | Лада Нива Клуб

Чем будет «нафаршировано» новое поколение LADA 4х4

В следующем году легендарная «Нива» отметит очередной юбилей. Прародителю всех кроссоверов на 40-летие АВТОВАЗ подготовит сюрприз — новую генерацию внедорожника. Мы собрали некоторые известные факты и попробовали спрогнозировать оснащение этого автомобиля.

Двигатель

Новая версия LADA 4х4 уже точно получит новый мотор объёмом 1.8 литра. Этот агрегат адаптирован под полный привод, о чем сотрудники АВТОВАЗа неоднократно упоминали на общественных мероприятиях. Появление турбированного мотора под капотом внедорожника возможно, но по заявлениям специалистов, отвечающих за разработку новых двигателей, это будет агрегат объёмом 1.4 литра и мощностью не более 150 л.с. Комплектовать новый внедорожник не испытанным двигателем довольно рискованный шаг. Тем более, что, судя по ежеквартальному отчёту АВТОВАЗа, двигатель 1.8 литра будут внедрять в Chevrolet Niva, а это значит, что именно им и оборудуют новую генерацию LADA 4х4.

Ходовая часть

Конструкция полного привода должна перекочевать на новый внедорожник от существующей модели LADA 4х4. Насколько её усовершенствуют, точной информации нет, но факт остаётся фактом — принцип её работы позволяет длительное время передвигаться по бездорожью без опасения получить серьёзную поломку. А этот русский автомобиль должен остаться полноценным внедорожником с возможностями реального преодоления бездорожья. Любимая европейцами муфта сзади вместо моста, скорее всего, появится на кроссовере LADA XRAY. Заимствованная платформа B0 более подходит для подобного решения и требует меньших затрат на внедрение.

Варианты кузова

Новая LADA 4х4 будет выпускаться в трёх и пятидверном варианте. Только в отличие от существующей длинной версии LADA (2131), новая «Нива» будет обладать лучшей проходимостью на бездорожье. Этого удастся добиться за счёт новой конструкции кузова, которая позволит лучше распределять вес на каждое колесо. Что же касается расположения запасного колеса, то оно будет не под капотом, как у хорошо известной во всем мире LADA 4х4 и даже не на пятой двери, как у Chevrolet Niva. По подобию современных автомобилей, оно должно перекочевать в нишу багажника.

Оснащение

Количество электронных девайсов у будущего внедорожника будет на современном уровне. Автомобиль точно будет оборудоваться системой ЭРА-ГЛОНАСС, ABS и ESP. Без первых двух автомобиль просто не пройдёт сертификацию, а последний позволит водителям лучше контролировать машину в поворотах и избегать сноса задней оси. Кроме этого, впервые LADA 4х4 будет иметь большое количество комплектаций, в числе которых и наличие мультируля для управления круиз-контролем и аудиосистемой. Эту технологию АВТОВАЗ уже отработал на автомобиле LADA Vesta и проблем с её адаптацией в новую модель не должно возникнуть.

Каким точно будет новое поколение LADA 4х4, сейчас не знают даже конструкторы. Работы по его созданию ведут каждый день и для этого автомобиля предлагаются самые лучшие решения. На данный момент известно только одно, что сотрудники занимающиеся созданием новой генерации «Нивы» полностью отдаются этой модели. LADA 4х4 это гордость АВТОВАЗа и выпуск достойного приемника для заводчан — дело чести.

Будет ли новая Нива | Москва

В 2014 году АвтоВАЗ презентовал Chevrolet Niva Concept, концепт внедорожника, которому так и не суждено было стать серийным. Шоукар LADA 4х4 Vision ждала та же участь, ибо спустя пару лет с момента дебюта на ММАС-2018 автопроизводитель так и не решился на кардинальные изменения внедорожника. Вследствие чего, у фанатов отечественного бренда возникает простой вопрос – будет ли новая «Нива»?

Три «Нивы» под окном

И ответ на данный вопрос довольно прост – да! Причем не одна модель, а сразу три. Речь, конечно же, идет о классической LADA 4х4, выпускаемой уже более сорока лет, рестайлинговой вариации Chevrolet Niva и совершенно новом кроссовере, прототипом которого послужит вышеуказанный концепт LADA 4х4 Vision. Что ж, а теперь давайте разберем все по полочкам.

Снимать LADA 4х4 с конвейера в ближайшие годы никто не намерен. Самый доступный внедорожник в начале года прошел легкий рестайлинг и по-прежнему продолжает держаться в двадцатке самых продаваемых автомобилей в России. Секрет популярности довольно прост: проверенная временем платформа, проходимость, которой позавидуют все кроссоверы, и доступная цена.

Ситуация с Chevrolet Niva немного сложнее. Новая «Шнива» не так популярна, как 4х4, но на рынке подержанных внедорожников уверенно занимает лидирующие позиции. В конструктивном плане от классической «Нивы» у нее мало отличий, в связи с чем перетянуть производство на один завод для АвтоВАЗа не составит труда. При этом возвращение под крыло компании прав на название никоим образом не стыкуется с планами о снятии модели с конвейера. Вероятнее всего, Chevrolet Niva ждет рестайлинг с применением X-стиля и переименование в Lada Niva. Ждать конструктивных изменений бессмысленно, так как инженеры не раз заявляли о том факте, что мотор и трансмиссия идеально подогнаны друг к другу. Замена одного из них приведет к изменению всей конструкции автомобиля.

Новой «Ниве» все же быть

О новом поколении внедорожника уже не раз говорили как в самом АвтоВАЗе, так и в ряде профильных СМИ. Предполагается, что кроссовер появится в 2023 году, хотя изначально планировался выход в 2021-м. Но стоит уточнить один факт – это будет совершенно новая модель, отличающаяся даже по концепции. Если «Шнива» и 4х4 представляют собой классический внедорожник с жестким полным приводом, то новая генерация отечественного автомобиля станет кроссовером и потеряет ряд преимуществ.

По замыслу автопроизводителя, новая «Нива» получит платформу от Renault Duster, отключаемую заднюю ось и вариатор в качестве альтернативы механической коробке. Изобретать что-либо свое в АвтоВАЗе не намерены, ибо Global Access (B0) неплохо справляется со своими задачами. Опыт «переработки тележки» у компании уже есть, тот же Largus на B0 продолжает лидировать в сегменте коммерческого автотранспорта.

Вывод полноценного кроссовера на рынок позволит снять с конвейера модель XRAY, на которую в последнее время отсутствует спрос. Тем самым, отечественный автобренд поделит рынок внедорожников на три сегмента, в каждом из которых будет определенная модель. LADA 4х4 представит бюджетно-внедорожный сегмент, LADA Niva займет место Urban-модификации, а новый отечественный кроссовер позволит отвоевать рынок у «Креты».

Случится ли это – покажет время.

Новая «Нива» Lada 4×4 NG (первые фото макета)

Представители АвтоВАЗа неоднократно заявляли о ведущейся разработке совершенно новой генерации своего единственного пока полноценного внедорожника под проектным обозначением Lada 4×4 NG (New Generation), и вот согласно новой продуктовой стратегии предприятия, принятой уже при Николя Море, выйти такой автомобиль должен в 2018 году. Причем, финальная версия новинки якобы уже утверждена и даже выбран подходящий силовой агрегат. Как утверждают некоторые источники, дать приблизительное представление об облике новой модели могут недавно продемонстрированные масштабные макеты автомобилей под проектным обозначением Lada SUV 2030 (на фото).

Как видим, получилось нечто среднее между классической «Нивой» и первым вариантом концепта «Икс-рея» 2012 года. Кстати, по некоторым сведениям Lada 4×4 NG станет самостоятельной моделью, которая будет производиться параллельно с привычным нам внедорожником Lada 4×4 и в отличие от последнего не получит систему постоянного полного привода, а будет базироваться на переднеприводной платформе B0. Таким образом, полный привод у Lada 4×4 NG может быть реализован по тому же принципу, что и у кроссовера Renault Duster, то есть тяга на заднюю ось будет передаваться посредством электромагнитной многодисковой муфты.

Подобную систему подключаемого полного привода еще недавно хотели реализовать в особой версии «Икс-рея» — Lada Xray Cross. Однако, новое руководство Волжского автозавода решило, что применение системы полного привода на новейшем высоком хэтчбеке нецелесообразно, тем не менее, модификация Xray Cross все же будет представлена в рамках Московского автосалона 2016. От обычного «Икс-рея» новый вазовский «Кросс» будет отличаться дополнительным пластиковым обвесом кузова во внедорожном стиле и возможно увеличенным клиренсом.

Что касается еще одной ожидаемой вседорожной новинки от АвтоВАЗа — лифтованного универсала Lada Vesta Cross, то начало производства данной модели согласно последним планам намечено на осень 2017 года. Подробностей о технических характеристиках такого автомобиля пока не приводится.

Автосалон в Москве 2018: Lada 4×4 Vision

Настоящим я выражаю свое согласие ООО «Пауэр Интернэшнл–шины» (ОГРН 1027739435570, ИНН 7703247653) при оформлении Заказа товара/услуги на сайте www.4tochki.ru в целях заключения и исполнения договора купли-продажи обрабатывать — собирать, записывать, систематизировать, накапливать, хранить, уточнять (обновлять, изменять), извлекать, использовать, передавать (в том числе поручать обработку другим лицам), обезличивать, блокировать, удалять, уничтожать — мои персональные данные: фамилию, имя, номера домашнего и мобильного телефонов, адрес электронной почты.

Также я разрешаю ООО «Пауэр Интернэшнл–шины» направлять мне сообщения информационного характера о товарах и услугах ООО «Пауэр Интернэшнл–шины», а также о партнерах.

Согласие может быть отозвано мной в любой момент путем направления ООО «Пауэр Интернэшнл–шины» письменного уведомления по адресу: 129337, г. Москва, ул. Красная Сосна, д.30

Конфиденциальность персональной информации

1. Предоставление информации Клиентом:

1.1. При оформлении Заказ товара/услуги на сайте www.4tochki.ru (далее — «Сайт») Клиент предоставляет следующую информацию:

— Фамилию, Имя, Отчество получателя Заказа товара/услуги;

— адрес электронной почты;

— номер контактного телефона;

— адрес доставки Заказа (по желанию Клиента).

1.2. Предоставляя свои персональные данные, Клиент соглашается на их обработку (вплоть до отзыва Клиентом своего согласия на обработку его персональных данных) компанией ООО «Пауэр Интернэшнл–шины» (далее – «Продавец»), в целях исполнения Продавцом и/или его партнерами своих обязательств перед Клиентом, продажи товаров и предоставления услуг, предоставления справочной информации, а также в целях продвижения товаров, работ и услуг, а также соглашается на получение информационных сообщений. При обработке персональных данных Клиента Продавец руководствуется Федеральным законом «О персональных данных» и локальными нормативными документами.

1.2.1. Если Клиент желает уничтожения его персональных данных в случае, если персональные данные являются неполными, устаревшими, неточными, либо в случае желания Клиента отозвать свое согласие на обработку персональных данных или устранения неправомерных действий ООО «Пауэр Интернэшнл–шины» в отношении его персональных данных, то он должен направить официальный запрос Продавцу по адресу: 129337, г. Москва, ул. Красная Сосна, д.30

1.3. Использование информации предоставленной Клиентом и получаемой Продавцом.

1.3.1 Продавец использует предоставленные Клиентом данные в целях:

· обработки Заказов Клиента и для выполнения своих обязательств перед Клиентом;

• для осуществления деятельности по продвижению товаров и услуг;
• оценки и анализа работы Сайта;
• определения победителя в акциях, проводимых Продавцом;

· анализа покупательских особенностей Клиента и предоставления персональных рекомендаций;

· информирования клиента об акциях, скидках и специальных предложениях посредством электронных и СМС-рассылок.

1.3.2. Продавец вправе направлять Клиенту сообщения информационного характера. Информационными сообщениями являются направляемые на адрес электронной почты, указанный при Заказе на Сайте, а также посредством смс-сообщений и/или push-уведомлений и через Службу по работе с клиентами на номер телефона, указанный при оформлении Заказа, о состоянии Заказа, товарах в корзине Клиента.

2. Предоставление и передача информации, полученной Продавцом:

2.1. Продавец обязуется не передавать полученную от Клиента информацию третьим лицам. Не считается нарушением предоставление Продавцом информации агентам и третьим лицам, действующим на основании договора с Продавцом, для исполнения обязательств перед Клиентом и только в рамках договоров. Не считается нарушением настоящего пункта передача Продавцом третьим лицам данных о Клиенте в обезличенной форме в целях оценки и анализа работы Сайта, анализа покупательских особенностей Клиента и предоставления персональных рекомендаций.

2.2. Не считается нарушением обязательств передача информации в соответствии с обоснованными и применимыми требованиями законодательства Российской Федерации.

2.3. Продавец получает информацию об ip-адресе посетителя Сайта www.4tochki.ru и сведения о том, по ссылке с какого интернет-сайта посетитель пришел. Данная информация не используется для установления личности посетителя.

2.4. Продавец не несет ответственности за сведения, предоставленные Клиентом на Сайте в общедоступной форме.

2.5. Продавец при обработке персональных данных принимает необходимые и достаточные организационные и технические меры для защиты персональных данных от неправомерного доступа к ним, а также от иных неправомерных действий в отношении персональных данных.

Новое поколение сенсоров FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

Abstract

G-белковые рецепторы (GPCR) могут активировать гетеротримерный G-белковый комплекс с субсекундной кинетикой. Генетически закодированные биосенсоры на основе резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) идеально подходят для изучения таких быстрых сигнальных событий в отдельных живых клетках. Здесь мы сообщаем о создании и характеристике трех биосенсоров FRET для измерения активации Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 . Для обеспечения количественной долгосрочной визуализации биосенсоров FRET с высоким динамическим диапазоном требуются флуоресцентные белки с улучшенными фотофизическими свойствами. Поэтому мы используем самый яркий и наиболее фотостабильный вариант CFP, mTurquoise2, в качестве донора, слитого с субъединицей Gα _i , и cp173Venus, слитый с субъединицей Gγ ₂ , в качестве акцептора. Конструкции биосенсоров Gα _i FRET экспрессируются вместе с Gβ ₁ из одной плазмиды, обеспечивая предпочтительные относительные уровни экспрессии с уменьшенными вариациями в клетках млекопитающих.Сенсоры Gα _i FRET показали устойчивый ответ на активацию эндогенных или сверхэкспрессированных альфа-2А-адренорецепторов, которая ингибировалась токсином коклюша. Более того, мы наблюдали активацию сенсора Gα _i FRET в отдельных клетках при стимуляции нескольких GPCR, включая рецептор LPA ₂ , M ₃ и BK ₂ . Кроме того, мы показываем, что датчики хорошо подходят для извлечения кинетических параметров из быстрых измерений в миллисекундном диапазоне времени. Это новое поколение биосенсоров FRET для активации Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 будет полезно для измерений на живых клетках, которые проверяют активацию Gα _i .

Введение

Подкласс Gα _i гетеротримерных G-белков состоит из 3 членов у человека: Gα _i1,2,3 , кодируемый генами GNAI1, GNAI2, GNAI3 [1] и активируемый широким диапазоном рецепторов, связанных с G-белком. G-белки семейства Gα _i участвуют во многих патологиях, от участия в ожирении и диабете [2], функций иммунной системы [3] до их критических ролей на нескольких этапах биологии рака [4–7]. .Активация Gα _i преимущественно связана с ингибированием аденилатциклаз, что приводит к снижению накопления цАМФ в клетках. Однако недавно активация Gα _i была связана с несколькими другими молекулярными эффекторами, включая PI3K / Akt [8,9], ERK [10] и c-Src [5].

Измерение активации Gα _i обычно проводят путем измерения ингибирования индуцированной форсколином продукции цАМФ. Подобно анализам фосфорилирования дальше по течению, такие измерения не имеют пространственного разрешения, имеют ограниченное временное разрешение и могут зависеть от значительных перекрестных помех и усиления или десенсибилизации сигнала [11–13].

Чтобы исследовать активацию G-белка прямым путем с высоким пространственно-временным разрешением, можно использовать генетически закодированные биосенсоры FRET (Förster Resonance Energy Transfer) или BRET (Bioluminescent Resonance Energy Transfer) [14]. Эти методы основаны на измерении безызлучательной передачи энергии от молекулы донора к молекуле акцептора, которая имеет место только тогда, когда донор и акцептор находятся в непосредственной близости друг от друга (<10 нм). Изменения расстояния или ориентации между донорным и акцепторным диполем приводят к изменениям в эффективности RET, которые могут быть определены количественно.

Методы RET позволяют регистрировать кинетику отдельных клеток с миллисекундным разрешением, что может использоваться для определения межклеточной гетерогенности и записи фармакокинетических параметров. Более того, этот подход может регистрировать активацию GPCR в физиологических условиях in vivo [15].

Gα _i был успешно помечен люциферазой в различных внутренних сайтах и ​​использован для измерения BRET между различными субъединицами Gα _i и GPCR [16–19] или Gγ [19].Также были выполнены измерения FRET между флуоресцентно меченными Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 и Gβ [20] или Gγ [21].

Для выполнения измерений FRET необходима спектрально перекрывающаяся пара донора и акцептора [24], и ранее было показано, что использование более ярких флуоресцентных белков может улучшить чувствительность измерений биосенсора FRET [22,23]. Чтобы получить надежные измерения FRET, которые исследуют активацию Gα _i , мы соединили Gα _i1 Gα _i2 и Gα _i3 с самым ярким и наиболее фотостабильным мономерным циановым флуоресцентным белком (CFP), доступным в настоящее время, mTurquoise2. (mTq2) [25]. В качестве акцептора мы использовали кольцевую пермутированную Венеру (cpVenus), слитую с Gγ ₂ , который ранее использовался в качестве акцептора в единственной плазмиде Gα _q FRET сенсора [26]. Мы используем единую плазмидную стратегию для облегчения протоколов трансфекции и обеспечения четко определенного соотношения экспрессии донора и акцептора в клетках [27]. Эта стратегия экспрессии должна значительно облегчить использование и воспроизводимость результатов этих датчиков. Мы представляем стратегию создания, валидацию и описание этого нового поколения датчиков FRET для активации Gα _i1 Gα _i2 и Gα _i3 .Эти биосенсоры очень хорошо подходят для микроскопии живых клеток и могут использоваться для быстрых кинетических измерений в миллисекундном диапазоне, что позволяет характеризовать фармакологические лекарственные средства и определять on- и off-кинетику для агонистов и антагонистов в Gα _и -связанных GPCR.

Результаты

Создание конструкций

Мономерный вариант CFP mTurquoise2, предпочтительный донор в парах CFP-YFP FRET из-за его высокого квантового выхода и фотостабильности [25], был вставлен в Gα _i1 после аланина в позиции 121 в петле αB-αC. Этот сайт встраивания, который, как было ранее показано, сохраняет скорости обмена нуклеотидов и GTPase реакции, сопоставимые с белками дикого типа [20]. Gα _i1 -mTq2 отображает локализацию плазматической мембраны при экспрессии в клетках HeLa (). Были проведены пробные эксперименты, чтобы проверить, подходит ли Gα _i1 -mTq2 для измерения с помощью FRET активации комплекса гетеротримерного G-белка при активации GPCR. С этой целью как Gβ, так и Gγ могут быть помечены акцептором для измерения активации гетеротримерного G-белка с помощью FRET [20,21].Ранее мы показали, что самый высокий контраст FRET для Gα _q достигается с помощью cpVenus-Gγ ₂ [26]. Поскольку Gα _i имеет высокую структурную гомологию с Gα _q и сайт, в который вставлен mTurquoise2, аналогичен, мы решили использовать здесь тот же акцептор FRET. Следовательно, чтобы ввести меченый гетеротримерный G-протеиновый комплекс в клетки, мы совместно экспрессировали Gα _i1 -mTq2 вместе с акцептором FRET cpVenus-Gγ ₂ и немаркированным Gβ ₁ [26]. Стимуляция коэкспрессированного адренергического рецептора α ₂ (α ₂ AR) с UK14,304 показывает быстрое увеличение флуоресценции CFP и сопутствующую потерю сенсибилизированной эмиссии из канала YFP, отражающую потерю FRET. Утрата FRET может быть интерпретирована как диссоциация гетеротримеров или изменение относительной конформации донора и акцептора. Чтобы обеспечить устойчивую коэкспрессию различных компонентов мультимерного сенсора FRET, мы ввели субъединицы в одну и ту же плазмиду, как мы сообщали ранее для сенсора Gα _q () [26].Эта стратегия использует вирусный пептид 2A и последовательность IRES для обеспечения оптимальных относительных уровней донора (Gα _i1 -mTq2) и акцептора (cpVenus-Gγ ₂ ) в отдельных клетках, при минимизации гетерогенности межклеточной экспрессии. в образце. После создания нашего первого варианта мы заметили, что Gα _i1 -mTq2 неправильно локализован в цитоплазме многих клеток (). Субъединица Gα _i1 миристоилирована и требует наличия остатка глицина сразу после ее исходного метионина. Детальный анализ плазмидной последовательности выявил дополнительный стартовый кодон для Gα _i1 -mTq2 перед нативным стартовым кодоном, генерируемый последовательностью IRES (). Мы предположили, что в нашем первом варианте сенсора большая часть продуцируемого белка Gα _i1 -mTq2 транслируется из вышележащего метионина в последовательности IRES, что не приводит к образованию миристоилированного белка. Мы удалили вышестоящий метионин с помощью ПЦР с полным вектором (см. Материалы и методы), в результате чего остался только нативный стартовый кодон Gα _i1 -mTq2, за которым следует глицин, обеспечивающий консенсусную последовательность для миристоилирования.Действительно, после трансфекции клеток новой плазмидой мы наблюдали правильно локализованный Gα _i1 -mTq2 (). Аналогичным образом были сконструированы датчик Gα _i2 и датчик Gα _i3 . Чтобы изучить коэкспрессию трех субъединиц (Gα _i1 -mTq2, Gβ ₁ и cpVenus-Gγ ₂ ) из одной плазмиды по сравнению с тремя отдельными плазмидами, мы количественно оценили флуоресценцию CFP и YFP в этих двух экспериментальных условия (). Флуоресценция CFP и YFP при трансфекции стратегии одиночной плазмиды имела коэффициент детерминации r ² , равный 0.64, тогда как трансфекции тремя отдельными плазмидами показали коэффициент детерминации r ² 0,36 между интенсивностью CFP и интенсивностью YFP. Другими словами, корреляция между экспрессией CFP и YFP лучше в конфигурации с одной плазмидой, что указывает на явное преимущество этой конструкции. Дополнительным преимуществом этой плазмиды является экспрессия белка 3: 1 выше и ниже последовательности IRES, что, как ранее было показано, приводит к предпочтительному соотношению экспрессии донора (CFP) и акцептора (YFP) для аналогичного Gα _q FRET. датчик [27].Наконец, отдельные плазмидные конструкции упростят введение в первичные клетки, создание стабильных клеточных линий или трансгенных организмов с Gα _i -сенсорами.

Разработка и характеристика нового датчика Gα _i1 .

(A) Типичное изображение, показывающее локализацию на плазматической мембране Gα _i1 , слитого с mTurquoise2-Δ9, экспрессированного в клетках HeLa. (B) Схематический обзор плазмиды, содержащей pGβ-2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -CFP, управляемую промотором CMV.На вставке показана последовательность ДНК, кодирующая конец последовательности IRES и начало последовательности Gα _i1 . Предлагаемая трансляция белка показана в строке под последовательностью ДНК (однобуквенные сокращения аминокислот). (C) Конфокальные изображения локализации Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 ( верхний ряд ) и cp173Venus-Gγ ₂ ( нижний ряд ) в клетках HeLa, для варианта 1.0 ( левый столбец ) и вариант 2.0 ( правый столбец ) датчика Gα _i1 .(D) Количественный анализ коэкспрессии каналов CFP и YFP трансфекций cp173Venus-Gγ ₂ и Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 в клетках HeLa. Трансфекция одной плазмиды ( слева, ) по сравнению с трансфекцией отдельных плазмид ( справа, ). Точки отображают интенсивность CFP и YFP, количественно определенную для отдельных отдельных ячеек. R ² — коэффициент детерминации. Ширина отдельных изображений в A и C составляет 143 мкм.

Эффективность в анализах активации GPCR

Для тестирования нового биосенсора Gα _i1 при визуализации живых клеток мы использовали хорошо охарактеризованный GPCR, который, как известно, связывается с Gα _i1 , адренергическим рецептором α ₂ (α ₂ AR).Клетки HeLa, которые, как было показано ранее, эндогенно содержат АР α ₂ [20], были трансфицированы биосенсором Gα _i1 . При добавлении 10 мкМ UK14,304 мы наблюдали устойчивую потерю FRET, измеряя соотношение между флуоресценцией YFP и CFP биосенсора Gα _i1 , которое было возвращено к исходному уровню добавлением 60 мкМ α ₂ AR. антагонист Йохимбин (). Токсин коклюша (PTX), как было показано, инактивирует передачу сигналов Gα _i в клетках посредством АДФ-рибозилирования субъединицы Gα _i [28], что предотвращает его взаимодействие с GPCR.Активация Gα _i1 была полностью отменена инкубацией в течение ночи с PTX, что показывает, что слитый белок Gα _i1 -mTq2 все еще остается чувствительным к PTX (). Чтобы подтвердить, что датчик можно использовать для анализа активации эндогенных рецепторов в первичных клетках Gα _i1 , мы повторили этот эксперимент на HUVEC (эндотелиальных клетках пупочной вены человека). Добавление хорошо известного стимулятора HUVEC, S1P [29], вызывало стойкое снижение отношения FRET для Gα _i1 -сенсора (), ночная обработка PTX полностью устраняла этот ответ.Затем, чтобы исследовать, насколько надежен датчик Gα _i1 на других анализах активации GPCR, мы протестировали множество GPCR, которые, как было показано, связаны с Gα _i . Рецептор брадикинина 2B (BK _2B ) [30], рецептор лизофосфатидной кислоты 2 (LPA ₂ ) [31,32] и рецептор мускаринового ацетилхолина 3 (M ₃ ) [33,34] были совместно трансфицированы с биосенсор Gα _i1 в клетках HeLa. После стимуляции соответствующими агонистами все три рецептора показали устойчивое снижение соотношения FRET биосенсора Gα _i1 ().Рецептор M ₃ также показал полное восстановление соотношения FRET до исходного уровня после добавления антагониста атропина. Рецептор M ₃ в основном известен своей передачей сигналов через Gα _q . Тем не менее, предыдущие исследования показали активацию Gα _i через рецептор M ₃ [19,33–36], что согласуется с нашими наблюдениями.

Производительность сенсоров Gα _i в анализах передачи сигналов GPCR в одиночных клетках.

(A) Эксперименты по визуализации соотношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i1 .Быстрая потеря FRET, наблюдаемая по уменьшению отношения YFP / CFP, после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, специфического агониста α ₂ AR, добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка (100 нг / мл) PTX устраняет ответ на Gα _i1 -сенсоре в клетках, стимулированных UK-14304. (B) Эксперименты по визуализации отношения FRET в Huvecs, трансфицированных датчиком Gα _i1 . Устойчивая потеря FRET наблюдается после стимуляции 500 нМ S1P (сфингозин-1-фосфат).Ночная обработка (100 нг / мл) PTX устраняет ответ на Gα _i1 -сенсоре в S1P-стимулированных клетках. (C) Эксперименты по визуализации отношения FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i1 и BK _2B ( вверху справа ), LPA ₂ ( вверху слева ), M ₃ ( внизу справа ) и β ₂ AR-2A2-m Черри ( внизу слева ) стимулировали 1 мкМ брадикинина (BK _2B ), 1 мкМ лизофосфатидной кислоты (LPA ₂ ), 100 мкМ карбахолина и (M ₃ ) или 10 мкМ изопротеренола и 10 мкМ пропранолола (β ₂ AR).Клетки HeLa, трансфицированные рецепторами BK _2B , LPA ₂ и M ₃ , демонстрируют четкое изменение соотношения YFP / CFP FRET при добавлении их соответствующих агонистов, тогда как стимуляция β ₂ AR не изменяет FRET. передаточное отношение датчика Gα _i1 . В контрольных условиях клетки HeLa, трансфицированные только сенсором Gα _i1 , получали идентичные стимуляции. (D) Эксперименты по визуализации отношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i2 или датчиком Gα _i3 .Быстрая потеря FRET наблюдается после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, последующее добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка (100 нг / мл) коклюшного токсина (PTX) устраняет ответ на биосенсоры Gα _i2 и Gα _i3 в клетках, стимулированных UK-14304. Клетки HeLa стимулировали агонистом при t = 32 секунды, и антагонист добавляли при t = 152 секунды, где указано. Клетки Huvec стимулировали S1P при t = 55 секунд.Временные графики показывают среднее изменение отношения флуоресценции YFP / CFP (± s.e.m). Средние кривые состоят из данных по крайней мере 3 независимых экспериментов, проведенных в разные дни, с указанным количеством клеток ( n ) на условие.

В условиях управления, например В отсутствие сверхэкспрессированного GPCR мы стимулировали клетки HeLa соответствующим агонистом и антагонистом и наблюдали только очень незначительный ответ на датчике Gα _i1 в случае стимуляции LPA. Скорее всего, это связано с активацией эндогенных рецепторов LPA в клетках HeLa [37].Когда мы котрансфицировали адренергический рецептор β ₂ (β ₂ AR), ни одна из клеток не показала активацию Gα _i1 в ответ на лечение агонистами и антагонистами (). Следует отметить, что β ₂ AR является классическим активатором Gα _s , но при определенных условиях сообщалось о переходе на Gα _i [38]. Наши результаты согласуются с единственным известным нам исследованием, в котором используются аналогичные инструменты (сенсоры на основе BRET) и сходные условия (сверхэкспрессия β ₂ AR и гетеротримерные сенсоры G-белка) [19].Также в этом случае не наблюдалась активация Gα _i1 при стимуляции β ₂ AR (и только небольшая активация Gα _i2 и Gα _i3 , которая была> 10 раз ниже, чем активация альфа-2C. адренорецептор, сильный активатор Gα _i ).

Чтобы проверить работоспособность биосенсоров Gα _i2 и Gα _i3 , мы трансфицировали клетки HeLa их соответствующими плазмидами. Подобно эксперименту с биосенсором Gα _i1 , мы наблюдали устойчивую потерю FRET после добавления 10 мкМ UK14,304, и сигнал вернулся к исходному уровню при добавлении 60 мкМ йохимбина ().В этих экспериментальных условиях мы не наблюдали существенных различий в кинетике активации или амплитуде ответов между тремя различными субъединицами Gα _и . И Gα _i2 -mTq2, и Gα _i3 -mTq2 все еще чувствительны к лечению PTX, о чем свидетельствует исчезновение ответа FRET после инкубации с PTX в течение ночи ().

Быстрые кинетические измерения

Чтобы более подробно изучить субсекундную кинетику активации Gα _i1 в живых клетках, клетки HEK293 были котрансфицированы с датчиком Gα _i1 и α ₂ . AR или аденозиновый рецептор A1 соответственно.Используя систему быстрой перфузии для нанесения лиганда, измерения FRET одной клетки показывают быструю потерю отношения FRET более чем на 15% после кратковременного применения 20 мкМ норэпинефрина. После отмывания лиганда сигнал FRET возвращается к исходным уровням. Это можно было воспроизвести несколько раз без видимой потери амплитуды сигнала (). Аналогичный ответ наблюдался для аденозинового рецептора A1 после непродолжительного применения эндогенного лиганда аденозина (30 мкМ) ().

Характеристики датчика Gα _i1 при кинетических измерениях.

(A) Клетки HEK293, трансфицированные Gα _i1 -сенсором и α ₂ AR, многократно стимулировались 20 мкМ норэпинефрина в течение интервалов, обозначенных короткими горизонтальными линиями. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированный и нормализованный коэффициент FRET. (B) Клетки HEK293, трансфицированные Gα _i1 -сенсором и аденозиновым A1-рецептором, стимулировали 30 мкМ аденозина, что показано короткой горизонтальной линией.Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированный и нормализованный коэффициент FRET. (C) Увеличенное изображение он-кинетики активации Gα _i1 , показывающее нормализованное соотношение FRET во время первой стимуляции эксперимента в (A), приспособленное к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания с tau = 1160 мс и амплитудой = 0,18 (R = 0,99). (D) График разброса, показывающий средние экспоненциальные константы времени (тау) объединенных данных из (n = 10) индивидуальных подборов клеток HEK293, трансфицированных Gα _i1 -сенсором, и α ₂ AR, стимулированных 100 мкМ норэпинефрина или объединенных данные (n = 14) по индивидуальным подборам Gα _i1 -сенсора и аденозинового A1-рецептора, стимулированного 30 мкМ аденозина, соответственно.Планки погрешностей указывают 95% доверительный интервал.

Эти быстрые измерения FRET можно использовать для оценки кинетики активации Gα _i1 с субсекундным разрешением (), как показано крупным планом первой стимуляции в эксперименте, показанном на рис. Кривая была подогнана к однокомпонентной функции экспоненциального затухания, как описано ранее [39], в результате чего экспоненциальная постоянная времени (τ) составила 1160 мс.

Чтобы оценить точную динамическую кинетику Gα _i1 -сенсора, клетки стимулировали насыщающими концентрациями лиганда (100 мкМ норадреналина или 30 мкМ аденозина).Каждый индивидуальный ответ был подогнан к однокомпонентной экспоненте, что привело к средним значениям τ для α ₂ AR, равным 887 мс, и для аденозина A1, равным 963 мс (), что соответствует периодам полувыведения 614 мс и 668 мс соответственно. Эти значения хорошо согласуются с более ранними наблюдениями активации G-белка с помощью FRET [21,40,41].

Заключительные замечания

В этой рукописи мы описываем дизайн, конструкцию и характеристики трех новых биосенсоров FRET для измерения активации Gα _i1 , Gα _i2 , Gα _i3 .Новые сенсоры содержат субъединицу Gα, слитую с донорским флуорофором, mTurquoise2, и субъединицу Gγ, слитую с cp173Venus, поскольку ранее было показано, что эта комбинация для сенсора FRET Gα _q обеспечивает наибольший динамический диапазон [26]. Три субъединицы гетеротримеров (Gα _i -mTq2, Gβ ₁ и cpVenus-Gγ ₂ ) были сконфигурированы на одной плазмиде, обеспечивая надежную коэкспрессию с предпочтительной стехиометрией. Мы показываем, что эти датчики хорошо подходят для микроскопии живых клеток и извлечения кинетических параметров с помощью ратиометрической визуализации FRET одной клетки.Стандартизованная компоновка этих биосенсоров FRET для активации G-белка повысит надежность и воспроизводимость экспериментов внутри и между лабораториями. Примером в данной статье является надежная работа датчика Gα _i1 в трех разных лабораториях без оптимизации экспериментальных условий.

Одним из ограничений биосенсоров на основе переноса энергии для гетеротримерных G-белков является то, что они зависят от сверхэкспрессии гетеротримеров, что может влиять на естественное предпочтение GPCR для определенного класса гетеротримерных G-белков.Мечение эндогенных субъединиц флуоресцентными белками потенциально может облегчить это.

Исключительная чувствительность этих датчиков позволяет надежно обнаруживать активацию Gα _i в первичных клетках через эндогенные GPCR. Кроме того, эти биосенсоры можно использовать для прямого сравнения предпочтительных паттернов активации Gα _i1 Gα _i2 и Gα _i3 между различными GPCR, связанными с Gα _и , что может помочь в разработке терапевтических стратегий, нацеленных на Gα _i . сигнальные пути [42].

Методы

Конструирование флуоресцентных слияний белков

Для вставки mTurquoise2-Δ9 (здесь сокращенно mTq2) [25] в Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 белков, версия mTq2 сайты рестрикции на его N-конце и C-конце были сконструированы путем амплификации mTurquoise2 с прямым праймером 5'-ATaccggttctATGGTGAGCAAGGGCG-3 ' и обратным праймером 5'-TAaccggtGATCCCGGCGGC-3' . Чтобы ввести Age1-сайт в Gα _i1 -цитрин, мы выполнили полновекторную ПЦР на матрице RnGalpha _i1 -Citrine [20] с прямым праймером 5'-ATaccggtGAACTCGCCGGCGTCATA-3 ' и обратным праймером 5 '-ATaccggtCGCGGTCATAAAGCCTTC-3' .Чтобы ввести Age1-сайт в Gα _i2 -цитрин, мы выполнили полновекторную ПЦР на матрице HsGalpha _i2 -Citrine [20] с прямым праймером 5'-ATaccggtGAGGAGCAAGGCGTGCT-3 ' и обратным праймером 5 '- TAaccggtGGCGGTGCAGGACAGT-3' . КДНК, содержащая кодирующую последовательность для HsGalpha _i3 с сайтом Age1, была синтезирована Eurofins (www.eurofins.nl). Разрезание продукта ПЦР mTq2 и новых векторов Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 с помощью Age1 и последующее лигирование привело к RnGalpha _i1 , помеченному mTq2 после позиции 121, и HsGalpha _i2,3 , помеченному mTq2 после положения 114, аналогично ранее описанному функционально меченному Gα _i1,2,3 [20].

Для конструирования варианта 1.0 сенсора Gα _i1 была проведена ПЦР на плазмиде mTq2-Gα _i1 с прямым праймером 5'-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3 ' и обратным праймером 5'-TATggatAGccAGCTAGCTAG ', чтобы ввести сайт BamHI на С-конце и сайт NcoI на N-конце. Затем было выполнено тройное лигирование с продуктом ПЦР (разрезанным с помощью BamHI и NcoI), вектором, содержащим pGβ ₁ -T2A-cp173Venus-Gγ ₂ [43] (разрезанный с помощью BamHI и SacII), и вектором, содержащим pPRIG -IRES [44] (вырезано с помощью NcoI и SacII).Полученная плазмида, pGβ ₁ -2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-MATT-Gα _i1 -CFP, коэкспрессирует MATT-Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 (нарушение локализации плазматической мембраны), pGβ ₁ и cp173Venus-Gγ ₂ ().

Чтобы сконструировать вариант 2.0 сенсора Gα _i1 , мы выполнили ПЦР с мутагенезом с вариантом 1.0 в качестве матрицы путем амплификации с прямым 5'-GAAAAACACGATGATAATATGGGCTGCACACTGAGC-'3 и 90TCTCT-3 ‘-GTCAGTGATCCT-3 5'-GCTCAGTGATGATGC.Полученная плазмида, pGβ ₁ -2A-cp173Venus-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9, коэкспрессирует Gα _i1 -mTq2 (правильно расположен на плазматической мембране), pGβ и cpVenus-Gγ ₂ ().

Чтобы создать единственный плазмидный сенсор для Gα _i2 и Gα _i3 , мы выполнили ПЦР с расширением перекрывания [45]. Gα _i2 -mTq2 был амплифицирован с прямым праймером '5-acgatgataatATGGGCTGCACCGTGA-3' и обратным праймером '5 -TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3'-, а прямой праймер Gα 9000 -Gmat 9000 -GGCAGT-3' был амплифицирован с Gα 9000-gTgat 9000-gTq5 i3q -3 ‘ и обратный праймер ' 5 -TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3 '.Другой ПЦР был проведен на ранее описанном [26] одиночном плазмиде Gα _q -сенсора с прямым праймером ‘5-GAAGTTTTCTGTGCCATCC -3’ и обратным праймером ’5-GCAGCCCATattatcatcgtgtttttcaaag -3’ . Впоследствии описанный выше продукт ПЦР Gα _i2 -mTq2 или Gα _i3 -mTq2 смешивали с продуктом ПЦР датчика Gα _q и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с прямым праймером '5- GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3 ' и обратный праймер ' 5-TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3 ' и прямой праймер ' 5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3 '90TAATTATA45 и обратный праймер tAGCC-3' tAGCCC, соответственно.Затем полученные продукты ПЦР лигировали в основную цепь сенсора Gα _q с помощью SacII и XbaI, в результате чего получали pGβ-2A-cp173Venus -Gγ ₂ -IRES-Gα _i2 -mTurquoise2-Δ9 и - _{1 2A-cp173Venus-Gγ2-IRES-Gα i3 -mTurquoise2-Δ9 соответственно. Последовательности плазмид доступны по запросу. Плазмиды будут распространяться через Addgene: http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/. RnGα i1 -mCitrine и HsGα i2 -mCitrine были любезным подарком Скотта Гибсона [20].Обратите внимание, что кодирующая последовательность RnGα i1 отличается только одной аминокислотой от Gα i1 человека (S98A). Рецептор LPA 2 был получен с cDNA.org. BK 2 R [46], α 2 AR [21], M 3 R [47] и рецептор A1 [48] были описаны ранее. β 2 AR-P2A-mCherry - подарок от Анны Пьетрашевской (Амстердамский университет).}

Культура клеток и подготовка образцов

Клетки HeLa (Американская коллекция культур тканей: Манассас, Вирджиния, США) культивировали в Амстердамском университете (Амстердам, Нидерланды) с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), снабженной глутамаксом, 10% FBS, пенициллин (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл).Все среды для культивирования клеток были получены от Invitrogen (Bleiswijk, NL).

Клетки трансфицировали в 35-миллиметровой чашке со стеклянным покровным стеклом диаметром 24 мм № 1 (Menzel-Gläser, Брауншвейг, Германия), используя 1-2 мкл липофектамина 2000 в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen), 0,5-1 мкг плазмидной кДНК и 50 мкл OptiMeM (Life Technologies, Блейсвейк, Нидерланды). После инкубации в течение ночи при 37 ° C и 5% CO ₂ покровные стекла помещали в камеру для клеток Attofluor (Invitrogen, Breda, NL) и погружали в среду для микроскопии (20 мМ HEPES (PH = 7.4), 137 мМ NaCL, 5,4 мМ KCL, 1,8 мМ CaCL ₂ , 0,8 мМ MgCl ₂ и 20 мМ глюкозы). Вся микроскопия живых клеток проводилась при 37 ° C.

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были приобретены у Lonza и культивированы в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) на чашках, покрытых FN, в среде EGM-2 с добавлением одиночных клеток (Lonza, Verviers, Бельгия). HUVEC использовали в пассаже номер 4 или 5. В качестве метода трансфекции использовали систему трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и соответствующий набор для трансфекции Neon (Invitrogen).Один импульс генерировали при 1300 В в течение 30 мс для микропорации HUVEC с 2 мкг кДНК, затем клетки высевали на покровные стекла, покрытые FN.

Для быстрых кинетических измерений активации Gα _i1 клетки HEK293 культивировали в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия) в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глутамина (2 мМ). ) (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия), пенициллин (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл) и хранили при 37 ° C в атмосфере 7% CO2.Клетки собирали и высевали на 24-миллиметровые покровные стекла, покрытые D-полилизином, при ~ 40% конфлюентности. Через три часа клетки временно трансфицировали 1,0 мкг рецептора (α ₂ AR или аденозин A1) и 3,0 мкг pGβ ₁ -2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -mTq2 кДНК на 6 -луночный планшет с использованием реагента для трансфекции Effectene ^® (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Среду для выращивания обновляли через 24 часа, и измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов.Клетки содержали в среде для микроскопии (140 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, pH 7,3) и постоянно суперслили с этим буфером или буфером, дополненным соответствующим лигандом, с использованием компьютерной системы. Устройство быстрой суперфузии с электромагнитным клапаном (ValveLink 8.2, Automate Scientific).

Широкопольная микроскопия

Ратиометрические измерения FRET в клетках HeLa (результаты представлены в) были выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH, Германия) в Амстердамском университете (Амстердам, Нидерланды), сохранены при 37 ° C, с масляным иммерсионным объективом (Plan-Neoflor 40 × / 1.30; Carl Zeiss GmbH) и ксеноновую дуговую лампу с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK). Изображения были записаны с помощью охлаждаемой камеры устройства с заряженной связью (Coolsnap HQ, Roper Scientific, Tucson, AZ, США). Типичное время экспозиции составляло от 75 мс до 150 мс, а интервал камеры был установлен на 4x4. Флуорофоры возбуждались светом 420 нм (ширина щели 30 нм) и отражались на образец дихроичным зеркалом 455DCLP, эмиссия CFP регистрировалась фильтром BP470 / 30, а эмиссия YFP регистрировалась фильтром BP535 / 30 путем вращения колеса фильтров. .В экспериментах по совместной экспрессии YFP возбуждали светом 500 нм (ширина щели 30 нм) и отражали на образец дихроичным 515DCXR, а излучение регистрировали с помощью фильтра BP535 / 30. Регистрация была скорректирована на фоновый сигнал и, для изображения отношения FRET, просачивание эмиссии CFP в канал YFP (55% интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для экспериментов FRET в HUVEC (результаты представлены в), микроскоп Zeiss Observer Z1 использовался в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) с 40x NA 1.3 масляный иммерсионный объектив и возбуждающий источник света HXP 120 В. CFP возбуждали через куб фильтра FRET (Exciter ET 436 / 20x и дихроичное зеркало 455 DCLP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США)). Излучение направлялось на прикрепленный адаптер двойной камеры (Carl Zeiss GmbH, Германия), управляющий дихроичным зеркалом 510 DCSP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США). Эмиссионные волны с длинами волн 455–510 нм направляются на эмиссионный фильтр ET 480/40 (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США), а затем фиксируются камерой Hamamatsu ORCA-R2.Длина волны излучения 510 нм и выше направляется на эмиссионный фильтр ET 540/40 м (Ludl Electronic Products, Нью-Йорк, США), а затем фиксируется второй камерой Hamamatsu ORCA-R2. Получение изображений производилось с использованием программного обеспечения микроскопа Zeiss-Zen 2011. Все измерения были скорректированы на фоновый сигнал. Регистрация была скорректирована на фоновый сигнал и утечку эмиссии CFP в канале YFP ​​(62% от интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для быстрых кинетических измерений активации Gα _i1 (результаты представлены в), визуализация была выполнена на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200 в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия), оборудованном масляным иммерсионным объективом 63x и объективом фотометрическая система с двойным излучением (Till Photonics), как описано ранее [21].Трансфицированные клетки возбуждали светом от полихрома IV (Till Photonics). Освещение было установлено на 40 мс из общего времени интеграции 100 мс. Сигналы CFP (480 ± 20 нм), YFP (535 ± 15 нм) и отношения FRET (YFP / CFP) регистрировались одновременно (светоделитель DCLP 505 нм) при возбуждении на длине волны 436 ± 10 нм (светоделитель DCLP 460 нм). Сигналы флуоресценции регистрировались фотодиодами и оцифровывались с помощью аналого-цифрового преобразователя (Digidata 1440A, Axon Instruments). Все данные были записаны на ПК под управлением Clampex 10.3 (Axon Instruments). Полученные отдельные трассы были подогнаны к однокомпонентной функции экспоненциального затухания для извлечения экспоненциальной постоянной времени tau [39]. Полупериод активации (t _1/2 ) определяется как τ * ln2. В динамических экспериментах клетки стимулировали UK14,304 (10 мкм), йохимбином (60 мкм), брадикинином (1 мкм), LPA (1 мкм), карбахолом (100 мкм), атропином (10 мкм), изопротеренолом (10 мкм), пропранололом (10 мкм), S1P (500 нМ), 20 мкМ или 100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина в указанные моменты времени.ImageJ (Национальный институт здоровья) использовался для анализа необработанных изображений микроскопии. Дальнейшая обработка данных была проведена в Excel (Microsoft Office), а графики и статистика были выполнены с использованием Graphpad версии 6.0 для Mac, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com.

Конфокальная микроскопия

Клетки HeLa, трансфицированные указанными конструкциями, были визуализированы с использованием конфокального микроскопа Nikon A1, оборудованного иммерсионным объективом 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер точечного отверстия был установлен на 1 единицу Эйри (<0,8 мкм).

Образцы последовательно возбуждали лазерной линией 457 нм и 514 нм и отражались на образец дихроичным зеркалом 457/514. Эмиссия CFP фильтровалась через эмиссионный фильтр BP482 / 35; Эмиссию YFP фильтровали через эмиссионный фильтр BP540 / 30. Чтобы избежать проступания, изображения были получены в режиме последовательной строчной развертки. Все измерения были скорректированы на фоновый сигнал.

(PDF) Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

18.Ayoub MA, Maurel D, Binet V, Fink M, Prezeau L, Ansanay H, et al. Анализ в реальном времени индуцированной агонистом-

активации протеазно-активированного рецепторного 1 / белкового комплекса Galphai1, измеренный с помощью биолюминесцентного резонансного переноса энергии в живых клетках. Mol Pharmacol. 2007; 71: 1329–1340. DOI: 10.1124 /

mol.106.030304 PMID: 17267663

19. Saulière A, Bellot M, Paris H, Denis C, Finana F, Hansen JT, et al. Расшифровка сплетения комплекса предвзятого агонизма

выявляет новый активный объект рецептора AT1.Nat Chem Biol. Издательская группа «Природа»; 2012; 8:

623–631. DOI: 10,1038 / nchembio.961

20. Гибсон С.К., Гилман АГ. Обе субъединицы Giα и Gβ определяют селективность активации G-белка с помощью α2-адрен-

ергических рецепторов. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2006; 103: 212. DOI: 10.1073 /

pnas.0509763102

21. Бюнеманн М., Франк М., Лозе М.Дж. С обложки: Активация белка Gi в интактных клетках связана с перестройкой субъединицы

, а не с диссоциацией.Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2003;

100: 16077. doi: 10.1073 / pnas.2536719100

22. Klarenbeek JB, Goedhart J, Hink MA, Gadella TWJ, Jalink K. Улучшен датчик цАМФ на основе mTurquoise для

как FLIM, так и ратиометрическое считывание динамический диапазон. PLoS ONE. 2011; 6: e19170. DOI: 10.

1371 / journal.pone.0019170 PMID: 21559477

23. Спарта Б., Паргетт М., Минге М., Дистор К., Белл Г., Олбек Дж. Необходимы механизмы рецепторного уровня

для активности киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), стимулированной эпидермальным фактором роста (EGF)

импульсов.J Biol Chem. 2015; 290: 24784–24792. doi: 10.1074 / jbc.M115.662247 PMID: 26304118

24. Хамерс Д., ван Ворст Вейдер Л., Борст Дж. В., Годхарт Дж. Разработка биосенсоров FRET для систем млекопитающих и растений. Протоплазма. 2014; 251: 333–347. doi: 10.1007 / s00709-013-0590-z PMID:

24337770

25. Годхарт Дж., Стеттен фон Д., Нуарклерк-Савойе М., Лелимусен М., Джузен Л., Хинк М.А. и др. Структура

управляла эволюцией голубых флуоресцентных белков до квантового выхода 93%.Nature Communica-

сообщений. 2012; 3: 751. doi: 10.1038 / ncomms1738 PMID: 22434194

26. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EMM, Offermanns S, et al.

Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках. BMC Biol. 2011; 9: 32.

doi: 10.1186 / 1741-7007-9-32 PMID: 21619590

27. Goedhart J, van Weeren L., Adjobo-Hermans MJW, Elzenaar I, Hink MA, Gadella TWJ. Количественный анализ

Коэкспрессия белков на уровне отдельной клетки - приложение к мультимерному датчику FRET.Delprato

AM, редактор. PLoS ONE. 2011; 6: e27321. PMID: 22114669

28. Burns DL. Субъединичная структура и ферментативная активность токсина коклюша. Microbiol Sci. 1988; 5: 285–287.

PMID: 28

29. Ван Ф., Ван Броклин Дж. Р., Хобсон Дж. П., Мовафаг С., Жуковска-Гройец З., Милстен С. и др. Сфингозин

1-фосфат стимулирует миграцию клеток через рецептор на поверхности клетки, связанный с G (i). Возможное участие в ангиогенезе. J Biol Chem.1999; 274: 35343–35350. PMID: 10585401

30. Ляо JK, Homcy CJ. Белки G семейства G alpha i и G alpha q связывают рецептор брадикинина

с высвобождением релаксирующего фактора эндотелия. J Clin Invest. 1993; 92: 2168–2172. DOI: 10.1172 /

JCI116818 PMID: 8227332

31. ван Корвен EJ, Groenink A, Jalink K, Eichholtz T., Moolenaar WH. Индуцированная лизофосфатидатом клеточная пролиферация pro-

: идентификация и анализ сигнальных путей, опосредованных G-белками.Клетка. 1989; 59:

45–54. PMID: 2551506

32. An S, Bleu T, Hallmark OG, Goetzl EJ. Характеристика нового подтипа человеческого рецептора

, связанного с G-белком, для лизофосфатидной кислоты. J Biol Chem. 1998; 273: 7906–7910. PMID: 9525886

33. Offermanns S, Wieland T, Homann D, Sandmann J, Bombien E, Spicher K, et al. Трансфицированные мускатные рецепторы

-ринового ацетилхолина селективно связываются с белками G Gi-типа и Gq / 11. Mol Pharmacol. 1994;

45: 890–898.PMID: 81

34. Akam EC, Challiss RA, Nahorski SR. Профили активации G (q / 11) и G (i / o) в клетках СНО, экспрессирующих

человеческих мускариновых ацетилхолиновых рецепторов: зависимость от агониста, а также от подтипа рецептора. Br J

Pharmacol. 2001; 132: 950–958. DOI: 10.1038 / sj.bjp.0703892 PMID: 11181437

35. Хорниголд, округ Колумбия, Мистри Р., Раймонд П.Д., Бланк Д.Л., Челлисс РАДж. Доказательства перекрестного взаимодействия между M2 и

мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами M3 в регуляции вторичного мессенджера и внеклеточного сигнала -

регулируемые пути передачи сигналов киназ в клетках яичников китайского хомячка.Br J Pharmacol. 2003; 138:

1340–1350. doi: 10.1038 / sj.bjp.0705178 PMID: 12711635

36. Blaukat A, Barac A, Cross MJ, Offermanns S, Dikic I. G белково-связанный рецептор-опосредованный митоген-

активация протеинкиназы через сотрудничество Galpha (q) и Galpha (i) сигналы. Молекулярный

и клеточная биология. 2000; 20: 6837–6848. PMID: 10958680

Новое поколение датчиков FRET для Gα

i

Активация

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0146789 22 января 2016 г. 13/14

2022 Nissan Pathfinder Review

Nissan Pathfinder был неизменным фаворитом покупателей среднеразмерных внедорожников, но в последние несколько лет его немного затмили новые участники этого сегмента. Kia Telluride и Hyundai Palisade - одни из самых новых кроссоверов, похитивших у Pathfinder громкость. Перед лицом этого Nissan создал совершенно новый Nissan Pathfinder 2022 года, призванный вернуть часть старого волшебства модели и предоставить новые функции, которые ценят сегодняшние покупатели внедорожников среднего размера.

Следуя последней стратегии Nissan, Nissan Pathfinder 2022 года предлагается в относительно небольшом количестве комплектаций по сравнению с некоторыми конкурентами. Это планки S, SV, SL и Platinum. Все комплектации предлагаются как в переднеприводной, так и в полноприводной конфигурации. В дополнение к комплектации Nissan предлагает два пакета оборудования и 35 аксессуаров для обеспечения безопасности, надежности и удобства. Хотя новейший Pathfinder не имеет специальной отделки для бездорожья, его дизайн и оборудование предполагают новую приверженность бездорожью.

Pathfinder совершенно новый для модели 2022 года. Изменился внешний вид, полностью обновлен интерьер. Одним из фундаментальных изменений является то, что у автомобиля значительно больше места, чем у его предшественника - колоссальные 164,6 кубических фута общего внутреннего объема по сравнению с 154 кубическими футами у предыдущей модели. Для сравнения: Ford Explorer 2021 года имеет внутреннее пространство 152,7 кубических футов, а Toyota Highlander 2021 года - 141,3 кубических футов.

Фото: Джек Нерад

Согласно данным, полученным от проверенных владельцев для J.D Power 2020 Automotive Performance, Execution and Layout Study , 56% владельцев Nissan Pathfinder предыдущего поколения - мужчины (что соответствует верхнему сегменту внедорожников среднего размера), а средний возраст владельцев Pathfinder составляет 54 года (по сравнению с 55 годами). ).

Владельцы говорят, что им больше всего нравится Pathfinder предыдущего поколения (в порядке убывания):

• Внешний вид
• Ощущение от вождения
• Ощущение безопасности
• Дизайн интерьера (в сочетании с трансмиссией)

Владельцы указывают наименее любимые черты Pathfinder предыдущего поколения (в порядке убывания):

• Комфортное вождение
• Настройка и запуск
• Вход и выход
• Информационно-развлекательная система
• Экономия топлива

В Дж.D. Power 2020 APEAL Study , Pathfinder предыдущего поколения занял 12-е место из 13-ти среднеразмерных внедорожников.

Что наш независимый эксперт говорит о Nissan Pathfinder 2022 года - Найдите лучшие предложения Nissan!

В следующих разделах наш независимый эксперт проводит анализ Pathfinder Platinum с 4WD. Цены на автомобиль, оцениваемый для этого обзора, недоступны, но Nissan объявил, что рекомендованная производителем розничная цена для Pathfinder Platinum 4WD 2022 года составит 48 090 долларов.Цена не включает сбор за место назначения в размере 1150 долларов США.

Как удобно устроиться

Что сразу же впечатляет, когда вы садитесь в первоклассный Nissan Pathfinder 2022 года, так это то, насколько привлекательным и роскошным является его интерьер. Его кабина может хорошо сочетаться с кабиной многих роскошных марок.

В наши дни модное слово о материалах интерьера - «софт-тач». Вокруг него много шума, потому что покупатели автомобилей любят мягкие, обитые поверхности, а не твердый пластик.И 2022 Pathfinder Platinum отвечает этим требованиям, плюс он предлагает кожаные сиденья, отделку из синтетической кожи и соответствующий металлический декор.

Еще одна популярная в настоящее время функция - панорамный люк на крыше. Это часть пакета, доступного для комплектации SV и SL, и мы ценим естественный свет, который он пропускает в салон с отделкой Platinum высшего уровня.

В совершенно новой модели 2022 года, впервые в своей истории, Pathfinder оснащен стандартными сиденьями на 8 пассажиров - ковшеобразными сиденьями спереди и двумя рядами скамеек для трех пассажиров каждый.Сиденье водителя в Pathfinder Platinum регулируется в 10 направлениях с усиленной поясничной опорой в двух направлениях. Сиденье переднего пассажира регулируется в четырех направлениях. Сиденья в тестируемой версии Platinum были отделаны мягкой и привлекательной кожей премиум-класса с роскошной прострочкой. Они и отапливаются, и вентилируются.

Сиденья второго ряда примечательны по другой причине: удобством. Будь то капитанские кресла или скамейка, расположение сидений «в одно касание» позволяет сиденьям второго ряда сдвигаться вперед или одновременно сдвигаться и наклоняться вперед, чтобы облегчить доступ к зоне отдыха в третьем ряду.Примечательно, что функция скольжения и наклона работает даже тогда, когда детское автокресло закреплено в перемещаемом положении для сидения. Этому процессу способствуют задние двери, которые имеют большой проем и откидываются на 90 градусов.

Третий ряд может вместить трех пассажиров, и наши исследования показывают, что трое детей или двое взрослых могут быть в них достаточно комфортно, в основном, если пассажиры второго ряда будут сотрудничать.

Даже с семьей на борту в 2022 Pathfinder достаточно места для багажа.Со всеми тремя рядами сидений у него есть грузовое пространство 16,6 кубических футов, чего достаточно для шести чемоданов ручной клади размера TSA. При сложенном сиденье третьего ряда грузовое пространство увеличивается до 45 кубических футов.

2022 Nissan Pathfinder Обзор информационно-развлекательной системы NissanConnect

Информационно-развлекательные системы NissanConnect в различных Pathfinder 2022 года предлагают подходящие размеры экрана - 8 или 9 дюймов - и простоту управления. Они не особенно ярки или бросаются в глаза, но лучшая новость заключается в том, что они сразу интуитивно понятны.Садитесь, и вы знаете, как ими пользоваться. Без вопросов.

В топовой модели 2022 Pathfinder Platinum информационно-развлекательная система включает:

• 9-дюймовый сенсорный экран
• Apple CarPlay (беспроводной и проводной)
• Android Auto (проводной)
• Спутниковое радио
• NissanConnect Сервисы с уведомлением о столкновении и другие подключенные сервисы
• Подключенная навигация от двери до двери (продолжает указывать направление через приложение для смартфона после парковки на некотором расстоянии от конечного пункта назначения)
• Камера кругового обзора

Удобно расположена беспроводная зарядная панель для смартфона в передней части центральной консоли.Он входит в стандартную комплектацию Platinum и опционально для SL. Аудиосистема верхнего уровня от Bose предлагает 13 динамиков, включая сабвуферы. Качество звука отличное, система входит в стандартную комплектацию Platinum и является опцией для покупателей SL. Точка доступа Wi-Fi с технологией NissanConnect - еще один плюс.

Расположение экрана информационно-развлекательной системы невозможно определить. Он расположен высоко в центре приборной панели, поэтому его легко увидеть с первого взгляда. В сочетании с разборчивым цветным проекционным дисплеем обеспечивается отличная читаемость во время вождения.

В то время как некоторым нужны инновационные функции и глубокие меню в информационно-развлекательной системе, большинству из нас нужна простая в использовании система NissanConnect от Pathfinder. Я использовал систему для нескольких задач - музыка, новости, навигация, телефонные звонки - и она реагировала без сбоев и не вызывала недовольства водителя. Этому способствуют знакомые регуляторы громкости и настройки стерео. Я бы назвал это победой.

Каково водить Nissan Pathfinder 2022 года

Фото: Джек Нерад

Теперь вы можете добавить еще одно имя в мир, наполненный компетентными трехрядными внедорожниками: Nissan Pathfinder 2022 года .Он предлагает комфортную, тихую езду с небольшим наклоном тела в умеренных поворотах. Рулевое управление достаточно отзывчивое, без суетливости и рывков. И тормоза останавливают Pathfinder с обнадеживающей регулярностью. Возможно, вам не понравится манера вождения Pathfinder, но вы определенно не возненавидите его.

Под капотом кроссовера находится мощный 3,5-литровый атмосферный двигатель V6 от Nissan. В этом воплощении двигатель выдает 284 лошадиных силы и 259 фунт-фут крутящего момента. Езда на заполненных жидкостью опорах двигателя, V6 такой же плавный, как лысая голова ребенка.

Приводит в движение либо передние колеса, либо все четыре колеса; Nissan называет последний «интеллектуальным полным приводом», хотя у него нет раздаточной коробки или других атрибутов классической системы полного привода с частичной занятостью. Он смещен на передний привод и передает крутящий момент назад, когда его электроника ожидает, что это может быть выгодно, не дожидаясь пробуксовки колеса.

Самая замечательная особенность системы 4WD - это прямое соединение, которое позволяет передавать крутящий момент непосредственно на муфту с помощью давления масла.Это помогает при трогании с места в условиях низкой тяги.

У нас была возможность проверить характеристики системы 4WD в некоторых умеренно сложных ситуациях на бездорожье и спусках, и Pathfinder хорошо себя зарекомендовал. Jeep не нужно беспокоиться, но эта версия Pathfinder определенно имеет более серьезные недостатки для бездорожья, чем его последний предшественник.

Каждые 2022 год Pathfinder использует новую 9-ступенчатую автоматическую коробку передач с переключением передач по проводам.Подрулевые переключатели позволяют вам выбирать передачи вручную, если это необходимо, но мы обнаружили, что трансмиссия была в значительной степени правильной в своем выборе. Следопыты с системой Intelligent 4WD также имеют возможность выбора режима. Стандартный, Спорт, Эко, Снег, Песок, Грязь / Колея и Буксировка - это ваш выбор; все отображается в виде всплывающего уведомления на комбинации приборов.

Новое рулевое управление с двойным электрическим усилителем обеспечивает хороший контроль без неопределенности, от которой могут пострадать некоторые устройства рулевого управления с электроусилителем.И передняя, ​​и задняя подвески настроены на повышенную жесткость крена, и результаты ощутимы.

В целом, Nissan Pathfinder 2022 года имеет все признаки застегнутого транспортного средства, которое нацелено на его аудиторию, хотя энтузиасты вождения могут не слишком волноваться. Тем не менее, инженеры Nissan улучшили управляемость Pathfinder без ущерба для качества езды, и это должно сделать почти всех счастливыми.

Обзор Nissan Safety Shield 360

Nissan был одним из первых автопроизводителей, который упаковал и продвигал свои передовые системы помощи при вождении (ADAS), и он назвал свою систему Nissan Safety Shield 360.Все Nissan Pathfinder 2022 года имеют следующие функции в рамках Nissan Safety Shield 360 ADAS:

• Автоматическое экстренное торможение с обнаружением пешеходов
• Предупреждение о выезде с полосы движения
• Предупреждение о слепых зонах
• Предупреждение о перекрестном движении сзади
• Автоматическое экстренное торможение сзади
• Автоматические фары дальнего света

Дополнительные стандартные функции безопасности на новом Pathfinder включают:

• Интеллектуальное предупреждение о лобовом столкновении
• Монитор внимания водителя
• Оповещение о задней двери
• Задний гидролокатор

Следующие функции являются опциональными в наличии:

• Система помощи при столкновении в слепых зонах, при которой система прикладывает тормозное усилие к каждому колесу, чтобы помочь вернуть автомобиль на исходную полосу движения
• Помощь при удержании полосы движения
• Распознавание дорожных знаков

В дополнение к Nissan Safety Shield 360, Pathfinder предлагает еще Другая группа функций помощи водителю называется ProPilot Assist.Раньше эта функция в основном зарезервировалась для топовых уровней отделки салона, но она впервые доступна в комплектациях Pathfinder SV и SL. Он сочетает в себе помощь в центрировании полосы движения с адаптивным круиз-контролем, чтобы снять часть нагрузки при вождении по шоссе и пригородном движении с остановками.

В комплектации Platinum ProPilot Assist с Navi-link соединяет электронный мозг системы с навигационной системой. Это позволяет ему использовать информацию карты, чтобы помочь контролировать скорость Pathfinder на съездах и на перекрестках с шоссе.

В течение целого дня вождения функции помощи водителю работали так, как они были задуманы. Во многих случаях их действие становится очевидным только после легкого толчка здесь и там. Адаптивный круиз-контроль было легко развернуть, и он работал хорошо. К счастью или к несчастью, испытательная площадка в Монтане не предлагала трафик между бамперами, так что функциональность не была протестирована.

Фото: Джек Нерад

Сколько грузового пространства имеет Nissan Pathfinder 2022 года?

У Pathfinder 2022 года их 16.6 кубических футов грузового пространства при использовании всех трех рядов, 45 кубических футов со сложенным третьим рядом и 80,5 кубических футов со сложенными вторым и третьим рядами.

Среднеразмерный внедорожник разработан для реальных ситуаций, например, для перевозки холодильника на 120 литров или четырех стандартных сумок для гольфа в багажном отделении. Инженеры Nissan расширили грузовой отсек и разработали люк, который позволяет Pathfinder перевозить 4x8 листов строительных материалов на полу.

В дополнение к стандартному грузовому отсеку, задний пол грузового отсека скрывает багажный ящик, который предлагает почти два кубических фута для хранения.Изучив предыдущий опыт, инженеры упростили чистку нового багажного отсека.

Достаточно ли расходуется бензин у Nissan Pathfinder 2022 года?

Nissan Pathfinder 2022 года сертифицирован Агентством по охране окружающей среды и обеспечивает скорость 23 мили на галлон при комбинированном движении с передним приводом. Платиновая отделка с большим количеством оборудования получит на одну милю на галлон меньше. К сожалению, в наши дни мы не смогли провести всесторонний тест на экономию топлива с различными моделями Nissan Pathfinder. Тем не менее, наша наблюдаемая экономия топлива с использованием приборов Nissan составила 22 мили на галлон.

Поскольку он оборудован топливным баком на 18,5 галлонов, есть основания ожидать, что Pathfinder будет иметь дальность полета почти 400 миль на полном баке.

Безопасен ли Nissan Pathfinder 2022 года?

Поскольку Nissan Pathfinder 2022 года является настолько новым, на момент написания этой статьи он не был оценен по безопасности Национальным управлением безопасности дорожного движения (NHTSA) или Страховым институтом безопасности дорожного движения (IIHS).

Сколько стоит Nissan Pathfinder 2022 года?

Цены на Nissan Pathfinder 2022 года варьируются от 33 410 долларов США за Pathfinder S 2WD до 48 090 долларов США за Platinum 4WD.Эти цены не включают сбор за место назначения в размере 1150 долларов США.

Каковы конкуренты Nissan Pathfinder 2022 года?

В первоначальном исследовании качества J.D. Power 2020 (IQS) автомобиль Kia Sorento занял первое место в сегменте верхних среднеразмерных внедорожников. Следующими по рейтингу моделями стали Dodge Durango и Toyota Highlander.

В исследовании J.D. Power 2020 Automotive Performance, Execution и Layout Study (APEAL) автомобиль Kia Telluride занял первое место в сегменте среднеразмерных внедорожников.Следующими по рейтингу моделями были Hyundai Palisade и Dodge Durango.

Другие конкуренты Pathfinder 2022 года включают Chevrolet Traverse, Ford Explorer и Honda Pilot.

Nissan Pathfinder предыдущего выпуска был хорошим автомобилем со многими достоинствами, но совершенно новая модель 2022 года лучше практически во всех отношениях. Новый Pathfinder выглядит лучше, лучше ездит и предлагает больше внутреннего пространства, чем предыдущая модель. Кроме того, он наполнен полезными функциями удобства и оснащен большим количеством средств защиты, чем когда-либо прежде.

Некоторые поклонники оригинального Pathfinder могут быть разочарованы тем, что новый не так сильно поддерживает внедорожный образ жизни, как первая пара поколений. Дело в том, что сегодняшние покупатели Pathfinder хотят не этого. Они хотят того, что им даст 2022 год - безопасной и комфортной поездки для их семьи на автомобиле, способном справиться со всем снаряжением, которое они берут с собой.

Нет, новый Pathfinder может найти не все пути. Но он пойдет туда, куда хотят его целевые покупатели.

Джек Р. Нерад десятилетиями тестировал дороги и писал о транспортных средствах для Интернета и печатных изданий, включая JDPower.com и другие. У него есть еженедельный подкаст под названием America on the Road, и его работы появлялись во многих престижных газетах, журналах и онлайн-изданиях.

Мнения, выраженные в этом обзоре, принадлежат автору, а не J.D. Power.

Никакая часть этих обзоров не может быть воспроизведена, распространена, публично отображена или использована для производных работ без J.D. Письменное разрешение Пауэра. © 2021 J.D. Пауэр

Mercedes-Benz Spied Testing Hardcore 4x4 Версия G63 AMG 6x6

Каждый раз, когда упоминается название G63 AMG 6x6, люди склонны сходить с ума. Не только мы это заметили. Немецкий автопроизводитель слишком хорошо знает потенциал шестиколесного монстра, поэтому теперь они работают над ... G63 AMG 4x4. Подождите, разве G63 AMG не является полноприводным автомобилем по определению?
Мы знаем, что это может показаться немного запутанным, но новая модель имеет смысл.Видите ли, шестиколесный автомобиль выводит возможности стандартного автомобиля на пересеченной местности, если мы можем его так назвать, на совершенно новый уровень, но имеет один серьезный недостаток: он слишком массивен, чтобы справиться с ним в повседневной жизни, когда дороги залиты камри и маленькими детьми.

Таким образом, Mercedes-Benz хочет дать нам лучшее из обоих миров, сочетая нормальную длину и ширину G-класса с экстравагантными трюками G63 AMG 6X6. О да, и кровати больше нет.

Хотя это звучит довольно нелепо, пока мы назовем шпионский прототип G63 AMG 4X4.Не волнуйтесь, немцы со временем придумают собственное имя. Может, окрестят G63 OMG. Технические детали
Галерея шпионских фотографий выше позволяет вам увидеть, насколько выше 4X4 по сравнению с G63 AMG, который мы все знаем. Судя по внешнему виду прототипа, мы ожидаем, что это будет заимствовано у шестиколесной портальной оси.

Точно так же, как шарнирное управление с рециркуляцией обеспечивает долговечность вождения по бездорожью, портальные мосты, военное решение, серьезно увеличивают дорожный просвет.Вместо того, чтобы быть центрированными на оси вала, как на, колеса размещены ниже, перемещение обеспечивается портальными шестернями на головках оси.

На английском языке это означает, что стандартная высота дорожного просвета G-класса 210 мм (7,9 дюйма) составляет колоссальные 460 мм (18,1 дюйма) для 6x6. Чтобы получить представление о том, что допускают такие характеристики, мы упомянем, что изменение увеличивает глубину брода Gelandewagen с 600 мм (23,6 дюйма) до полного метра (39,4 дюйма). Достаточно, чтобы выйти из машины и поиграть в акваланг...

А вот у G63 AMG 4x4 скачок дорожного просвета будет меньше. То же самое можно сказать и о колесах, которые больше, чем у обычного AMG, но не стоит ожидать чудовищных 37-дюймовых шин модели 6x6. В реальном мире
Наши сердца переполняются радостью, когда мы видим, как немецкие инженеры работают над такой внедорожной техникой. Мы не уверены, насколько увеличенная ширина колеи поможет G63 AMG 4x4 справиться с дополнительной высотой, но помимо этого автомобиль будет укротителем земель.

Увы, прежде чем мы закончим рассказ о том, как AMG создает официальный лифт-комплект для своего G-класса мощностью 536 л.с. (544 л.с.), мы не можем не подумать о социальной составляющей.

Точно так же, как рэперы обращаются к оберткам, чтобы превратить свои G63 AMG в swagmobile или что-то в этом роде, у G63 AMG 6x6 есть своя доля покупателей, которые позируют, а не бездельничают. Дэн Билзериан - такой же хороший пример, и хотя эти люди действительно помогают доить дойную корову из военных источников, они ничего не делают, чтобы улучшить репутацию иконы внедорожников.

Mercedes G63 AMG 4x4 - это тот автомобиль, который просто играет в своей собственной лиге, поэтому мы ожидаем, что он будет продаваться быстрее, чем вы можете сказать «профессиональное восхождение».

48-точечная установка одномолекулярного FRET с периодическим возбуждением акцептора

Реферат

Одномолекулярный FRET (smFRET) позволяет измерять расстояния между донорными и акцепторными флуорофорами в диапазоне 3-10 нм. На основе раствора smFRET позволяет измерять события связывания-разрыва или конформационные изменения меченых красителем биомолекул без усреднения по ансамблю и без поверхностных возмущений.При использовании двойного (или мульти) лазерного возбуждения smFRET позволяет определять количество флуоресцентных меток на каждой молекуле, значительно расширяя возможности исследования гетерогенных образцов. Основным недостатком smFRET на основе решений является низкая пропускная способность, что делает повторные измерения дорогостоящими и ограничивает возможность изучения кинетических явлений в режиме реального времени.

Здесь мы демонстрируем высокопроизводительную систему smFRET, которая мультиплексирует сбор данных с использованием 48 точек возбуждения и двух 48-пиксельных матричных детекторов SPAD.В системе используются два возбуждающих лазера, позволяющих разделять виды с помощью одного или двух активных флуорофоров. Эффективность системы продемонстрирована на наборе двухцепочечных олигонуклеотидов с двойной меткой и разными расстояниями между донорными и акцепторными красителями вдоль дуплекса ДНК. Мы показываем, что время сбора данных для точной идентификации субпопуляций сокращается с нескольких минут до секунд, открывая путь к высокопроизводительным приложениям скрининга и исследованиям кинетики ферментативных реакций, таких как транскрипция ДНК бактериальной РНК-полимеразой в реальном времени.

I. ВВЕДЕНИЕ

Детальное знание трехмерной (3D) атомистической структуры макромолекулярных комплексов необходимо для понимания их биологической функции. На протяжении десятилетий рентгеновская кристаллография и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) были предпочтительными методами для получения макромолекулярных структур с атомным разрешением. Совсем недавно криоэлектронная микроскопия одиночных частиц (крио-ЭМ) дополнила эти методы определения крупных макромолекулярных структур с добавленной способностью классифицировать различные конформации.Однако макромолекулы спонтанно и динамически исследуют различные конформации в равновесии, которые трудно уловить с помощью вышеупомянутых методов. Для понимания функциональных ролей этих структур требуется полная динамическая картина. Одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) ¹ проложил путь для изучения такой структурной динамики в биологически значимых условиях. smFRET позволяет определять каждое конформационное состояние, которое может существовать в ансамбле макромолекулярных комплексов, а также расстояние между конкретными остатками для каждого состояния ^{2⇓⇓⇓ – 6} .Недавно несколько групп внедрили smFRET для измерения расстояний между множеством разных пар остатков для построения трехмерных макромолекулярных структур различных конформаций путем триангуляции и сравнения с существующими рентгеновскими кристаллическими структурами ^{7⇓⇓⇓⇓ – 12} . Более того, smFRET может измерять временную эволюцию различных расстояний между несколькими парами FRET и, следовательно, сообщать о динамической трехмерной структуре макромолекулы, претерпевающей конформационные изменения. До сих пор из-за требования низкой концентрации образца, вызванного необходимостью иметь не более одной молекулы в ограниченном дифракцией конфокальном объеме в данный момент времени ^1,13 , можно измерить только очень медленную кинетику.Следовательно, повышенная пропускная способность важна как для статических, так и для динамических измерений на нескольких расстояниях.

Чтобы преодолеть это ограничение, мы недавно ввели схему многоточечного возбуждения, использующую преимущества новых решеток однофотонных лавинных диодов (SPAD) ^{14 – ⇓16} . Мы продемонстрировали, что полученная установка действительно позволяла получать данные о единичных молекулах, сравнимые со стандартными одноточечными установками, но с пропускной способностью, которая линейно масштабировалась с количеством пятен возбуждения.Мы проиллюстрировали применение этой повышенной пропускной способности, измеряя кинетику закрытия пузырьков во время ускользания промотора в бактериальной транскрипции ¹⁶ . Эти обнадеживающие результаты были частично неудовлетворительными, поскольку они были получены только с 8 пятнами, а также потому, что установка включала только один лазер, используемый для непрерывного возбуждения донорного красителя пары FRET ¹⁶ . Одинарный лазер smFRET не может отличить молекулы с низким FRET (молекулы с активными донорными (D) и акцепторными (A) красителями, в которых расстояние D-A велико по сравнению с радиусом Ферстера) от молекул, содержащих только D ( i.е. молекул с одним донором или молекул с двойной меткой с неактивным или обесцвеченным акцептором). Поскольку последние категории присутствуют в большинстве образцов, важно идентифицировать и отделить их от представляющих интерес молекул с низким FRET.

Чтобы решить эту проблему, несколько лет назад был введен микросекундное переменное лазерное возбуждение smFRET (далее для краткости называемый μsALEX) ^17,18 , а затем расширенный до схем импульсного лазерного возбуждения (nsALEX ¹⁹ или PIE ^{). 20} ).Вкратце, в μsALEX два возбуждающих лазера попеременно включаются и выключаются каждые несколько десятков мс, что позволяет разделить виды только с одним активным красителем, , т.е. , то есть популяции только D и только A, от видов с двойной меткой, с активными обоими красителями. , население FRET. Действительно, только популяции FRET излучают сигнал флуоресценции как во время лазера с D-возбуждением (из-за возбуждения донора), так и во время лазера с A-возбуждением (из-за возбуждения акцептора). Это, в свою очередь, увеличивает количество субпопуляций FRET, которые можно надежно идентифицировать в выборке в режиме низкой средней эффективности FRET, именуемой повсюду «низкой FRET».С тех пор эта схема была расширена до 4-х лазерных возбуждений, что позволило использовать мощные приложения для сортировки молекул ^21,22 . Упрощенная версия этого принципа чередования лазеров была представлена ​​в работе. 23, где лазер с D-возбуждением остается включенным все время, в то время как лазер с A-возбуждением чередуется. Этот метод FRET ²³ для одной молекулы периодического возбуждения акцептора, называемый для краткости PAX, упрощает оптическую установку, сохраняя при этом преимущества μsALEX, а именно возможность определять количество красителей D и A в каждой обнаруженной молекуле или упрощать извлечение точных значений эффективности FRET ²⁴ .Здесь мы представляем существенное улучшение нашей исходной многоточечной установки путем (i) введения 48-точечной схемы освещения и обнаружения и (ii) реализации подхода освещения PAX с двумя лазерами.

Этот документ организован следующим образом. В разделе II мы кратко представляем оптическую установку, детекторы (раздел II A) и схему модуляции (раздел II B). В Разделе III мы сообщаем об измерениях одиночных молекул, начиная с краткого описания образцов (Раздел III A) и анализа данных (Раздел III B).Чтобы продемонстрировать однородность по пятнам, мы изучаем пик пиковой скорости вспышки (Раздел III C) и гистограммы E-S (Раздел III D). Наконец, мы сравниваем измерения μsALEX в одной точке и измерения PAX в 48 точках (Раздел III E). В заключение мы приводим краткое изложение и точку зрения в Разделе IV.

A. Программное обеспечение и доступность данных

Программное обеспечение, используемое для работы с многоточечной установкой (включая создание шаблона LCOS-SLM, код временной отметки LabVIEW-FPGA, управление пьезодвигателем и т. Д.), Находится в различных репозиториях. доступно на GitHub ²⁵ .Программное обеспечение, используемое для анализа данных, можно найти в репозитории 48-spot-smFRET-PAX-analysis ²⁶ . В заголовок каждого рисунка добавляются ссылки на конкретные аналитические блокноты. Файлы данных общедоступны на Figshare ²⁷ .

II. ОПИСАНИЕ НАСТРОЙКИ

В этом разделе мы даем краткое описание установки. Более подробное описание можно найти в Приложении A, а детали юстировки лазера и массива SPAD можно найти в Приложении B и C.

Схема установки показана на Рис.1. Установка включает два лазера с непрерывным возбуждением мощностью 1 Вт (зеленый: 532 нм, красный: 628 нм), в которых только красный лазер модулируется через акустооптический модулятор (АОМ). После настройки поляризации и расширения луча два лазера модулируются по фазе с помощью их соответствующих LCOS-SLM, генерируя два шаблона из 48 точек на плоскости изображения перед каждым LCOS-SLM ( плоскость изображения LCOS ). Затем два модулированных лазерных луча объединяются дихроичным зеркалом ( DM _MIX ) и повторно коллимируются ( L ₃ ) перед фокусировкой в ​​образец с помощью большой числовой апертуры (NA). иммерсионный объектив (60X, NA = 1.2, Олимп, Уолтем, Массачусетс). Излучаемая флуоресценция собирается линзой объектива, отделена от длин волн возбуждения двухполосным полихроическим зеркалом ( DM _EX ) и фокусируется линзой трубки ( L ₂ ) на дно микроскопа. изображение самолета. Затем излучаемый флуоресцентный свет повторно собирается ( L ₄ ), разделяется на донорные и акцепторные спектральные полосы дихроичным зеркалом ( DM _EM ) и фокусируется на двух разных 48-пиксельных массивах SPAD. установлен на моторизованных ступенях микропозиционирования (векторы xyz).Система настроена таким образом, что каждый SPAD оптически сопряжен с одним пятном возбуждения в образце.

Выход из детекторов (одна последовательность импульсов TTL на SPAD) обрабатывается платой, оснащенной программируемой вентильной матрицей (FPGA) (PXI-7813R, National Instruments, Остин, Техас), которая выполняет временную метку фотонов с 12,5 ns и асинхронно передает данные на главный компьютер. На главном ПК запускается программное обеспечение сбора данных LabVIEW, которое отображает в режиме реального времени дискретизированный сигнал, записанный со всех 96 каналов, в виде 96 временных графиков с цветовой кодировкой, реализует процедуры выравнивания и сохраняет данные на диск.После сбора данных преобразование файлов в формат Photon-HDF5 ²⁸ и анализ выполняются на втором ПК, что позволяет непрерывно получать последовательные файлы.

A. Детекторы

Текущая 48-точечная установка использует два идентичных массива SPAD 12x4 пикселей, архитектура и производительность которых были ранее представлены ²⁹ . Здесь мы описываем только самые важные из них. Каждый SPAD имеет активную область диаметром 50 мкм, массив состоит из 4 строк по 12 пикселей (4x12), разделенных на 500 мм в обоих направлениях.

Чтобы легко интегрировать детекторы в установку, мы разработали модуль подсчета фотонов, который объединяет 48-пиксельную матрицу SPAD и электронику, необходимую для работы устройства, сбора и передачи данных. Массив SPAD помещен в герметичную камеру, отделенную от остальной части модуля уплотнительными кольцами, и использует тонкую стеклянную пластину в качестве входного окна. Камера регулярно промывается и заполняется сухим газообразным азотом для предотвращения конденсации, что позволяет установить матрицу на двухступенчатом элементе Пельтье для охлаждения детектора до температуры приблизительно -15 ° C.При этой температуре скорость счета в темноте (DCR) значительно снижается, что увеличивает отношение сигнала к фону прибора. Импульсы счета фотонов передаются через стандартный разъем SCSI. Это позволяет легко подключить модуль к универсальным модулям сбора данных или к платам адаптера, когда требуются различные разъемы или формы импульсов. В качестве альтернативы можно использовать встроенную ПЛИС (Spartan 6 SLX150, Xilinx, Сан-Хосе, Калифорния) для подсчета отметок времени, обнаруженных в каждом из 48 каналов, с разрешением по времени 10 нс.Затем эта информация отправляется на главный компьютер через высокоскоростной USB-канал. Резьба C-mount вокруг входного окна модуля счета фотонов позволяет легко и надежно подключаться к оптической системе.

Рис. 1.

Схема установки PAX на 48 точек. Лазеры и детекторы находятся на основном оптическом столе, а микроскоп (заключен в пунктирную рамку), расширители луча и LCOS-SLM расположены на приподнятой макетной плате. См. Основной текст и Приложение A для подробного описания.

Два массива SPAD, используемые в текущей 48-точечной установке PAX, работают при температуре –10 ° C.Эффективность регистрации фотонов (PDE) достигает максимума ~ 45% при 550-580 нм (донорный краситель, пик эмиссии ATTO550) и падает до ~ 30% при 670 нм (акцепторный краситель, пик эмиссии ATTO647N) ^29,30 . PDE очень однороден по массиву, с размахом от пика до пика всего несколько процентов ²⁹ . На рис. 2 показаны DCR для двух массивов SPAD 12 × 4. Примерно 80% пикселей имеют DCR ниже 1000 импульсов в секунду (cps), а пиксель с худшей производительностью имеет довольно высокий DCR, составляющий почти 6 kcps.

Результаты 48-точечного PAX сравнивались с результатами современной одноточечной установки μsALEX, ранее описанной в 16. Однопиксельные SPAD (SPCM-AQRH, Excelitas Technology Corp., Waltham, MA), используемые в установке μsALEX, характеризуются PDE ~ 60% при 550 нм и ~ 70% при 670 нм, с заметно лучшей чувствительностью в полосе излучения донора и PDE, который более чем в два раза выше для излучения акцептора. группа. По этой причине ожидается, что установка μsALEX будет как минимум в два раза более чувствительной в A-канале, чем установка на 48 точек.Подробное сравнение различных технологий SPAD для измерения одиночных молекул приведено в документе 30.

B. 48-точечная диаграмма

48 точек возбуждения генерируются независимо для каждой длины волны посредством фазовой модуляции входящего лазерного фронта волны, так как ранее описано в 16 и 32. Фазовая модуляция работает в прямом пространстве, а не в пространстве Фурье, и реализует фазовый профиль матрицы линз Френеля. Аналогичная прямая пространственная модуляция с использованием другого пространственного расположения фазовой картины на LCOS-SLM также была продемонстрирована для мультиконфокальной флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS) ³³ .

На рис. 3 показана диаграмма излучения образца красителя с высокой концентрацией при возбуждении зеленым (панель A) и красным (панель B) лазером, как это видно с камеры, установленной на боковом отверстии микроскопа. Два шаблона выровнены для максимального перекрытия каждого из 48 точек.

Рис. 2.

тепловых карт DCR для массивов D- и A-SPAD 12x4, используемых в установке PAX с 48 точками. Значения DCR в отсчетах в секунду (cps) указаны в каждом пикселе. Более подробную информацию и данные можно найти в прилагаемой записной книжке анализа DCR ³¹ .

Рисунок 3.

Многоточечный узор 12x4 для зеленого (A) и красного (B) возбуждение и гауссовское соответствие пятен (C). Рисунок получен камерой, установленной на боковом отверстии микроскопа (см. Рис. 1), с использованием раствора красителей ATTO550 и ATTO647N в высокой концентрации (~ 100 нМ). Флуоресцентные изображения, полученные при возбуждении лазером 532 нм или 628 нм, получали отдельно и представлены в зеленом и красном уровнях интенсивности на панелях (A) и (B), соответственно. Шкала 5 мм. Для оценки совмещения каждое пятно на двух изображениях снабжено двухмерной функцией Гаусса.Панель (C) сообщает о наложении подобранных положений пиков и контура гауссовой перетяжки для изображений 532 нм ( зеленый ) и 628 нм ( красный ). Справа показаны 3 репрезентативных пятна. Эллиптическая форма и наклон гауссианы обусловлены геометрическими аберрациями. Более подробную информацию можно найти в прилагаемой тетради для центровки ³⁴ .

Перекрытие двух длин волн и центрирование по отношению к оптической оси оценивается путем двухмерной подгонки по Гауссу для каждого отдельного пятна, как показано на панели C.Полную информацию о процедуре совмещения и оценки образца можно найти в Приложении A 1.

III. ИЗМЕРЕНИЯ SMFRET

A. Образцы

Измерения одиночных молекул проводили с молекулами двухцепочечной ДНК (дцДНК) из 40 пар оснований (п.о.), меченных красителями ATTO550 (D) и ATTO647N (A) (ATTO-TEC GmbH, Siegen , Германия), прикрепленные к разным основаниям ДНК, что дает разные расстояния между красителями.

D-A разделение 12 пар оснований и 22 пар оснований использовалось в этих экспериментах, поскольку они покрывают типичный диапазон расстояний, которые могут быть точно измерены с помощью smFRET с использованием этой пары красителей.Образцы разбавляли до концентрации одной молекулы (~ 50 пМ) в TE50 (10 мМ Трис pH 8,0, 1 мМ EDTA и 50 мМ NaCl) или в «буфере для транскрипции» (40 мМ HEPES-NaOH pH 7, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl ₂ , 1 мМ DTT, 1 мМ MEA, BSA: 100 мкг / мл) ³⁵ . Буфер TE50 использовался для всех измерений, за исключением данных, собранных для фиг. 12 и 13. Буфер для транскрипции снижает фотообесцвечивание, и это было необходимо для того, чтобы один образец можно было последовательно измерять на обеих установках без значительной потери флуоресценции.Полная информация об образцах ДНК представлена ​​в исх. 16.

B. Анализ

Мы проанализировали данные, используя стандартные методы μsALEX ²⁴ с модификациями, необходимыми для PAX ²³ . Три этапа анализа включают в себя: (a) оценку фона, (b) поиск пакета и (c) выбор пакета. Оценка фона, необходимая для корректировки количества вспышек в различных потоках фотонов, была выполнена в течение 10-секундных временных окон, чтобы учесть возможные изменения фона во время измерения.Пакетный поиск выполнялся независимо для каждого пятна с использованием алгоритма скользящего окна ¹³ и порога постоянной скорости для всех пятен ³⁶ . Выбор пакета выполняется с использованием пакетов, размер которых превышает заданный порог, где размер пакета определяется в соответствии с ур. D5 или D14. Чтобы изолировать популяции FRET, мы дополнительно фильтруем пакеты с помощью DA _ex A _em отсчетов, превышающих второй заданный порог.Полную числовую информацию можно найти в соответствующей записной книжке ²⁶ .

Основным результатом методов анализа μsALEX и PAX является так называемая двумерная гистограмма ES, где каждый пакет представлен парой значений ( E , S ), вычисленных на основе различных интенсивностей потока фотонов ( см. раздел III D). Ось E на этой гистограмме может представлять либо эффективность FRET, либо, чаще, нескорректированную эффективность FRET E _PR , известную как коэффициент близости. E _PR легче вычислить, чем E , и обеспечивает подходящее приближение для идентификации подгрупп. Однако, хотя это не является целью данного исследования, когда целью является извлечение расстояний DA, все поправочные коэффициенты должны быть точно оценены, чтобы вычислить E. S , или «стехиометрический коэффициент», является величиной, которая обычно имеет значение ~ 0: 5 для видов с двойной меткой, ~ 0 для A-only и ~ 1 для D-only видов. Области видов D и A на гистограмме E-S также включают молекулы с двойной меткой и одним неактивным красителем из-за фото-мигания или обесцвечивания.В отличие от скорректированного отношения стехиометрии S _γβ (уравнение D9), нескорректированное отношение S (уравнение D8) может проявлять зависимость от E , и для молекул с двойной меткой не обязательно центрируется около 0,5. . Использование пары ( E , S ) (скорректированная или нескорректированная) позволяет разделить виды с одной и двумя метками и выделить субпопуляции FRET в популяции с двойной меткой. Полные определения E и S , а также сравнения между вариантами ALEX и PAX представлены в Приложении D.

В этой статье мы сообщаем о коэффициентах близости E _PR , вычисленных в соответствии с уравнением. D6, и «модифицированное соотношение стехиометрии» S _u , определенное в ур. D19. S _u - это вариант классического соотношения стехиометрии PAX ²³ , который снижает эффект дробового шума и улучшает разделимость популяций только D и FRET. Более подробную информацию о S _u можно найти в Приложении D 1.Обратите внимание, что на протяжении всей этой работы результаты для двух крайних левых точек во второй строке отсутствуют из-за отказа активной схемы гашения (AQC) в массиве D-SPAD.

C. Пиковая скорость фотонов

Пиковая скорость фотонов, достигнутая в каждом всплеске, сообщает о пиковой интенсивности PSF ¹⁶ . На рис. 4А показаны скорректированные по фону распределения пиковой скорости фотонов с их характерными экспоненциальными хвостами. На рис. 4B-E для различных потоков фотонов показаны тепловые карты средних значений максимальной скорости фотонов, i.е. константа затухания экспоненциального хвоста. Из-за гауссова профиля луча возбуждения и геометрических аберраций боковые пиксели получают более низкую интенсивность сигнала, чем центральные пиксели. В результате пиковая скорость фотонов уменьшается, и в боковых пятнах обнаруживается меньшее количество всплесков одиночных молекул. Несмотря на такое уменьшение интенсивности возбуждения, положение пиков E _PR и S остается довольно однородным по всем пятнам (см.рис.7 и 9). Исключение можно увидеть на рис. 4C, E, где пиксель в позиции (1, 7) в массиве A-SPAD обнаруживает меньше фотонов, чем его соседи, эффект, который мы приписываем более низкому PDE этого пикселя, возможно, из-за меньшее приложенное перенапряжение. Для этого пятна (19) мы наблюдаем заметное смещение в величинах E _PR и S (см. Рис. 7 и 9).

Для сравнения на рис. 5 показано распределение пиковых скоростей фотонов, полученных с помощью установки μsALEX. Абсолютную мощность, выдаваемую в каждой точке в многоточечной установке, трудно измерить.Поэтому мы определили оптимальную мощность D-лазера (200 мВт на выходе лазера), чтобы пиковое распределение скорости фотонов в центральных точках было сравнимо с пиковым значением фотонной скорости одиночного пятна (190 мкВт, измеренное перед объективом). Мощность A-лазера была установлена ​​на 400 мВт (выходная мощность лазера до AOM), как компромисс между необходимостью компенсации более низкого PDE в A-канале и ограничением фотообесцвечивания образца и термической нестабильности.

Сравнение рис. 4A и 5 видно, что снижение чувствительности в массиве A-SPAD приводит к более низким пиковым скоростям фотонов в D _ex A _em (красный) и DA _ex A _em (фиолетовый) потоков в 48-точечной настройке.Чувствительность A-канала вызывает сдвиг в положениях пиков E _PR и S , как обсуждается в следующем разделе.

D. Гистограммы ES

На рис. 6 показаны гистограммы ES для образца дцДНК с разделением DA 12 п.н., полученные после поиска пакета и выбора размера, описанного в Разделе III B.

Популяции D-only и FRET, вверху левый угол и центр соответственно на гистограмме ES четко различимы во всех точках.Более того, как показано на рис.7, совокупность FRET легко изолировать, применяя второй пакетный выбор с использованием минимального порога на DA _ex A _em отсчетов. Второй пример такого выбора показан на рис. 11. Разделение видов FRET от однократно меченых видов является основным преимуществом двойного лазерного возбуждения ^17,39 .

Даже без калибровки разброс по разным точкам ограничен и не влияет на способность различать субпопуляции.Это видно на рис. 8, на котором показаны положения центра пиков E _PR и S _u в разных точках как для популяций только D, так и для FRET. На рис.9 показан центр и диапазон ± 1 σ из гауссовых аппроксимаций гистограмм E _PR и S _u популяции FRET (синяя точка и полоса ошибок). Оранжевая точка - это среднее положение центрального пика популяции FRET во всех точках.Для большинства пятен отклонение положения пика значительно ниже диапазона ± 1 σ , за исключением пятна 19, где более низкое А-пиксельное PDE вызывает большее отклонение. Обратите внимание, что на рис. 8 и 9 представлены результаты без калибровки, что демонстрирует минимальную производительность системы. Можно практически исключить изменения положения пика E-S от точки к точке во время постобработки, применив калибровку для конкретной точки, как кратко описано в следующем разделе (подробности в Приложении E).В качестве дополнительного примера, гистограмма ES для дцДНК с низким FRET (разделение DA 22 п.н.) представлена ​​на рис. 15, приложение F.

E. Объединение данных по всем точкам

Заключительный этап многоточечного анализа состоит из объединение данных со всех точек для увеличения эффективной скорости накопления данных. Неравномерность между различными пятнами может быть учтена путем применения двухэтапной коррекции, в которой каждый поправочный коэффициент γ и β (уравнение D3 и D4) разлагается на произведение двух последовательно применяемых факторов: средний поправочный коэффициент, вычисленный по всем точкам, и относительная поправка для конкретных точек.Специфическая для пятна поправка γ и β может быть легко вычислена из измерения статического образца FRET (подробности в Приложении E). Для простоты и из-за хорошей однородности пятен мы не применяем в этой работе какие-либо специфические поправки.

На рис. 10 показаны кумулятивные гистограммы ES смеси двух конструкций дцДНК с разделением DA 12 и 22 п.н. (см. Раздел III A), что дает среднее значение E _PR ~ 0: 6 и ~ 0:15 соответственно.Значительная популяция только D видна в виде пика около E _PR = 0:05, S _u = 1. Из-за относительно низкой PDE акцепторного канала (см. Раздел II A), разделение популяций только D и FRET может быть в принципе проблематичным. Как показано ранее (рис. 7), популяции FRET могут быть выбраны путем установки порога на скорректированный по фону DA _ex A _em отсчетов.Рис. 11 показывает, что этот отбор эффективно удаляет большой пик только D, изолируя популяции FRET без значительной потери пакетов FRET.

Рис. 4.

Пиковая скорость вспышки фотонов в каждом из 48 пятен для образца дцДНК с разделением D-A 12 п.н. Выходная мощность лазера, измеренная до использования какой-либо оптики, была установлена ​​на 200 мВт и 400 мВт для D- и A-лазеров соответственно. A: Полное распределение пиковых скоростей фотонов. B-E: Среднее пиковое распределение скорости фотонов в различных потоках фотонов.Два боковых пятна во втором ряду не показывают сигнала из-за двух неисправных пикселей в массиве D-SPAD. Цвета соответствуют разным потокам фотонов. Зеленый: D _ex D _em , красный: D _ex A _em , голубой: DA D _em , фиолетовый: DA _ex A _em .См. Приложение D для определения потоков ALEX и PAX. Дополнительные сведения см. В прилагаемой записной книжке для анализа PAX на 48 точек ³⁷ .

При многоточечных измерениях в принципе возможно, что молекула, обнаруженная в одном пятне, может быть обнаружена в другом месте, что может повлиять на выводы, сделанные на основе совокупных данных для всех пятен. Необходимо рассмотреть два возможных сценария: (i) сигнал одной молекулы, обнаруженный в одном месте, обнаруживается в другом из-за эффектов перекрестных помех, и (ii) одиночная молекула, обнаруженная в одном пятне, диффундирует и позже обнаруживается в другом пятне. .Первый сценарий может быть исключен из-за геометрии установки, которая гарантирует отсутствие перекрытия между соседними объемами обнаружения, а также из-за низких коэффициентов оптических перекрестных помех типа массивных детекторов SPAD, используемых в этой работе ¹⁶ . Второй сценарий не повлияет на анализ всплесков, так как эти события приведут только к корреляции между всплесками в разных точках в масштабе времени, определяемом диффузией из одного пятна в другое (Δ t ≫ d ² /4 D , с d ≈ 5 мкм, D ≈ 100 μ с ² с ⁻¹ , дает Δ t ≫ 60 мс для двух ближайших соседних пятен).На практике мы не смогли обнаружить какую-либо такую ​​взаимную корреляцию в измерениях, представленных здесь, предполагая, что из-за размера и расстояния между пятнами возбуждения вероятность возникновения таких событий очень мала.

В качестве иллюстрации возможностей нашей установки с высокой пропускной способностью на рис. 12 и 13 показаны примеры окон сбора данных длительностью 5 с, полученных с одной и той же каплей образца дцДНК с двойной меткой, последовательно с использованием одноточечного μsALEX и многоточечного анализа. установки (образец представляет собой дцДНК с разделением DA 12 п.н., описанную в разделе IIIA).В обоих случаях использовался поиск пакетов с постоянной скоростью и порогом (20 кГц) с последующим выбором пакета на основе D _ex отсчетов ( _γ > 20, см. Уравнение D5). Конкретные временные окна, показанные на рисунках 12 и 13, показывают 37-кратную разницу в количестве пакетов между двумя измерениями (40 ± 11-кратное вычисление для всех последовательных 5-секундных окон в течение двух 5-минутных измерений), что разумно в соответствии с 46-кратной разницей, ожидаемой между двумя установками, при условии, что все экспериментальные условия идентичны.Большое стандартное отклонение измеренного отношения отражает естественно большую дисперсию скорости пакетов (количество пакетов в единицу времени) в рамках любого данного измерения. Более того, поскольку скорость пакетов зависит от ряда параметров измерения и анализа, коэффициенту скорости пакетов не следует придавать чрезмерное значение. Например, более низкая мощность в боковых точках многоточечной установки (см. Рис. 3) приведет к меньшим пакетам и, следовательно, меньшему количеству пакетов, выживших при выборе. В то время как более низкая эффективность обнаружения массива SPAD в красной области спектра (по сравнению с установкой с одним пятном, см. Раздел II A) снижает сигнал акцептора при многоточечном измерении, что также приводит к меньшему и меньшему количеству всплесков выше порога выбора размера , этот потенциальный источник различий был компенсирован использованием скорректированных на γ размеров всплесков (ур.D5). Наконец, различия в объемах наблюдений между установками, на что указывает несколько более длительная длительность импульсов в многоточечном измерении (предполагающая большие объемы), также будут влиять на различную обнаруженную скорость всплесков. Несмотря на эти предостережения, очевидно, что многоточечная установка обнаруживает гораздо большее количество всплесков, чем одноточечная установка.

Рисунок 5.

Распределение пиковых скоростей фотонов при измерении μsALEX одной точки той же дцДНК с разделением D-A 12 п.н., используемым в измерениях с 48 точками (рис.4). Средняя мощность лазера на входе в микроскоп после чередования АОМ составляла 190 мкВт и 80 мкВт. Цвета соответствуют разным потокам фотонов. Зеленый: D _ex D _em , красный: D _ex A _em , фиолетовый: A _выс. . См. Приложение D для определения потоков ALEX и PAX. Для получения более подробной информации см. Прилагаемый блокнот для одноточечного анализа ALEX ³⁸ .

Сравнение рисунков 12 и 13 показывает, что значительное количество пакетов (~ 1000) может быть получено всего за несколько секунд после сбора данных. Такая высокая пропускная способность является преимуществом для остановленных потоков или эквивалентных кинетических измерений в реальном времени, когда реакция запускается в нулевой момент времени, а эволюция пробы непрерывно отслеживается впоследствии. Временное разрешение измерения, , то есть наименьшее используемое временное окно (или временной интервал), обратно пропорционально зависит от скорости передачи пакетов (а также от типа информации, извлекаемой из данных) на основе числовой статистики.В простом случае, когда начальное и конечное состояния FRET реакции известны, и соответствующее количество каждой популяции является подходящим параметром реакции, количество всплесков в каждой субпопуляции может быть извлечено из гистограммы FRET с относительно небольшим количество пакетов на интервал времени. Количество пакетов, собранных в эксперименте, показанном на рис. 12, определенно будет совместимо с эффективным временным разрешением ≤ 5 с. Чтобы в полной мере воспользоваться таким временным разрешением, экспериментальное мертвое время (продолжительность стадии начального перемешивания в реакции) должно быть короче, и может потребоваться автоматизированная микрофлюидная система (1 с, в отличие от ручного перемешивания, описанного в кинетическое измерение исх.16, где было получено мертвое время не менее 15-20 с). Такую многоточечную систему можно также с успехом использовать для выполнения быстрых серий измерений одного и того же образца в разных условиях или разных образцов для приложений высокопроизводительного скрининга, среди других возможностей.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы описали 48-точечную установку возбуждения с двумя лазерами, разработанную для высокопроизводительных анализов smFRET. По сравнению с нашей предыдущей многоточечной установкой ¹⁶ количество точек было увеличено в шесть раз с соответствующим увеличением пропускной способности.В то время как более крупные массивы SPAD были продемонстрированы другими группами, они производятся с использованием стандартных процессов КМОП высокого напряжения, что приводит к худшим характеристикам счета фотонов, чем применяемый здесь специализированный технологический процесс. Убедительные приложения для FCS и FLIM ячеек, среди прочего, были опубликованы с этими массивами CMOS SPAD ^{42⇓⇓⇓ – 46} (подробный обзор см. 47), но они все еще далеки от обеспечения чувствительности, необходимой для одиночных -молекулярные приложения.

По сравнению с нашими предыдущими работами ^16,48 , был включен второй лазер с переменным возбуждением, и соответствующие препятствия выравнивания были решены, что позволило сортировать одиночные молекулы в соответствии с их стехиометрией D-A.В частности, мы показали, что установка позволяет идентифицировать виды с одной и двумя метками во всем диапазоне эффективности FRET, открывая двери для гораздо более широкого диапазона анализов, чем это было возможно ранее.

Мы представили подробное описание процедуры настройки и юстировки нескольких точек, которая включает в себя ряд технических решений, представляющих потенциальный интерес для других приложений. Мы также проиллюстрировали возможности измерения sm-FRET новой установки с использованием молекул дцДНК с двойной меткой в ​​качестве доказательства принципиальной демонстрации разделения субпопуляций и высокопроизводительных измерений.Наконец, мы сравнили его характеристики со стандартной одноточечной (конфокальной) установкой μsALEX. Применение этого нового инструмента для изучения начальных стадий бактериальной транскрипции и высокопроизводительной диагностики будет изучено в будущей работе.

Рисунок 6.

E _PR в сравнении с гистограммами S _u в различных точках для образца дцДНК с разделением D-A 12 п.н. Видны две субпопуляции: только D (приблизительно E _PR = 0, S _u = 1) и население FRET (приблизительно E _PR = 0: 6, S _u = 0: 6).Поиск всплеска проводился с использованием всех фотонов с постоянным порогом (50 kcps). Выбор пакета был выполнен по общему размеру пакета после коррекции фона с использованием порога в 40 фотонов. В легенде на каждом подзаголовке указано количество точек в скобках и количество всплесков (#B). Для получения более подробной информации см. Прилагаемую записную книжку для анализа PAX на 48 точек ³⁷ .

Рисунок 7.

E _PR в сравнении с гистограммами S _u в разных точках для образца дцДНК с разделением D-A 12 п.н.Анализ данных и поиск пакетов идентичны рисунку 6, в то время как выбор пакета адаптирован для выбора только совокупности FRET: пакет выбирается, если количество отсчетов в D _ex A _em и DA _ex A _em оба потока больше 20. В легенде на каждой подзаголовке указано количество точек в скобках и количество пакетов (#B). Для получения более подробной информации см. прилагаемые 48 блокнот для анализа PAX ³⁷ .

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят Луку Миари за помощь на начальном этапе этого проекта, г-на Язана Альхадида и доктора Эйтана Лернера за помощь с подготовкой образцов одной молекулы и д-ра Эйтана Лернера за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим доктора Бентолилу за щедрую ссуду LCOS-SLM от фонда общих ресурсов Advanced Light Microscopy / Spectroscopy в Калифорнийском институте наносистем в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения (номер награды R01 GM095904 и R01 GM069709) и Национальным научным фондом (номер премии MCB 1244175).Авторы несут исключительную ответственность за содержание, которое не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или Национального научного фонда.

Заявления о конфликте интересов: S. Weiss раскрывает интеллектуальную собственность, использованную в исследовании, о котором идет речь. М. Гиони раскрывает долю в Micro Photon Devices S.r.l. (MPD). В этой работе не были задействованы ни ресурсы, ни персонал MPD. Работа в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе проводилась в лаборатории доктора Вайса.

Приложение A: Подробное описание установки

Установка (рис.1) состоит из двух непрерывных лазеров возбуждения, излучающих на длинах волн 532 и 628 нм (2RU-VFL-Series, MPB Communications Inc., QC, Канада). Для каждого лазера полуволновая пластина и поляризационный светоделитель используются для управления поляризацией и интенсивностью, так как ориентация поляризации должна быть выровнена в направлении, требуемом LCOS-SLM. Лазерный луч с длиной волны 628 нм проходит через AOM (P / N 48058 PCAOM, электроника: P / N 64048-80-.1-4CH-5M, Neos Technology, Мельбурн, Флорида), используемый для модуляции временного масштаба в мкс. Лазер 532 нм не модулируется.Каждый лазерный луч проходит через первый расширитель луча (телескоп Кеплера, дуплетные линзы: фокусные расстояния 50 мм и 250 мм). Два перископа направляют лучи на приподнятый оптический макет, на котором стоит инвертированный корпус микроскопа (IX-71, Olympus Corp., Уолтем, Массачусетс), его нижний порт расположен над круглым отверстием в макете. Помимо перископа, каждый луч проходит через второй регулируемый расширитель луча (3X, P / N 59-131, Edmund Optics Inc.). Красный лазерный луч отражается от зеркал M 1 _R и M 2 _R и модулируется по фазе с помощью «красного» LCOS-SLM (P / N X10468-07, Хамамацу, Япония. ), перед прохождением через дихроичное зеркало D _MIX .Зеленый лазерный луч отражается от M 3, модулируется по фазе «зеленым» LCOS-SLM (P / N X10468-01, Hamamatsu) и комбинируется с красным возбуждением через дихроичное зеркало D _MIX (T550LPXR, Chroma Technology Corp, VT). Оба луча повторно коллимируются линзой L ₃ (f = 250 мм, AC508-250-A, Thor-labs) и фокусируются в образец водно-иммерсионным объективом с высокой числовой апертурой (UAPOPlan 60X, NA 1.2, Olympus) после отражения от дихроичного зеркала возбуждения DM _EX (Brightline FF545 / 650-Di01, Semrock Inc., Нью-Йорк). Схема возбуждения формирует двухцветный массив пятен 12x4 в образце, соответствующий геометрии двух массивов SPAD. Флуоресцентное излучение улавливается той же линзой объектива, проходит через дихроичный возбуждающий DM _EX и фокусируется линзой L ₂ микроскопа на боковой или нижней стороне микроскопа. Боковой порт оборудован камерой CMOS (Grasshopper3 GS3-U3-23S6M-C, FLIR Integrated Imaging Solutions Inc., Британская Колумбия, Канада), используемого во время юстировки, а нижний порт перенаправляет лучи на путь излучения массива SPAD. Здесь релейная линза L ₄ (f = 100 мм, AC254-100-A, Thorlabs) повторно коллимирует изображение и отправляет его на эмиссионное дихроичное зеркало D _EM (Brightline Di02-R635, Semrock), который разбивает сигнал на донорную (D) и акцепторную (A) спектральные полосы. Сигнал D проходит через полосовой фильтр (Brightline FF01-582 / 75, Semrock), который устраняет остаточную утечку лазера с длиной волны 628 нм и помогает подавить рамановское рассеяние от лазера с длиной волны 532 нм.Оба сигнала D и A перефокусируются линзами L 5 _D / L 5 _A (f = 150 мм, AC254-150-A, Thorlabs) на двух 48-пиксельных массивах SPAD ²⁹ (в тексте обозначается как D и A-SPAD).

Рис. 8. Диаграмма рассеяния

подогнанного E _PR , S _u положение пика в различных точках для популяций только D ( оранжевый крест ) и FRET ( синий плюс ).Значения были получены с помощью гауссовой аппроксимации одномерной гистограммы E _PR и S _и после импульсной селекции, которая изолировала популяции только D-только и FRET соответственно. Дополнительные сведения см. В прилагаемой записной книжке для анализа PAX на 48 точек ³⁷ .

Обе матрицы SPAD установлены на 3-осевом микропозиционере. Движение в направлениях X и Y, ортогональных оптической оси, управляется программным обеспечением с помощью пьезоприводов с разомкнутым контуром (P / N 8302; драйверы: P / N 8752 & 8753; Newport Corporation, Irvine, CA).Третья ось (Z) использует ручной привод, так как требования к направлению Z гораздо менее строгие, чем к направлениям X и Y. Массив D-SPAD установлен на дополнительной платформе вращения вокруг оптической оси, которая используется для согласования относительной ориентации массивов SPAD. Программное обеспечение для управления микропозиционерами доступно в репозитории picomotor в 25.

Каждый модуль массива SPAD оснащен внутренней FPGA (Xilinx Spartan 6, модель SLX150), датчиком влажности и USB 2.0 соединение. Встроенное ПО FPGA, используемое в этой работе по умолчанию, позволяет получать отсчеты с временным интервалом с низким разрешением (10–100 мс) через USB-соединение, а также используется для мониторинга влажности. Кроме того, стандартный разъем SCSI включает 48 независимых выходов, обеспечивающих импульс для каждого обнаруженного фотона в каждом пикселе ²⁹ . Два порта SCSI подаются через специальный адаптер к плате сбора данных на основе FPGA (плата FPGA: PXI-7813R, стойка PXI: PXI-1000B, National Instruments, Остин, Техас), которая выполняет временную метку фотонов с помощью 12.Разрешение 5 нс параллельно на 96 каналах (задача реализована в LabVIEW с использованием модуля LabVIEW FPGA, код доступен в репозитории Multi-channelTimestamper в ссылке 25). Плата FPGA передает данные асинхронно на главный компьютер через канал MXI-4 в пользовательскую программу сбора данных, написанную в LabVIEW (стоечная плата PXI: PXI-8331; плата ПК: PCI-8331, National Instruments). Программа сбора данных также управляет чередованием красного лазера с помощью платы генерации импульсов (PXI-6602, National Instruments) с часами, синхронизированными с платой ПЛИС с отметками времени через стойку PXI.

В дополнение к вышеупомянутой программе сбора данных, главный компьютер запускает вторую программу LabVIEW, управляющую фазовой диаграммой на двух LCOS-SLM. Во время выравнивания программа сбора данных взаимодействует с программой управления LCOS для сканирования позиций шаблона LCOS при записи сигнала от массивов SPAD (см. Приложение B).

Необработанные данные, передаваемые с ПЛИС, сохраняются на диск в двоичном файле вместе с текстовым файлом метаданных, содержащим детали измерений (описание образца, мощность лазера, информацию о чередовании и т. Д.)). Оба файла используются для создания окончательного файла Photon-HDF5 ^28,49 . После сохранения измерения на главном ПК необработанные данные автоматически передаются на рабочую станцию ​​на базе Linux по каналу Ethernet 1 Гбит / с. Вторая рабочая станция автоматически выполняет преобразование в Photon-HDF5 и анализ данных, оставляя главный компьютер доступным для получения следующего набора данных. Скрипты для передачи, преобразования и автоматического анализа данных доступны в репозитории transfer_convert в исх. 25.

Рис. 9.

Положение пика подогнанного FRET ( E _PR , S _u , синие точки ) и ± 1 σ подогнанного гаусса ( синие полосы погрешностей ) для 46 активных точек. Для справки, среднее значение E _PR , S _u по всем 46 точкам ( оранжевая точка ) указано на каждом подзаголовке. Номер точки указывается в правом верхнем углу каждого участка.Дополнительные сведения см. В прилагаемой записной книжке для анализа PAX на 48 точек ³⁷ .

Рисунок 10.

48-точечное измерение PAX смеси двух конструкций дцДНК с разделением D-A 12 и 22 п.н. (подробности образца в разделе III A). Пакетный поиск был выполнен на всех каналах с использованием порога постоянной скорости 50 кбит / с. Пакеты были выбраны на основе их общего размера с критерием ∧ _{γP AX} > 80, используя γ = 0: 5 (см. Уравнение D14). Гистограмма E-S была построена путем объединения данных по всем точкам без коррекции для конкретных точек.Для получения дополнительных сведений см. Прилагаемый блокнот для 48-точечного PAX-анализа смеси 12 и 22 п.н. ⁴⁰ .

1. Модуляция LCOS-SLM

Массив из 48 пятен возбуждения генерируется отдельно для каждого цвета двумя LCOS-SLM посредством фазовой модуляции входящей плоской волны, как ранее описано в 16 и 32. Вкратце, LCOS-SLM реализует фазовый профиль решетки линз, которая фокусирует падающую плоскую волну в массив пятен на расстоянии 3-4 см перед поверхностью LCOS-SLM (см.рис.1). Прямоугольная область LCOS-SLM разделена на смежные блоки 12x4, каждый из которых реализует одну линзу. Шаблон можно регулировать, изменяя его центральное положение, поворот и шаг по осям X и Y независимо (операции, эквивалентные смещению, повороту или масштабированию массива линз). Для обеих длин волн возбуждения шаг и, следовательно, диаметр линз определяются геометрией детектора и увеличением оптической установки как при возбуждении (83 ×), так и при испускании (90 × = 60 × 1.5) дорожки. Номинально шаг пятна в образце, совпадающий с шагом детектора, составляет 5,5 мкм (500 мкм м / 90) в обоих направлениях, что приводит к шагу линзы LCOS-SLM 463 мкм (23,1 пикселя LCOS-SLM). Значение оптимизируется во время юстировки, чтобы соответствовать фактическому увеличению и оптическим аберрациям. При сохранении постоянного диаметра и шага линзы LCOS-SLM изменение фокусного расстояния линзы приводит к изменению числовой апертуры и, следовательно, размера пятна. Соотношение фокусных расстояний в двух LCOS-SLM (32 мм для красного и 36 мм для зеленого) выбрано для компенсации разницы в размерах PSF между длинами волн 532 нм и 628 нм.Обратите внимание, что изменение фокусного расстояния линзы требует изменения расстояния между L ₃ и LCOS-SLM, чтобы фокальная плоскость LCOS оставалась на фокусном расстоянии от L ₃ .

Рис. 11.

48-точечных гистограмм PAX E-S того же измерения, что и на рис. 10. Дополнительная фильтрация популяции D-only была выполнена с использованием критерия (см. Приложение D). Гистограмма E-S была построена путем объединения данных по всем точкам без коррекции для конкретных точек.Для получения дополнительных сведений см. Прилагаемый блокнот для 48-точечного PAX-анализа смеси 12 и 22 п.н. ⁴⁰ .

Рис. 12. Гистограмма

Multispot E-S, полученная за 5 секунд регистрации путем объединения пакетов из 46 активных точек. Дополнительные сведения см. В прилагаемой записной книжке для сравнения одной точки с 48 точками ⁴¹ .

Рис. 13. Гистограмма E-S для одного пятна

, полученная за 5 секунд сбора данных для того же образца, что и на рис. 12. Для получения более подробной информации см. Прилагаемую записную книжку для сравнения одного пятна с 48 точками ⁴¹ .

Область LCOS-SLM, окружающая шаблон 12x4, принимает свет, который может привести к паразитному возбуждению ": широкое поле" и, следовательно, к увеличению фонового сигнала. По этой причине мы заполняем неиспользуемую область LCOS-SLM шаблоном «управления лучом» (периодическим шаблоном в одном направлении), который дифрагирует падающий свет под углом по отношению к оптической оси. Такое «управление» гарантирует, что свет, не способствующий формированию многоточечного рисунка, не будет собираться задней апертурой линзы объектива.Кроме того, расширенный лазерный луч ограничивается двумя прямоугольными отверстиями (щелями) примерно на 1 мм больше, чем многоточечный рисунок, что еще больше уменьшает источники фона. Этот подход обеспечивает низкий фон без необходимости в дополнительном пространственном фильтре, который использовался в нашей предыдущей 8-точечной установке ¹⁶ .

Аналогичный подход для генерации множественных пятен был использован для мультиконфокальной FCS Kloster et al. ³³ . Принципиальным отличием их метода является использование гораздо большего фокусного расстояния LCOS для построения однофазной диаграммы для всех пятен (как суммы вкладов каждого отдельного пятна).Напротив, в нашем подходе разные части LCOS-SLM распределяются по разным точкам. Подробное экспериментальное сравнение, подчеркивающее относительную силу этих двух подходов, в настоящее время отсутствует.

Программное обеспечение для генерации многоточечного фазового шаблона, используемое в этой работе, доступно в репозитории lcos_multispot_pattern в исх. 25.

Приложение B: Юстировка лазера

Каждый из двух лазеров необходимо выровнять, чтобы обеспечить (a) максимальную однородность между интенсивностями пятна (b) минимальные аберрации по всему рисунку.Для достижения (а) гауссов лазерный луч расширяется так, что только центральная часть луча покрывает диаграмму возбуждения (которая имеет максимальное протяжение 5 мм). Для обеспечения (b) геометрический центр рисунка должен быть размещен на оптической оси.

Кроме того, (c) диаграмма возбуждения двух лазеров должна быть выровнена так, чтобы было максимальное перекрытие между объемами возбуждения D и A для каждого пятна.

1. Индивидуальная юстировка лазера

Расширители луча 3X имеют регулировочное кольцо, используемое для управления коллимацией луча.Простой способ обеспечить коллимацию луча - направить луч в микроскоп через дихроичное зеркало возбуждения, удалить внешнюю реколлимационную линзу L ₃ и линзу объектива, одновременно поместив зеркало на держатель образца и используя LCSO- SLM как зеркало, , т.е. , отображающее диаграмму постоянной фазы. Используя камеру на выходном порте микроскопа, мы регулируем коллимацию до тех пор, пока не образуется плотное пятно. После настройки коллимации каждый луч должен быть выровнен так, чтобы пиковая интенсивность находилась в центре оптической оси.С этой целью после снятия объектива для повторного коллимации L ₃ перед входом луча в боковой порт микроскопа помещается диафрагма I ₂ . При апертуре 1-2 мм только узкий луч проходит через объектив и генерирует пятно от отражения покровного стекла. Только когда входной луч параллелен оптической оси, пятно будет расположено в центре перекрестия в окуляре микроскопа. Чтобы входные лучи были параллельны оптической оси, последние зеркала перед микроскопом настраиваются ( M 2 _R для красного и DM _MIX для зеленого лазера).При изменении фокуса микроскопа мы получаем симметрично концентрические узоры только в том случае, если входной луч пересекается с оптической осью на задней апертуре линзы объектива. Поскольку направление уже зафиксировано, мы перемещаем диафрагму I ₂ , чтобы получить наиболее радиально-симметричный расфокусированный узор. Таким образом, луч, проходящий через I ₂ , совпадает с оптической осью микроскопа. Последний шаг включает перемещение входного луча без изменения его угла падения до тех пор, пока пик интенсивности не будет совмещен с центром диафрагмы.Чистый перенос достигается вращением двух зеркал в противоположных направлениях, так что начальный и конечный угол луча остается неизменным. Совмещение направления луча и диафрагмы необходимо повторять до схождения. После завершения оба луча параллельны и концентричны с оптической осью в хорошем приближении. При размещении L ₃ пятно формируется в другом положении фокусировки. L ₃ можно выровнять, убедившись, что это пятно расположено в том же положении, что и пятно, полученное без L ₃ .

2. Достижение перекрытия зеленого и красного узоров

Начиная с зеленого LCOS-SLM, мы проецируем многоточечный узор на высококонцентрированный раствор красителей Cy3B и ATTO647N (100 нМ - 1 мкМ). Использование квадратной сетки с нечетным количеством пятен на каждой стороне (например, 9x9) гарантирует, что одно пятно всегда будет в центре узора. Камера на боковом порте обнаруживает изображение узора. О центрировании рисунка относительно оптической оси можно судить по степени геометрических аберраций в боковых пятнах.Мы центрируем схему возбуждения, жестко перемещая ее на LCOS-SLM, так что геометрические аберрации примерно одинаковы на всех четырех сторонах. Затем мы выполняем двухмерную подгонку по Гауссу для каждого пятна и, исходя из распределения размера талии и угла наклона для каждого гаусса, мы оцениваем более точное положение оптической оси (для анализа см. Записную книжку подгонки шаблона LCOS ³⁴ ). . Этот шаг можно повторять несколько раз до схождения. С этого момента положения X и Y зеленого LCOS-SLM больше не меняются, и его центр становится точкой отсчета для положения оптической оси.

Затем мы активируем красный LCOS-SLM и проецируем многоточечный узор, возбуждаемый лазером с длиной волны 628 нм. Используя камеру, мы выравниваем красный узор с зеленым, используемым в качестве ориентира. Первоначальная грубая настройка красного шаблона LCOS-SLM выполняется вручную путем наблюдения диаграммы излучения на дисплее камеры в реальном времени. Затем центральное положение красного шаблона LCOS-SLM точно регулируется путем подгонки положений пятен на зеленом и красном изображениях (рис. 3), взятых отдельно (подробности реализации см. В блокноте подгонки шаблона LCOS ³⁴ ).

Наконец, чтобы уменьшить фон из-за немодулированного света, на пути перед каждым LCOS добавлены две специально изготовленные прямоугольные щели (алюминий с черным покрытием) ( S _R и S _G на рис.1). Щели выровнены так, чтобы освещать только рисунок 12 × 4 (± 1 мм) на LCOS-SLM (см. Приложение A1).

Приложение C: Выравнивание массивов SPAD

Оба детектора должны быть выровнены так, чтобы каждый пиксель был оптически сопряжен с соответствующим объемом возбуждения, т.е.е. возбуждение PSF. Цель состоит в том, чтобы иметь пары соответствующих пикселей на двух массивах, обнаруживающих фотоны из одного и того же объема образца, , то есть PSF обнаружения. В то же время, чтобы максимизировать сигнал, PSF детектирования должен быть концентричным с PSF возбуждения. Достижение этого с помощью двухмерного расположения пятен и пикселей требует не только выравнивания положения детекторов по осям X и Y, как при одноточечных измерениях, но также выравнивания относительного вращения двух SPAD и регулировки шага и поворота шаблона возбуждения. для оптимального соответствия геометрии детекторов.

Для выравнивания мы используем смесь красителей высокой концентрации (ATTO550, ATTO647N, ~ 500 нМ), возбуждаемую обоими лазерами. С таким образцом лазер с длиной волны 532 нм генерирует сигнал флуоресценции в обоих каналах D и A, в то время как лазер с длиной волны 628 нм генерирует сигнал только в канале A. На данный момент положение шаблонов возбуждения 532 нм и 628 нм на LCOS-SLM уже было зафиксировано, чтобы минимизировать геометрические аберрации, как описано в Приложении B. Следовательно, положение шаблона возбуждения используется в качестве ориентира для выравнивания Массивы SPAD.Tyndall et al. ⁵⁰ представили автоматическую процедуру для совмещения многоточечного рисунка LCOS-SLM с детектором. Здесь мы выравниваем SPAD по шаблону LCOS-SLM.

Начиная только с зеленым лазером, оба SPAD вручную позиционируются по X и Y, чтобы соответствовать центру шаблона возбуждения. Это достигается путем определения местоположения максимального зарегистрированного количества SPAD при перемещении детекторов.

Затем мы выполняем более автоматизированную процедуру точного выравнивания, называемую «сканирование нескольких точек».Многоточечное сканирование включает в себя жесткое преобразование многоточечного рисунка на LCOS-SLM (обычно точечный рисунок 4x4) дискретными шагами по двум ортогональным путям, образуя крест. В то же время счетчики из массива SPAD интегрируются для каждой позиции шаблона в течение 300 мс после каждого шага. Во время сканирования каждое пятно излучения рисует поперечный путь примерно с центром в пикселе SPAD. Типичное сканирование охватывает диапазон из 10 пикселей LCOS-SLM с размером шага 0,4 пикселя и выполняется последовательно по направлениям X и Y.Подсчеты, полученные в зависимости от положения LCOS-SLM, образуют профиль пика, который используется для оценки положений центров пикселей SPAD в координатах LCOS-SLM. Усредняя положение пикселей SPAD, мы получаем точную оценку для центра массива SPAD. В конечном итоге, эта процедура дает смещение каждого массива SPAD относительно идеального центра схемы возбуждения. Обладая этой информацией, мы перемещаем массивы SPAD в идеальное положение (X, Y) с помощью микропозиционеров с пьезоуправлением с программным управлением.Последовательность многоточечного сканирования и трансляции массива SPAD повторяется до схождения. Первоначально две матрицы SPAD выровнены относительно зеленого шаблона LCOS-SLM (532 нм). Затем положение красного шаблона LCOS-SLM (628 нм) точно настраивается, чтобы соответствовать положению массива A-SPAD (массив D-SPAD не обнаруживает никаких сигналов с возбуждением 628 нм). Оптимальное положение красного шаблона возбуждения определяется из многоточечного сканирования, выполняемого с помощью красного LCOS-SLM, в то время как счет производится с помощью массива A-SPAD, как описано ранее.После этого последнего шага фиксируются как красные, так и зеленые шаблоны возбуждения, а также положения массива D- и A-SPAD, завершая настройку настройки.

Вся процедура точной юстировки обычно выполняется в начале каждого дня измерений и длится около 30 минут. На рис. 14 показаны согласованные координаты после точного совмещения центрального набора пикселей 4 × 4 в массивах D и A-SPAD.

1. Вращение и регулировка шага

В предыдущем разделе мы описали общую процедуру точного выравнивания, повторяемую ежедневно при использовании многоточечной настройки.Однако при построении установки необходимы дополнительные шаги, чтобы (а) выровнять относительное вращение двух массивов SPAD, (б) определить лучший шаг по осям X и Y для зеленого и красного шаблонов возбуждения и (в) оптимизировать Положение SPAD по оптической оси (Z).

Для получения информации о вращении и шаге мы выполняем многоточечное сканирование, за которым следует дополнительный этап анализа. В частности, набор положений (X, Y) каждого пикселя SPAD, полученный в результате сканирования, соответствует прямоугольной сетке.Параметры подобранной сетки: центральное положение, шаг по оси X, шаг по оси Y и угол поворота. Каждый массив SPAD, как правило, имеет различный набор подобранных параметров.

Чтобы отрегулировать угол поворота, один из массивов SPAD (D) вращается вокруг оптической оси, чтобы соответствовать углу второго SPAD, где угол поворота каждого SPAD получается из результатов сканирования. Как только ориентации двух массивов SPAD совпадают, этап вращения блокируется, обеспечивая долгосрочную стабильность угла поворота.

Для настройки высоты тона информация из подгонок сканирования используется для точной настройки шага X и Y шаблона LCOS-SLM для оптимального согласования обоих массивов SPAD. Остаточная разница шага по осям X и Y 1-2% наблюдается из-за неидеальности, , т.е. стигматизмов в оптическом пути.

Приложение D: ALEX и PAX

В ALEX два временных окна чередования, D _ex и A _ex (соответственно окно возбуждения D или A) и два детектора (D и А) задействованы.В результате будут отмечены четыре потока фотонов D _ex D _em , D _ex A _em , , A D _em , A _ex A _em , где первая буква обозначает период возбуждения, а вторая - канал обнаружения.Поток A _ex D _em содержит только фон, поскольку флуоресцентное излучение в D-спектральной полосе во время возбуждения A-лазера отсутствует, и поэтому игнорируется. Для простоты ниже мы предполагаем, что все величины были скорректированы с учетом фона ³⁶ .

Рис. 14.

Экспериментальные координаты пикселей SPAD после точного согласования для массивов D-SPAD и A-SPAD, полученные при сканировании зеленого LCOS-SLM.Центральные положения D-SPAD обозначены «X», а центральные положения A-SPAD обозначены «+». Среднее расстояние между пикселями D- и A-SPAD составляет 2,3 мкм. Подробную информацию см. В прилагаемой записной книжке для выравнивания SPAD ³⁴ .

Установка PAX имеет два детектора (D и A), но только один чередующийся лазер (A). Как и в ALEX, могут быть определены два временных окна чередования: D _ex , соответствующий интервалу, в течение которого включен только D-лазер, и DA _ex , когда включены оба лазера.Как и раньше, это приводит к четырем фотонным потокам, отмеченным D _ex D _em , D _ex A _{em 9000} , DA D _em , DA _ex A _em . Формально единственная разница с ALEX заключается в том, что A _ex в ALEX заменяется на DA _ex .Однако в PAX все четыре потока фотонов содержат флуоресцентный сигнал. В частности, DA _ex D _em содержит D-флуоресценцию из-за возбуждения D-лазером (соответствующий термин в ALEX, A _ex D em _em , содержит только фон). С помощью этого обозначения мы можем определить общий сигнал флуоресценции во время D-возбуждения (действительный как для ALEX, так и для PAX) как: где величины F - это количество фотонов с поправкой на фон. F _{F RET} - это обнаруженная акцепторная флуоресценция из-за FRET, вычисленная путем вычитания D-утечки в акцепторных каналах ( Lk ) и A-прямого возбуждения A-лазером ( Dir ) ²⁴ :

Еще нам понадобятся обычные поправочные коэффициенты и γ и β ²⁴ : где ϕ _A , ϕ _D - квантовые выходы акцептора и донора, а, - эффективности регистрации сигналов D и A в каналах D и A.В ур. D4, и - интенсивности A- и D-возбуждения, а и - сечения поглощения красителя на соответствующих длинах волн лазера. β учитывает разницу в скоростях возбуждения красителей D и A, когда каждый краситель возбуждается соответствующим лазером.

Мы можем определить полный сигнал с поправкой на γ при D-возбуждении как ^24,51 :

При этих определениях коэффициент близости E _PR и эффективность FRET E задаются следующим выражением, действительным как для ALEX, так и для PAX:

Напротив, выражение для отношения стехиометрии S немного отличается для ALEX и PAX.В ALEX S и его исправленная версия S _γβ определяются как:

Значение S _γβ всегда центрируется около 0,5 для двухкомпонентных частиц, независимо от эффективности FRET или интенсивностей D- и A-возбуждения.

В PAX нет такого сигнала как. Однако, когда период чередования достаточно короткий, чтобы предположить, что интенсивность возбуждения не меняется от одного интервала к другому (что обычно и имеет место), эквивалентная величина может быть вычислена путем вычитания вклада D-возбуждения в: где w _A и w _D - длительности периодов возбуждения DA _ex и D _ex соответственно.Обычно периоды чередования имеют одинаковую продолжительность (, т.е. рабочий цикл = 0,5) и Вт _A / Вт _D = 1. Выражения для S и S _γβ , определенный для ALEX (ур. D8 и D9), затем можно использовать для PAX с заменой на:

Так как в экспериментах PAX ​​D-возбуждение всегда включено, мы можем использовать сигнал in для улучшения статистики фотонов. Чтобы получить модифицированный набор выражений PAX для E и S , мы начнем с определения «модифицированного» общего сигнала FRET как: где - рабочий цикл D _ex (обычно w _A = w _D и α = 0.5). Коэффициент α ^-1 усиливает сигнал F _{F RET} для компенсации дополнительного донорного сигнала.

На основе ур. D13 и D14, мы можем написать модифицированные выражения PAX для E и S :

Ур. D15, D16, D17 и D18 содержат больше фотонов, чем классические выражения, и, следовательно, могут привести к более низкому дробовому шуму. Однако этот эффект смягчается тем фактом, что F _{F RET} умножается на α ^-1 , чтобы компенсировать дополнительный сигнал D, и, следовательно, его дробовой шум усиливается.

1. Модифицированная стехиометрия

Путем замены на в ур. D11, модифицированная или «нескорректированная стехиометрия» S _u может быть определена: Это выражение позволяет избежать вычитания отсчетов из (операции, которая суммирует статистический шум этих двух величин), тем самым улучшая общую дисперсию логометрической величины S _u . В результате распределения Su более узкие, что упрощает разделение популяции FRET и только D.Однако обратите внимание, что Su имеет встроенную зависимость от значения FRET популяции, в частности S _u уменьшается с увеличением E . В этой работе даже при низких значениях FRET лучшее разделение между FRET и популяцией только D было достигнуто с использованием S _u вместо S . В общем, преимущество S _и перед S может измениться в других ситуациях, особенно когда отношения сигнал-шум и сигнал-фон большие.Как только популяции разделены на гистограмме E - S _и , можно использовать классическое выражение S (уравнение D11) для вычисления гамма-фактора, как описано в исх. 24. В этой работе не было предпринято никаких попыток восстановить точные значения FRET и расстояния D-A, поэтому калибровка гамма-фактора не проводилась. Тем не менее, мы обращаемся к проблеме различий в эффективности сбора и обнаружения в разных точках, которые могут повлиять на такую ​​калибровку, в Разделе E.

Приложение E: Индивидуальные точечные поправки

1.Гамма-коррекция

Гамма-фактор каждого пятна, γ _sp , может быть выражен как произведение среднего коэффициента γ _м и поправочного коэффициента для конкретного пятна χ _sp : χ _sp можно легко вычислить из измеримых величин в соответствии со следующим выражением:

В ур. E2, E _{PR, sp} - коэффициент близости подгруппы населения, измеренный в определенном месте, а ⟨ E _{PR, sp} ⟩ _N - среднее значение по всем N точек (здесь N = 48).

Ур. E2 следует из следующего соотношения между E и E _PR ^24,51 :

Решение ур. E3 для γ , получаем:

Формально мы можем записать γ = γ ₁ γ ₂ , где γ ₁ связано с частично скорректированным коэффициентом близости E ₁ следующим образом:

Запись γ ₁ как функция от E ₁ как в ур.E4 и подставив выражение в ур. E3, получаем E как функцию от E ₁ :

Ур. E6 имеет ту же форму, что и E3 и E6. Следовательно, E может быть получен двумя последовательными (связанными) поправками для γ ₁ и γ ₂ соответственно, как в уравнении. E7.

В случае с несколькими точками мы применяем это свойство, чтобы разложить гамма-коррекцию на коррекцию, специфичную для точки, и среднюю коррекцию, как в E1.В частности, ур. E2 напрямую происходит от E4 с простыми заменами.

Приложение F: Дополнительные данные

На рис.15 показаны гистограммы E _PR - S _u для различных каналов, полученные во время измерения образца ДНК 22d (низкий FRET). Из-за выбора мощности возбуждения донора и акцептора во время этого измерения, популяция FRET имеет значение S _и > 0.5, искусственно сжимая гистограммы в верхней части графика. Тем не менее, все еще возможно отличить FRET от пакетов только D, несмотря на низкое значение E _PR для этой выборки, что позволяет объективно оценить E _PR , в отличие от того, что произошло бы в отсутствие акцепторного возбуждения ¹⁶ .

Рисунок 15.

E _PR в сравнении с S _u гистограммы всех пятен для образца 22d дцДНК.Анализ данных и поиск пакетов идентичны показанным на рисунке 6. Поиск пакетов был выполнен с использованием всех фотонов с постоянным порогом (50 kcps). Выбор пакета был выполнен по общему размеру пакета после коррекции фона с использованием порога в 40 фотонов. В легенде на каждом подзаголовке указывается номер пятна в скобках и количество всплесков (B). Дополнительные сведения см. В прилагаемой записной книжке для анализа PAX на 48 точек ⁵² .

Сноски

• ↵a) Электронная почта: ingargiola.antonino {at} gmail.com

• ↵b) Электронная почта: michalet {at} chem.ucla.edu

Jeep Compass Цена - изображения, цвета и обзоры

Двигатель и рабочие характеристики

Есть два двигателя в предложении для линейки Compass. Бензиновый диапазон может быть оснащен 1,4-литровым бензиновым двигателем FCA Multiair мощностью 163 л.с. / 240 Нм и может быть оснащен либо шестиступенчатой ​​механической коробкой передач, либо семиступенчатой ​​коробкой передач DCT. Автомобиль, который мы ведем, оснащен 2,0-литровым дизельным двигателем Multijet мощностью 170 л.с. / 350 Нм и может быть оснащен шестиступенчатой ​​механической коробкой передач или девятиступенчатой ​​АКПП в сочетании с системой Jeep Active Drive 4X4.

Эта совместимая с BS6 мельница была перенесена с предыдущей машины и в нашем случае была соединена с девятиступенчатым АКПП с системой 4X4. После запуска двигатель переходит в гравийный ритм с заметным грохотом внутри кабины. На ходу это довольно слышно, и вы чувствуете определенную вибрацию на рулевом управлении и приборной панели. Девятиступенчатая коробка передач, обеспечивая вам эффективное вождение, медленно реагирует с заметной задержкой между нажатием на дроссель и переключением на пониженную передачу, что позволяет вам набрать скорость и выполнить обгон.Это опыт вождения, когда вам нужно заранее планировать свои движения и добиваться прогресса, используя набранный импульс.

Однако, как только вы попадаете в трехзначную область, коробка с девятью скоростями вступает в свои права, и вы можете путешествовать по шоссе, не нагружая двигатель, что делает его способным туристом, если вам нужно преодолевать большие расстояния.

Ходовые качества и управляемость

В отношении плавности хода и управляемости в передней части ничего особенного не изменилось по сравнению с предыдущей машиной. Компас опирается на стойки McPherson спереди и многорычажную установку сзади.Езда более жесткая, но никоим образом не вызывает дискомфорта. Фактически, Jeep удалось найти хороший баланс между плавностью хода и управляемостью, поскольку Compass способен сглаживать практически все на своем пути, и только когда вы проезжаете выбоины с зазубренными краями и неровности, вы замечаете твердость в движении. ходовые качества. Несмотря на большой дорожный просвет, все же следует опасаться низкой носовой части и элемента делителя воздуха.

Что касается управляемости, то реакция Compass предсказуема.Рулевое управление кажется тяжелым, но это обнадеживает, учитывая размер этого автомобиля. Вы получаете некоторый крен кузова в поворотах, учитывая высокий центр тяжести, но это предсказуемо. Учитывая немного медленный характер коробки передач, лучше тормозить раньше и загружать автомобиль перед тем, как войти в поворот. Наконец, вам нужно 2,5 оборота, чтобы перейти от упора до упора, что делает такие задачи, как развороты и параллельная парковка, легкой задачей.

У нас не было возможности протестировать систему 4X4, но поскольку она не изменилась по сравнению с предыдущей моделью, вы можете найти ссылки на истории здесь.

Внутреннее пространство и качество

Внешний вид, возможно, не претерпел значительных обновлений, но это совсем другая история в салоне. Jeep полностью изменил интерьер, сделав его более роскошным и утонченным. Схема «бежевый поверх черного» была заменена полностью черной, и появилась новая приборная панель, информационно-развлекательный экран, комбинация приборов, а также рулевое управление.

Многослойная приборная панель дополнена кожаными вставками, а также большой хромированной полосой, идущей из конца в конец.Фактически, чтобы повысить привлекательность салона, есть хромированные вставки в рулевом колесе, рычаге переключения передач, вокруг органов управления и большая красивая рамка вокруг экрана информационно-развлекательной системы. Более того, есть полосы глянцевого черного цвета, которые контрастируют с хромированными вставками и добавляют привлекательности премиум-класса. Разумеется, черный глянец означает, что вам придется регулярно сталкиваться с отпечатками пальцев и видимыми частицами пыли.

Дизайн рулевого управления является новым, как и эта полностью цифровая приборная панель, яркая, наполненная классной современной графикой в ​​стиле фанк и обеспечивающая быстрый и легкий доступ к огромному количеству информации.

Однако изюминкой передних сидений, конечно же, является массивный 10,1-дюймовый плавающий дисплей. Он работает на новейшей системе Jeep UConnect. Это HD-дисплей с четкой и четкой графикой. Вы получаете беспроводные Apple CarPlay и Android Auto, функцию камеры с обзором на 360 градусов и даже голосовые команды для работы в режиме громкой связи.

Более того, вы получаете множество технологий для подключенных автомобилей, онлайн-обновления программного обеспечения и даже специальное приложение Jeep, как это стало у любого производителя, предлагающего в настоящее время такую ​​систему.

Что касается размеров, Compass остался без изменений, поэтому вы получаете такое же пространство сзади, как и в модели с предварительной подтяжкой лица. Это означает, что отличное пространство для ног и широкое сиденье были перенесены, что сделало это место довольно комфортным. Вы сидите немного выше по сравнению с передними сиденьями, но это неплохое место для сидения. Здесь есть вентиляционные отверстия, USB-разъем для зарядки, 1,0-литровые держатели для бутылок и крючки для одежды.

Заднее пространство - довольно выгодное предложение для большинства фасадов, за исключением плечевого пространства.Удобно путешествовать вдвоем, но будет немного затруднительно, если вы хотите комфортно поместиться в трех взрослых здоровых размеров. Объем багажного отделения объемом 438 литров является стандартным для сегмента и может вместить несколько сумок, которые, конечно же, могут быть расширены с помощью механизма раздельного складывания 60:40 для дополнительной практичности.

Характеристики и безопасность

Наряду с радикально обновленным интерьером, Jeep также значительно обновил список функций этого обновленного компаса.Вы уже видели двухзонную систему климат-контроля, сенсорную информационно-развлекательную систему с 10,1-дюймовым дисплеем и полностью цифровую комбинацию приборов. В дополнение к этому, Jeep также оснастил эту топовую модель 360-градусной камерой с системой помощи при парковке, беспроводной зарядкой, вентилируемыми сиденьями, двойным люком на крыше, сиденьем водителя с электроприводом с восьмиступенчатой ​​регулировкой, а также сиденьем с памятью и пассажирским сиденьем с восемью. электрическая регулировка.

Что касается безопасности, то все версии оснащены двумя передними подушками безопасности, ABS с EBD, ESC, точками крепления детских сидений ISOFIX и системой помощи при трогании с горы.В этой модели S также есть боковые подушки безопасности, боковые подушки безопасности, система контроля давления в шинах, а также контроль удержания и спуска на подъеме для моделей с поддержкой 4X4.

Цены и заключение

Как мы уже говорили в вердикте, механический пакет был рассортирован, но интерьер и перечень функций не впечатляли для автомобиля в этом сегменте. Jeep решил эту проблему в этом обновлении, и это действительно повлияло на привлекательность автомобиля. Это самый дорогой автомобиль в своем сегменте, но он также занимает достойное место благодаря значкам и наследию.

Диапазон Jeep Compass начинается с 19,75 рупий до 33,61 рупий (на дороге, Дели) для этой дизельной модели S 4X4 AT, которую мы рассмотрели в этой статье. Это конкурент Hyundai Tucson, Skoda Karoq и Volkswagen T-ROC. Что касается более крупных автомобилей, он также является конкурентом MG Hector Plus и Tata Safari.

Фотография: Капил Ангане и Каустубх Ганди

Повышение качества, воспроизводимости и удобства использования датчиков натяжения на основе FRET - Gates - 2019 - Цитометрия, часть A

Влияние механической силы на поведение клеток - новая область исследований который вызвал значительный интерес со стороны различных дисциплин, включая клеточную биологию, биофизику, биологию рака, биологию сосудов и тканевую инженерию 1-3.Исследователей часто интересует определение того, какие белки являются ключевыми для путей механотрансдукции и как эти белки передают и / или обнаруживают механические сигналы 4-6. Исследования в этой области в основном сосредоточены на двух структурах адгезии, а именно на фокальных адгезиях (FA) и адгезионных соединениях (AJs), потому что они служат связями между генерирующей силу актомиозиновой сетью клетки и внеклеточной средой 4-6. В то время как FAs связываются с белками внеклеточного матрикса, AJs прикрепляются к рецепторам на соседних клеточных мембранах 7.Обе структуры включают сотни различных типов белков и проявляют механочувствительность, что означает, что они чувствуют и реагируют на изменения механической нагрузки 4-6.

Одним из инструментов для изучения механической нагрузки на белки является датчик натяжения на основе резонансной передачи энергии Ферстера (FRET), который позволяет измерять силы молекулярного масштаба на основе изменений излучаемого света 4, 8-13. Первый откалиброванный, генетически кодируемый датчик натяжения на основе FRET был разработан для изучения винкулина 14, механического линкерного белка, который локализуется в обеих адгезионных структурах, и подтвердил важность винкулина в механочувствительности и миграции 14-19.С тех пор датчики натяжения на основе FRET были легко адаптированы и сконструированы как минимум в 14 различных протеинах 8, демонстрируя полезность и важность этого инструмента.

В связи с широким применением датчиков натяжения к различным белкам и системам были обнаружены некоторые противоречивые данные, и было отмечено отсутствие четких стандартов точности и воспроизводимости этих измерений. В частности, было продемонстрировано, что E-cadherin находится под конститутивной нагрузкой в ​​клетках Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 20 и также обнаруживает пространственные градиенты в мигрирующих Drosophila melanogaster пограничных клетках 21.Другое исследование, однако, не обнаружило какой-либо нагрузки E-cadherin в тканях D. melanogaster 22, что заставило авторов усомниться в воспроизводимости измерений, сделанных с помощью модулей измерения натяжения. В этой работе мы разрабатываем набор подходов как для определения, так и для увеличения пределов точности датчика натяжения на основе FRET для решения этих проблем.

FRET включает безызлучательную передачу энергии от донорного флуорофора в возбужденном состоянии к ближайшему акцепторному флуорофору (расстояние между ними <10-12 нм) в основном состоянии 23.FRET увеличивается по мере уменьшения расстояния между двумя флуорофорами. Как правило, FRET количественно оценивается одним из двух способов, используя индекс FRET или эффективность FRET 24, 25. Индексы FRET имеют множество определений, но обычно представляют собой полуколичественные оценки сенсибилизированной эмиссии акцепторного флуорофора из-за возбуждения донорного флуорофора. 26. Это относительные измерения, которые зависят от устройства и установки, но обычно масштабируются с изменениями FRET для одноцепочечных датчиков, содержащих функциональные флуорофоры 26.Для большинства одноцепочечных биосенсоров на основе FRET, таких как биосенсоры на основе активности или конформационные биосенсоры, абсолютное расстояние между флуорофорами представляет меньший интерес, чем относительное изменение сигнала FRET внутри клеток или в ответ на специфические обработки 27-29. В этих случаях индекс FRET часто является подходящей метрикой для измерения относительной величины и динамики взаимодействий внутри одной ячейки 30. В качестве альтернативы, эффективность FRET - это физическая количественная оценка доли событий возбуждения донора, которые передают энергию акцепторному флуорофору 23.Это независимое от устройства абсолютное измерение, которое напрямую связано с расстоянием разделения флуорофоров, а также с их ориентацией и динамикой вращения в некоторых случаях 31.

В датчиках натяжения на основе FRET физическое разделение флуорофоров является ключевой переменной. В этих датчиках два флуорофора, способных к FRET, соединены деформируемым элементом и затем вставлены между несущими доменами белка, чтобы обеспечить измерение сил, передаваемых через датчик 10, 32.В отсутствие нагрузки линкер имеет ожидаемую характеристическую длину покоя, которая зависит от гибкости линкера 33, и ожидается, что пара флуорофоров будет демонстрировать соответствующую характеристическую FRET. При приложении нагрузки линкер растягивается, FRET уменьшается, и приложение нагрузки можно определить по сигналу FRET. В то время как индексы FRET могут использоваться для количественной оценки этих относительных изменений 20, 34, определение нагрузок требует измерения эффективности FRET 23. Определение нагрузки также требует калибровки датчика, что означает взаимосвязь между приложенной нагрузкой и эффективностью FRET. были измерены или смоделированы 14, 33.Хотя существует множество инструментов для измерения эффективности FRET, они, как правило, дороги или требуют расширенной калибровки по сравнению с инструментами для измерения индекса FRET 35, 36. Кроме того, могут быть другие недостатки, связанные с инструментами, необходимыми для измерения эффективности FRET 37. Например, некоторые методы, такие как микроскопия для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM) или спектральная визуализация, включают мощные лазеры и менее чувствительные детекторы, которые ограничивают как пространственное, так и временное разрешение датчиков на основе FRET 25, 38, 39.

Подходящей, но не часто используемой альтернативой является определение эффективности FRET с использованием сенсибилизированной эмиссионной визуализации 36, 40. Как и измерения индекса FRET, эти подходы быстрые, чувствительные и могут выполняться на большинстве стандартных широкопольных или конфокальных микроскопов. По сравнению с FLIM и спектральной визуализацией этот подход относительно недорог, доступен и имеет большее пространственно-временное разрешение. Благодаря высокому разрешению этого подхода, пространственные градиенты белковой нагрузки могут быть визуализированы внутри клетки и субклеточных структур 33, 41.Однако методы сенсибилизированного излучения требуют дополнительных этапов калибровки, включая поправки на спектральные прохождения и определение двух констант 11, 25, 26, 36, зависящих от устройства и настроек. Кроме того, ранее было продемонстрировано, что сложные подходы, включающие такие численные методы, как оценка максимального правдоподобия, необходимы для точных оценок эффективности FRET в пределе низкого сигнала до шума 42. В результате сложности, связанные с этими этапами, часто отговаривали исследователей от использования сенсибилизированного излучения в качестве метода определения эффективности FRET, несмотря на его преимущества перед другими вариантами.

Чтобы уменьшить проблемы и повысить точность измерений натяжения на основе FRET, выполненных с использованием сенсибилизированного излучения, мы описываем простой и точный численный метод оценки двух критических калибровочных констант. Кроме того, для измерений с относительно высоким отношением сигнал / шум (например, эксперименты, не проводимые с помощью методов, основанных на подсчете фотонов), мы разрабатываем улучшенный численный подход для характеристики эффективности FRET для каждой ячейки и проверяем этот метод, исследуя, действительно ли функция нарушения фиксации, проницаемости или иммунной метки модуля датчика натяжения.Используя оригинальный датчик напряжения винкулина (VinTS) в качестве примера, мы обнаружили, что эти методы лечения не влияют на функцию этого датчика, демонстрируя, что датчики напряжения на основе FRET можно комбинировать с методами иммунофлуоресценции. Кроме того, мы показываем, что наш численный подход позволяет обнаруживать небольшие различия в эффективности FRET между двумя похожими, но структурно отличными конструкциями FRET, четко демонстрируя, что один из них является предпочтительным. Наконец, мы демонстрируем руководящие принципы, которые устанавливают неопределенность в измерениях эффективности FRET, связанную с заданным размером выборки, что дает возможность априорных оценок для экспериментального дизайна в будущей работе.Вместе эти данные подтверждают полезность нашего численного подхода и подтверждают, что датчики натяжения на основе FRET являются надежными индикаторами механических нагрузок, испытываемых белками в живых клетках.

Материалы и методы

Создание конструкций ДНК

Создание pcDNA3.1-VinTS, pcDNA3.1-VinTS-I997A, pcDNA3.1-TSMod, pcDNA3.1-VinVenus A206K internal, pcDNA3.1-VinmTFP1 internal и pcDNA3.1-mTFP1-2x (GGSGGS) - Конструкции временной экспрессии Venus были описаны ранее 14, 33, 41, 43.Чтобы создать дополнительные контрольные конструкции для обнаружения присутствия межмолекулярного FRET, были созданы темные мутанты pcDNA3.1-VinTS из pcDNA3.1-VinTS в соответствии с ранее описанными методами 44. В частности, темный mTFP1 и темный Venus A206K были созданы путем мутации либо Y71 или Y66 соответственно к лейцину. Подходящие праймеры перечислены в вспомогательной информационной таблице 1. Для создания конструкции с низким FRET, полезной в подходах к калибровке 36, pcDNA3.1 mTFP1-TRAF-Venus была сконструирована с использованием сборки Гибсона.В частности, скелет вектора, содержащий флуоресцентные белки mTFP1 и Venus A206K, был получен из pcDNA3.1-TSMod, а домен фактора, ассоциированного с рецептором TNFα (TRAF), был выделен из CTV (Addgene # 27803) 45. Праймеры, используемые для сборки pcDNA3.1 mTFP1 -TRAF-Venus в реакции сборки Гибсона с тремя фрагментами подробно описаны в вспомогательной информационной таблице 2. Для создания плазмид, подходящих для лентивируса, плазмиды pcDNA расщепляли NruI / XbaI и лигировали в вектор pRRL, который был расщеплен EcoRV / XbaI.

Культура клеток и экспрессия конструкций ДНК

Эмбриональные фибробласты мыши, лишенные винкулина (винкулин - / - MEF), были щедро предоставлены доктором. Бен Фабри, Вольфганг Голдман и Вольфганг Зиглер 46. Все линии MEF поддерживали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко с высоким содержанием глюкозы (D6429; Sigma Aldrich), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone), заменимых аминокислот (Gibco) и антибиотиков. антимикотический раствор (Sigma Aldrich).Клетки HEK293-T, используемые для продуцирования вирусов, поддерживались в среде Игла, модифицированной по Дульбекко с высоким содержанием глюкозы, с L-глутамином и бикарбонатом натрия (D5796; Sigma Aldrich) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone) и раствора антибиотика-антимикотика (Sigma Aldrich). ). Временная трансфекция конструкций экспрессии млекопитающих (pcDNA3.1) была достигнута с использованием реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen) и OptiMEM (Gibco) в соответствии с протоколом производителя. Конструкции ДНК вводили в винкулин - / - MEF с использованием стандартных подходов лентивирусной трансдукции и отбирали клетки, экспрессирующие физиологические уровни каждого сенсора на основе винкулина, как сообщалось ранее 41, 43.

Для создания поверхностей, прилипающих к клеткам, подходящих для визуализации, чашки со стеклянным дном (World Precision Instruments) инкубировали с 10 мкг / мл фибронектина (Fisher Scientific) в PBS при 4 ° C в течение ночи. Посуду один раз ополаскивали PBS перед посевом клеток. MEF засевали по 25000 клеток на чашку. Для получения изображений в реальном времени клетки распределяли в среде для культивирования на 2 часа, а затем переводили на среду для визуализации (среда 199, Gibco) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone) еще на 2 часа.В фиксированных условиях клетки размазывались в полной среде в течение 4 ч, а затем фиксировались, как описано ниже.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Для иммунофлуоресцентного мечения клетки фиксировали 4% параформальдегидом без метанола марки EM (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) в течение 10 мин, а затем промывали PBS перед пермеабилизацией. Клетки обрабатывали 0,1% тритоном-X в течение 5 мин, а затем промывали PBS. Свежий 2% бычий сывороточный альбумин (BSA, Sigma Aldrich) в PBS использовали в качестве блокирующего буфера на 30 мин.Первичное антитело винкулина (Sigma V9131, 1: 500 в блокирующем буфере) наносили на 60 мин, а затем трижды промывали PBS. Клетки снова блокировали на 30 мин. Вторичные антитела (Thermo Fisher, козьи антимышиные антитела AlexaFluor 647, разведенные 1: 500 в блокирующем буфере) применяли на 60 мин. Затем клетки трижды промывали PBS. Клетки были визуализированы в PBS.

Изображения

Инвертированный флуоресцентный микроскоп Olympus (Olympus IX83, Токио, Япония) использовался для получения изображений образцов.Изображения получали при 60-кратном увеличении (объектив UPlanSApo 60X / NA1.35, Olympus) и освещали LambdaLS, оснащенным ксеноновой лампой без озона мощностью 300 Вт (Sutter Instrument, Новато, Калифорния). Изображения были получены с помощью камеры sCMOS ORCA-Flash5.0 V2 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Изображения FRET были получены с использованием настраиваемого набора фильтров, состоящего из фильтра возбуждения mTFP1 (ET450 / 30x; Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT), одного из двух фильтров излучения mTFP1 (ET485 / 20 нм; Chroma Technology Corp или FF02-485). / 20-25, Semrock, Rochester, NY), фильтр возбуждения Venus (ET514 / 10x; Chroma Technology Corp), фильтр излучения Venus (FF01-571 / 72; Semrock) и дихроичное зеркало (T450 / 514rpc; Chroma Technology Corp) .Для сенсибилизированной эмиссионной микроскопии FRET получают три изображения для расчета эффективности 25 FRET. Они включают отображение акцептора (возбуждение Венеры, испускание Венеры), FRET (возбуждение mTFP1, испускание Венеры) и донора (возбуждение mTFP1, испускание mTFP1). Мы отмечаем, что живые и фиксированные условия, а также два фильтра выбросов mTFP1 дали разные оценки G и k . Для каждой экспериментальной установки во время анализа использовались соответствующие калибровочные коэффициенты, и наблюдались эквивалентные измерения эффективности FRET.Для визуализации AlexaFluor 647 мы использовали фильтры Cy5 из набора фильтров DA / FI / TR / Cy5-4X4 M-C Brightline Sedat (Semrock) и соответствующее дихроичное зеркало (FF410 / 504/582/669-Di01). Время экспозиции для изображений Венеры, Чирок-Венеры FRET, Чирок и Cy5 составляло 1000 мс, 1500 мс, 1500 мс и 1000 мс соответственно. Моторизованные колеса фильтра (Lambda 10-3; Sutter Instrument), автоматизированный столик (h217EIX3; Prior Scientific, Rockland, MA) и получение изображений контролировались с помощью программного обеспечения MetaMorph Advanced (Olympus).Для визуализации живых клеток в образце поддерживалась постоянная температура с использованием нагревателя объектива (Bioptechs, Butler, PA 150819-13) в сочетании с нагревателем предметного столика и крышки (Bioptechs Stable Z System 403-1926). Живые образцы снимали не более 1 ч.

Коррекция артефактов изображения и определение спектральных просвечиваний

Артефакты изображения были идентифицированы и исправлены, как описано ранее. 11. Для измерения темнового тока было получено примерно 40 изображений и усреднено в каждом канале со всеми закрытыми заслонками.Чтобы исправить неравномерное освещение, было сделано примерно 10 изображений для каждого канала на участках чашки без клеток или на отдельной бесклеточной чашке. Бесклеточные чашки обрабатывали так же, как экспериментальную чашку, и отображали их в той же фокальной плоскости. Оттенки изображений определялись путем нормализации по максимальной интенсивности каждого изображения и усреднения по стопке нормализованных изображений. Поскольку клетки были покрыты редким слоем, интенсивность фона каждого изображения определялась путем оценки интенсивности пикселей режима каждого изображения с учетом поправок на темновой ток и неравномерное освещение.Для коррекции трехмерных смещений, вызванных хроматическими аберрациями и мельчайшими смещениями оборудования, микросферы диаметром 500 нм (Fluoresbrite YG и TetraSpeck), разведенные в PBS, инкубировали на чашках со стеклянным дном в течение ночи, чтобы обеспечить испарение. После адсорбции чашки трижды промывали в PBS и отображали в PBS. После выравнивания чашки в держателе предметного столика были получены Z-стопки из 21 изображения (размер шага 100 нм). Для гранул Fluoresbrite YG были визуализированы донорские каналы и каналы FRET. Для шариков TetraSpeck были визуализированы акцепторные каналы и каналы FRET.Для каждого типа бусинок было получено примерно 10 стопок. Специальное программное обеспечение MATLAB (Mathworks) использовалось для выполнения трехмерной регистрации каналов.

Для измерения спектрального просачивания винкулин - / - MEF трансфицировали либо растворимым mTFP1, либо Венерой и отображали в акцепторе, FRET и доноре. Перед оценкой проступания все изображения были скорректированы на аномалии из-за темнового тока, неравномерного освещения, интенсивности фона и хроматических аберраций, как описано выше и в другом месте 11.Просачивание донора (dbt) - это количество донорного излучения, захваченного в канале FRET, а перекрестные помехи - это количество донора, возбужденного и захваченного путем визуализации акцепторного канала. Просачивание акцептора (abt) - это количество акцептора, непосредственно возбуждаемое во время визуализации FRET, а перекрестные помехи - это количество акцептора, возбужденного и захваченного путем визуализации донорного канала. В нашей системе просачивание не зависит от интенсивности, а перекрестные помехи между каналами незначительны. Чтобы определить abt, пиксели одинаковой интенсивности акцептора были разделены для каждой конструкции, и соответствующие пиксели интенсивности FRET для каждого элемента были усреднены.Затем была построена линейная кривая для соотношения между средней интенсивностью FRET и интенсивностью акцептора. Наклон этой аппроксимации дает оценку ок. Та же процедура была использована для расчета dbt.

Расчет эффективности FRET по чувствительным выбросам

FRET был обнаружен посредством измерения сенсибилизированного излучения 36 и рассчитан с использованием специально написанного кода в MATLAB 11. Все анализы проводились на попиксельной основе. Перед анализом все изображения были скорректированы на темновой ток, неравномерное освещение, интенсивность фона и хроматическую аберрацию, как описано в предыдущем разделе.Для коррекции спектрального просвечивания экспериментальных данных попиксельная коррекция FRET выполнялась в соответствии с уравнением: (1) где F _c - исправленное изображение FRET, I _f - интенсивность в FRET-канале, I _dd - интенсивность в донорном канале, а I _aa - интенсивность в акцепторном канале.Посредством визуализации слитых конструкций донор-акцептор с различной, но постоянной эффективностью FRET можно вычислить две константы пропорциональности, которые позволяют рассчитать эффективности FRET для любого одноцепочечного биосенсора 36. Коэффициент G рассчитывается как: (2) где Δ указывает на изменение между двумя донорно-акцепторными слитыми белками. Коэффициент k рассчитывается как (3) С помощью этих двух констант пропорциональности можно рассчитать как эффективность FRET ( E ), так и относительную концентрацию донорных и акцепторных флуоресцентных белков в образце: (4) (5)

Для эмпирического расчета фактора G , распределения нормированного по акцепторам скорректированного FRET ( F _c / I _aa ) и нормированного по акцептору донора ( I _dd / I ) были скомпилированы из всех пикселей для каждой конструкции (2x (GGSGGS) и TRAF) для одного эксперимента.Соответствующие пиксели были выделены путем ручного маскирования ячеек. Среднее значение, медиана и мода F _c / I _aa по сравнению с I _dd / I _aa были определены для 2x (GGSGGS) и TRAF. Коэффициент G был рассчитан как наклон линии, соединяющей каждый набор точек, который вытекает из уравнения. 2. Один день визуализации 2x (GGSGGS) и TRAF дает единую оценку фактора G , и в общей сложности было проведено четыре независимых эксперимента.Данные четырех независимых экспериментов также использовались для оценки фактора k , как определено в формуле. 3. Фактор k вычислялся попиксельно, и было составлено распределение пикселей для каждой конструкции (2x (GGSGGS) и TRAF). Фактор k был оценен с использованием среднего, медианного или способа этих распределений.

Все символы, использованные в этих расчетах, сведены в вспомогательную информационную таблицу 3.

Автоматический анализ изображений

Специально написанное программное обеспечение MATLAB (Mathworks) использовалось для всего анализа изображений. Чтобы идентифицировать отдельные ячейки на изображении, пользователь нарисовал замкнутые границы на основе немаскированного изображения акцепторного канала. Информация за пределами ячеек была отброшена. Для изображений ВинТС и ВинТС-I997A в акцепторном канале были идентифицированы ЖК, что пропорционально концентрации сенсора. В частности, FA были сегментированы с использованием водяного алгоритма, как описано ранее 14, 33, 41, 43, 47.Результат сегментации FA был выведен в виде двоичной маски, которая затем была применена ко всем изображениям, полученным в результате анализа FRET для визуализации данных.

Для каждой ячейки эффективность FRET была охарактеризована с использованием среднего значения режима начальной загрузки, метрики, ранее проверенной для характеристики биологических данных 48. В соответствии с обычными методами начальной загрузки 49 пиксели в ячейке отбирались случайным образом с заменой, а режим выборки оценивался с использованием Алгоритм режима половинного диапазона 48.Этот шаг был повторен 1000 раз, чтобы сгенерировать распределение оцененного режима для эффективности FRET каждой ячейки. Среднее значение этого распределения, называемое средним значением режима начальной загрузки, использовалось для характеристики эффективности FRET для каждой ячейки. Для TSMod отбирались только пиксели, выделенные ручной маскировкой ячеек. Для ВинТС-I997A и ВинТС отбирались пиксели, замаскированные как маскированием фокальной адгезии, так и ручным маскированием ячеек. Размер выборки соответствовал количеству пикселей в каждой анализируемой ячейке.Обратите внимание, что среднее значение режима начальной загрузки обеспечивает единственную точку данных для эффективности FRET каждой ячейки. Аналогичная процедура была проведена для определения значения донор-акцептор для каждой клетки. Клетки со значением донор-акцептор меньше 0,5 или больше 1,5 были исключены из последующего анализа. При сравнении популяций клеток использовались общие статистические методы для сравнения каждой популяции точек данных (рис. 4-6).

Анализ неопределенности эффективности FRET

Чтобы оценить неопределенность измерений эффективности FRET на основе размера экспериментальной выборки, мы случайным образом взяли образцы из наших больших наборов данных.Этот подход предполагает, что полный набор данных, состоящий из сотен ячеек, точно отражает истинное распределение основной популяции. В частности, для каждого размера выборки (1–150 ячеек) данные отбирались случайным образом с заменой из каждой генеральной совокупности, а среднее значение выборки рассчитывалось для всего 10 000 итераций на размер выборки. Таким образом, было получено распределение выборочного среднего для каждого размера выборки. Неопределенность определялась как ширина 95% доверительного интервала этого распределения для каждого размера выборки.

Статистика

Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения JMP Pro 13 (SAS, Cary, NC) или RStudio (версия 1.0.136). Сравнение данных с равными дисперсиями, определенными с помощью теста Левена, анализировали с помощью ANOVA и, при необходимости, тестов HSD Тьюки. Наборы данных с неравными дисперсиями анализировали с помощью непараметрического дисперсионного анализа Уэлча и, при необходимости, тестов Games-Howell. A P значение P <0.05 считали статистически значимым.

Наличие кода

Весь код доступен по запросу.

результатов

Преобразование измерений сенсибилизированного излучения в эффективность FRET

Ключевым шагом в использовании методов сенсибилизированной эмиссии для количественной оценки эффективности FRET для одноцепочечных биосенсоров является определение четырех калибровочных коэффициентов 36, 40.Первые два используются для коррекции перетекания эмиссии донорных и акцепторных флуорофоров в канал FRET. Эти две поправки обычно используются в контексте индексов FRET 24, 25, и методы их определения являются относительно стандартными 11, 30. Третий фактор, обычно называемый G , представляет собой отношение эмиссии акцептора в канале FRET к количество донорной эмиссии в донорском канале для эквимолярных концентраций возбужденных донорных и акцепторных флуорофоров, например, в случае одноцепочечных биосенсоров 36, 50.Эти три параметра используются для преобразования сенсибилизированных эмиссионных изображений, снятых в донорном, FRET и акцепторном каналах, в эффективность FRET. Четвертый фактор, k , представляет собой соотношение интенсивностей флуоресценции между донором и акцептором при эквимолярных концентрациях в отсутствие FRET 36. Этот параметр можно использовать для расчета оценки отношения концентраций донора и акцептора. , что позволяет измерять стехиометрию флуорофора. Для одноцепочечных биосенсоров соотношение должно быть равно единице.Примечательно, что все калибровочные коэффициенты зависят от флуорофора, прибора и настроек 36.

G и k могут быть определены с помощью одной настройки визуализации и не требуют FLIM или другого метода для предоставления дополнительной информации 36. Для этого две конструкции с двумя разными, но постоянными эффективностями FRET отдельно выражаются в ячейках и изображено. Различие в FRET между двумя конструкциями из-за различий в длинах их линкеров должно быть как можно большим, чтобы улучшить оценку 36.В этой работе конструкции состояли из mTFP1 и Venus (A206K), которые соответствуют паре FRET, используемой в VinTS 14. Эти флуорофоры были выбраны из-за их улучшенной яркости и фотостабильности 51, 52 по сравнению с другими генетически кодируемыми флуоресцентными белками, и пригодность для FRET 53. Для создания конструкции с высоким FRET использовали короткий гибкий линкер 2x (GGSGGS) 33. Для создания конструкции с низким FRET использовали производное фактора, ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли альфа (TNFα) (TRAF), в качестве было сделано ранее 36, 43, 45.Конструкции mTFP1-2x (GGSGGS) -Venus и mTFP1-TRAF-Venus отдельно экспрессировались в винкулин - / - эмбриональных фибробластах мыши (MEF). Клетки были визуализированы в соответствии с подробностями в материалах и методах. После получения сенсибилизированных эмиссионных изображений донорское ( I _dd ), FRET с коррекцией на просачивание ( F _c ) и акцепторное ( I _aa ) изображения были использованы для расчета акцепторно-нормированных скорректированных FRET ( F _c / I _aa ) и акцепторно-нормированный донор ( I _dd / I _aa ) интенсивности (рис.1A, B), которые используются для оценки G . Позже мы подтвердили, что 2x (GGSGGS) и TRAF привели к значительному разнице в эффективности FRET, как и ожидалось (вспомогательная информация, рис. 1).

( A ) Цитозольный модуль, состоящий из mTFP1 (синий), связанный с Венерой (желтый) через линкер 2x (GGSGGS), что приводит к высокому FRET из-за короткой длины линкера. ( B ) Цитозольный модуль, состоящий из mTFP1 (синий), связанный с Венерой (желтый) через производное фактора, ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли альфа (TNFα) (TRAF), что приводит к низкому FRET из-за большой длины линкера.Локализация конструкций в винкулин - / - MEF показана в акцепторном канале ( I _{аминокислот} ). Соответствующее нормированное по акцептору изображение с исправленным FRET ( F _c / I _aa ) и изображение донора, нормализованного по акцепторам ( I _dd / I _aa ), показаны с псевдо- окраска. ( C ) Тепловая карта F _c / I _aa по сравнению с I _dd / I _aa пиксельных данных, используемых для оценки коэффициента G .Данные поступают из всех пикселей, сегментированных масками ячеек для 2x (GGSGGS) ( n = 74 ячейки) и TRAF ( n = 39 ячеек) из одного эксперимента. Треугольники, квадраты и круги, используемые для обозначения среднего, медианного значения и моды, соответственно, для каждой совокупности, а наклон черной пунктирной линии соответствует оценке G на основе режима. ( D ) Сравнение четырех методов, использованных для оценки G . Методы включают в себя ранее описанный подход 43 с усреднением ячеек и наш новый подход на основе пикселей с использованием среднего, медианного или режима.Данные и планки ошибок представляют собой среднее значение и стандартную ошибку, соответственно, из четырех независимых экспериментов. Из-за неравных дисперсий, определенных с помощью теста Левена, был использован дисперсионный анализ Уэлча, и статистически значимой разницы в средних не было обнаружено. [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

Для идентификации отдельных ячеек на изображении замкнутые границы были нарисованы вручную на основе немаскированного изображения акцепторного канала. Информация за пределами ячеек была отброшена.Предыдущая работа с использованием этого метода оценивала коэффициенты G и k с использованием подхода, усредненного по ячейкам 43. Этот подход, однако, был чувствителен к выбросам и требовал определяемых пользователем критериев выбора для воспроизводимой оценки калибровочных коэффициентов. Поэтому мы искали надежный, беспристрастный подход для точной оценки калибровочных коэффициентов, необходимых для расчета эффективности FRET по сенсибилизированному излучению.

Модовый численный подход к определению калибровочных коэффициентов

Поскольку калибровка микроскопа, такая как корректировка спектрального просвечивания, измеряется попиксельно (11), мы пришли к выводу, что пиксельный подход может обеспечить точный автоматизированный метод оценки калибровочных коэффициентов сенсибилизированного излучения.График плотности выборки всех пикселей, составленный из одного эксперимента, нормализованного по акцептору скорректированного FRET ( F _c / I _aa ) в сравнении с нормализованным по акцептору донором ( I _dd / I _aa ) показан для 2x (GGSGGS) и TRAF (рис. 1C). Данные обеих конструкций не являются гауссовыми и смещены в сторону начала координат, предполагая, что среднее, медиана и мода, вероятно, дадут разные значения 54. Поэтому мы исследовали, какая метрика среднего распределения привела к наиболее надежной оценке калибровки. факторы.Хотя вычисление среднего и медианного значения является несложным, существуют различные методы для аппроксимации режима непрерывного распределения 48. Здесь был использован алгоритм 55 режима половинного диапазона, поскольку он не требует ввода данных пользователем, такого как определение размера ячейки, и ранее был признан подходящим методом для анализа биологических данных 48. Алгоритм режима половинного диапазона - это итеративный процесс, посредством которого набор данных разделяется на две группы на основе средней точки диапазона набора данных (вспомогательная информация, рис.2). Группа с большим количеством точек идентифицируется и впоследствии разделяется на основе средней точки ее диапазона. Этот процесс оценки меньших интервалов продолжается до тех пор, пока не останется только две точки. Расчетный режим равен среднему значению этих двух точек. Для каждого эксперимента среднее распределение было определено как для 2x (GGSGGS), так и для TRAF с использованием среднего значения, медианы и режима. Затем для каждого показателя наклон линии, соединяющей две точки данных, дал оценку G . Оценки G были отдельно измерены в четырех независимых экспериментах (2x (GGSGGS): n = 207 ячеек; TRAF: n = 152 ячеек), и использование трех показателей для оценки G было по сравнению (рис.1D).

( A ) Примеры изображений акцепторов винкулина - / - MEF, экспрессирующих либо 2x (GGSGGS), либо TRAF, и связанные с ними замаскированные для клеток псевдоокрашенные изображения рассчитанного фактора k . Масштабные линейки 25 мкм. ( B ) Гистограмма данных пикселей, соответствующих либо 2x (GGSGGS) (синий, n = 74 ячейки), либо TRAF (оранжевый, n = 39 ячеек) из всех ячеек в одном эксперименте. ( C ) Сравнение четырех методов, использованных для оценки k .методы включают ранее описанный подход 43 с усреднением ячеек и наш подход на основе пикселей с использованием среднего, медианного или режима. Данные и планки ошибок представляют собой среднее значение и стандартную ошибку, соответственно, для обеих конструкций в четырех независимых экспериментах. После теста Левена ANOVA не обнаружил статистически значимых различий в средних значениях. [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

Хотя статистические тесты не смогли обнаружить различий между результатами различных методов, расчет на основе режима коэффициента G (среднее значение = 2.10, se = 0,026) оказался наиболее точным. Для сравнения: средний (среднее = 2,61, отклонение = 0,377) и основанный на медиане (среднее значение = 2,29, отклонение = 0,132) подходы имели значительно большую стандартную ошибку (рис. 1D). Сравнение этих расчетов с нашим ранее опубликованным методом усреднения ячеек 43 (среднее значение = 2,25, se = 0,155) показывает, что оценка на основе режима дает результаты, аналогичные нашему предыдущему подходу, без необходимости использования определяемых пользователем критериев исключения, использованных в предыдущей работе. .

Используя уточненную оценку G (2.10), данные, относящиеся к mTFP1-2x (GGSGGS) -Venus и mTFP1-TRAF-Venus, были дополнительно проанализированы для расчета фактора k (рис. 2A) в соответствии с уравнением. 3, описанных в разделе «Материалы и методы». Распределения коэффициента k как для 2x (GGSGGS), так и для TRAF были скомпилированы для всех пикселей в одном эксперименте и выглядят негауссовыми (рис. 2B). Чтобы определить, какая метрика обеспечивает наиболее точную оценку k , среднее распределение было охарактеризовано с использованием среднего, медианы и моды.В четырех независимых экспериментах этот анализ дал восемь оценок к для каждого из трех показателей. Сравнения (рис. 2C) показывают, что три показателя, а также метод усреднения по ячейкам, дают оценки, которые почти эквивалентны.

В совокупности эти результаты демонстрируют, что режим является точным и надежным показателем для оценки коэффициентов калибровки для измерений эффективности FRET на основе сенсибилизированных выбросов и не требует определяемого пользователем исключения выбросов.Отметим, что эти подходы более важны при определении G , чем k . Мы предполагаем, что эта разница существует, потому что вычисление G включает интерполяцию данных из нескольких конструкций, тогда как k может быть определено из одной конструкции. Таким образом, G может быть более чувствительным к выбросам, а режим обеспечивает надежную количественную оценку распределений ключей.

Характеристика эффективности FRET в ячейке на основе режимов

Затем мы проверили, может ли подход, основанный на режимах, лучше характеризовать эффективность FRET в одной ячейке.Для начала мы исследовали конструкцию, в частности модуль датчика натяжения без нагрузки (TSMod), который, как ожидается, будет демонстрировать единую нормально распределенную эффективность FRET. Когда TSMod экспрессируется в цитозоле винкулин - / - MEF, ранее наблюдалась характерная эффективность FRET приблизительно 28,6% 43. Чтобы охарактеризовать распределение эффективности FRET клетки, мы исследовали среднее значение, медианное значение и режим. Однако из-за ограниченного количества пикселей на ячейку мы также проверили, уменьшит ли бутстрапирование потенциальный эффект шума, как рекомендовано в другом месте 48.Мы отмечаем, что бутстрэппинг - это широко используемый метод для оценки свойств статистики, таких как среднее, медиана или мода 49. Вкратце, выборочное распределение статистики определяется путем случайной повторной выборки данных, а бутстраповская оценка параметра равна среднее значение статистики из бутстрэп-выборок 56. Дополнительные сведения об этом анализе см. в разделе «Материалы и методы». Сравнение более 400 ячеек, индивидуально охарактеризованных с использованием среднего, медианного и режима, как с начальной загрузкой, так и без нее, демонстрирует, что использование режима начальной загрузки приводит к среднему значению популяции, которое наиболее близко соответствует оценке из предыдущей работы 43, но без использования определяемые пользователем критерии исключения (рис.3). Эти результаты демонстрируют, что для большой популяции ячеек режим начальной загрузки обеспечивает точную и надежную характеристику распределения эффективности FRET ячейки.

Сравнение различных методов для характеристики эффективности FRET в живых, TSMod-экспрессирующих винкулин - / - MEF. Для каждой ячейки эффективность FRET характеризовалась либо средним, либо медианным значением, либо режимом с начальной загрузкой и без нее. Данные и планки ошибок представляют собой среднее значение и стандартную ошибку, соответственно, для всей популяции клеток ( n = 454 клетки, N = 11 экспериментов).Пунктирная линия представляет опубликованное значение эффективности FRET 28,6% для незагруженного mTFP1- (GPGGA) ₈ -Venus (TSMod) 43.

Модули датчиков натяжения на основе FRET нечувствительны к фиксации

Чтобы начать использовать повышенную точность определения характеристик на основе мод, мы решили более тщательно изучить, совместимы ли датчики натяжения на основе FRET с традиционными методами молекулярной биологии. Хотя датчики натяжения на основе FRET широко используются в живых клетках, было бы полезно комбинировать их с другими молекулярными анализами, такими как иммунофлуоресценция 57 или анализ лигирования близости 58, но эти методы обычно включают фиксацию клеток и мембранную проницаемость.

Известно, что фиксация

имеет контекстно-зависимые эффекты на флуорофоры, поскольку определенные протоколы фиксации могут подавлять флуорофоры или значительно изменять измерения FRET 36, 59-63. Обычные протоколы фиксации используют параформальдегид (PFA) или метанол для физического сшивания компонентов клетки. Однако метанол по своей природе несовместим с датчиками натяжения на основе FRET, поскольку он приводит к денатурации флуоресцентных белков 63. Таким образом, винкулин - / - MEF, экспрессирующие цитозольный TSMod (рис.4A) были получены изображения вживую или после фиксации PFA класса EM (рис. 4B, C). Анализ сотен клеток, экспрессирующих TSMod, демонстрирует, что средняя эффективность FRET TSMod в популяции в живых и фиксированных условиях сопоставима и составляет 28,4% и 28,7% соответственно (фиг. 4L). Эти более точные характеристики, основанные на моде, предполагают, что фиксация с помощью PFA по своей сути не нарушает флуорофоры модуля или расстояние разделения, когда он экспрессируется в клетках.

( A ) Модуль датчика натяжения (TSMod) состоит из двух флуорофоров, разделенных жгутиковой линкерной последовательностью (GPGGA) ₈ .Локализация и оценка эффективности FRET TSMod в ( B ) живых и ( C ) фиксированных параформальдегидом винкулин - / - клетках MEF. ( D ) Актин-связывающий мутант сенсора натяжения винкулина (VinTS-I997A) состоит из TSMod, вставленного после aa 883 винкулина, и точечной мутации на aa 997. Локализация и оценка эффективности FRET VinTS-I997A в ( E ) живые, ( F ) фиксированные параформальдегидом и ( G ) винкулин, иммунофлуоресцентно меченные винкулин - / - MEF.( H ) датчик натяжения винкулина (VinTS) состоит из TSMod, вставленного после aa 883. Локализация и оценка эффективности FRET VinTS в ( I ) в реальном времени, ( J ) с фиксированным параформальдегидом и ( K ) винкулин, иммунофлуоресцентно меченные винкулин - / - MEF. Распределение FRET всех образцов изображений представлено на рисунке S3 вспомогательной информации. ( L ) Средняя эффективность FRET TSMod (live, n = 454, N = 11; фиксированная, n = 378, N = 11), VinTS-I997A (live, n = 161, N = 11; фиксированный, n = 50, N = 2; Vinculin IF, n = 272, N = 5) и VinTS (live, n = 173, N = 13; фиксированный, n = 164, N = 6; винкулин IF, n = 98, N = 3) в различных условиях.После теста Левена различия между (a) TSMod и VinTS-I997A и (b) VinTS определяли с помощью дисперсионного анализа Уэлча и теста Games-Howell. Планки погрешностей представляют собой одну стандартную ошибку. [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

Белковые модули датчиков натяжения нечувствительны к фиксации

Затем мы определили, влияет ли фиксация на модуль датчика натяжения, когда он включен в белок, такой как VinTS, который состоит из TSMod, вставленного между его головным и хвостовым доменами.Поскольку ВинТС несет в себе силы, генерируемые актомиозином, и фиксация может влиять на сеть актомиозина, сначала был использован ненагруженный контроль, чтобы изолировать эффекты фиксации на TSMod, когда он включается в винкулин и локализуется в FA. Мутация винкулина I997A, которая снижает аффинность связывания винкулина с актином 15, 64, была использована для создания незагруженного контроля, обозначенного VinTS-I997A (фиг. 4D). Предыдущая работа показала, что ВинТС-I997A не испытывает нагрузок в живых клетках 41. Средняя эффективность FRET ВинТС-I997A в живых и фиксированных винкулин - / - MEF (рис.4E, F) составляет 28,5% и 27,9% соответственно (рис. 4L). Следовательно, фиксация, по-видимому, не влияет на включенный в белок, локализованный в FA TSMod в отсутствие нагрузки.

VinTS (рис. 4H) был затем исследован, чтобы определить, влияет ли фиксация на актомиозиновую сеть или TSMod в присутствии нагрузки. В винкулин - / - MEF, экспрессирующих VinTS (фиг. 4I, J), средняя эффективность FRET в популяции для живых и фиксированных условий имеет значения 20,5% и 21,3%, соответственно (фиг. 4L).Таким образом, наша характеристика на основе режима предполагает, что датчики натяжения на основе FRET совместимы с этим протоколом фиксации.

Датчики натяжения на основе FRET не подвержены влиянию общего протокола иммунофлуоресценции

Поскольку одна фиксация имеет ограниченное применение, мы исследовали совместимость VinTS с иммунофлуоресценцией, используемой для определения количества и локализации белков или конкретных посттрансляционных модификаций. Типичный эксперимент по иммунофлуоресценции требует выполнения нескольких этапов: фиксации, пермеабилизации, блокирования и иммуно-мечения.Поскольку ни один из этих шагов по отдельности не является полезным, мы исследовали, изменяется ли FRET эффективность VinTS в конце протокола непрямой иммунофлуоресценции. Проницаемость и блокирование проводились с помощью Triton-X и 2% BSA в связи с их широким использованием. VinTS был иммуномечен с использованием первичного антитела винкулина, поскольку мы пришли к выводу, что близкое расположение, скорее всего, выявит сложности, такие как возможные взаимодействия между антителом и датчиком напряжения. Чтобы минимизировать межмолекулярный FRET между датчиком натяжения и флуоресцентно меченным вторичным антителом, был выбран Alexa Fluor 647, потому что его спектры возбуждения имеют минимальное перекрытие со спектрами излучения Венеры.Чтобы изолировать влияние на сам датчик и изменения в актомиозиновом цитоскелете, были отдельно исследованы VinTS-I997A (рис. 4G) и VinTS (рис. 4K). Для ВинТС-I997A и ВинТС средняя эффективность FRET по совокупности составляет 28,0% и 21,1% соответственно (рис. 4L). Эти значения демонстрируют, что этот протокол иммунофлуоресценции не оказывает значительного влияния на измерения VinTS.

Измеримые различия в межмолекулярных контролях FRET

Чтобы оценить чувствительность характеристики FRET на основе мод, мы стремились различить различия в сигналах FRET между двумя похожими, но структурно уникальными конструкциями FRET.В частности, мы исследовали две общие пары конструкций, используемых для измерения межмолекулярного FRET. Первая пара конструкций, называемых внутренними контролями, состоит из винкулина с mTFP1 или Венерой вместо модуля датчика натяжения (рис. 5A) 14. Второй набор конструкций, называемых темными мутантными контролями (рис. 5B), состоит из VinTS с точечной мутацией, которая нарушает флуоресценцию акцептора или донора 44. Темные мутанты были получены, как описано в материалах и методах. Выражали, отображали и анализировали либо внутренние контроли, либо темные мутантные контроли (рис.5В, Г). Однако для точной оценки количества межмолекулярного FRET, встречающегося в VinTS, необходимо иметь как физиологические уровни экспрессии, так и эквимолярную экспрессию двух конструкций, составляющих каждую контрольную пару. Чтобы преодолеть эту технологическую проблему, были выборочно визуализированы клетки с интенсивностью акцептора, примерно вдвое меньшей, чем у клеток, экспрессирующих VinTS. Кроме того, эквимолярная экспрессия двух конструкций была достигнута путем исследования клеток с соотношением донор-акцептор между 0.5 и 1.5. Для обеих конструктивных пар небольшой межмолекулярный FRET наблюдается, как и ожидалось (фиг. 5E). Однако внутренние контроли ( n = 24 клетки, N = 3 независимых эксперимента) демонстрируют эффективность FRET, которая статистически отличается от темновых мутантов ( n = 31 клетка, N = 3 независимых эксперимента). Таким образом, при относительно небольшом размере выборки различима разница в эффективности FRET примерно в 4%. Эти результаты предполагают, что внутренний контроль переоценивает степень межмолекулярного FRET, который может возникать в VinTS.Это несоответствие, вероятно, связано со структурными различиями в двух контрольных парах. Темные мутанты, вероятно, лучше контролируют, потому что они более точно имитируют структуру VinTS.

( A ) Внутренние межмолекулярные контроли FRET винкулина содержат Venus или mTFP1, вставленные в aa 883. ( B ) Контрольные межмолекулярные FRET VinTS темного цвета содержат точечные мутации на Венере или mTFP1, которые нарушают флуоресцентные свойства флуорофора.( C ) Локализация внутренних конструкций винкулина, коэкспрессируемых в винкулин - / - MEF. ( D ) Локализация темных конструкций VinTS, коэкспрессируемых в винкулин - / - MEF. Также показаны соответствующие замаскированные эффективности FRET. ( E ) Разница в средней эффективности FRET внутренних компонентов винкулина и темных оттенков VinTS, определенная с помощью t -теста ( P = 0,0014). Планки погрешностей - это одна стандартная ошибка. [Цветной рисунок можно посмотреть на сайте wileyonlinelibrary.com]

Размер выборки влияет на неопределенность измерений эффективности FRET

В недавних исследованиях датчиков натяжения на основе FRET 65-71 размеры выборки варьировались от десятков до сотен, и статистика была сделана на данных, которые варьируются по шкале длины от субклеточных структур до целых клеток.Поэтому мы исследовали, как размер выборки, в частности количество проанализированных клеток, влияет на неопределенность измерений эффективности FRET. Мы сосредоточились на измерениях целых клеток, чтобы можно было сравнивать датчики, локализующиеся в цитозоле, а также ЖК. Мы смоделировали экспериментальный отбор образцов для аппроксимации неопределенности, определяемой как ширина 95% доверительного интервала среднего значения выборки для данного размера выборки. Более подробную информацию можно найти в материалах и методах.

Сначала мы исследовали данные живых и фиксированных клеток, экспрессирующих TSMod.Кривые, относящиеся к этим условиям, близко совпадают, демонстрируя, что фиксация не изменяет неопределенность измерений FRET (рис. 6A). Затем мы оценили производительность TSMod, ВинТС-I997A и ВинТС в реальных условиях (рис. 6Б). TSMod демонстрирует наименьшую неопределенность при всех размерах выборки, а VinTS - наибольшую. Это говорит о том, что как включение TSMod в белок, так и воздействие нагрузки могут увеличить неопределенность измерений FRET. Таким образом, неопределенность также может зависеть от условий, в которых находятся клетки, и / или неоднородности между клетками.Если присмотреться к этим результатам, то погрешность TSMod составляет 1,9% и 1,1% при рассмотрении 30 или 100 ячеек соответственно. Точно так же погрешность ВинТС составляет 3,1% и 1,7% для 30 и 100 ячеек соответственно. Это демонстрирует, что следует проявлять особую осторожность при оценке наборов данных датчиков натяжения на основе FRET небольшого размера и небольших изменений натяжения. Для нашей экспериментальной установки этот анализ показывает, что различия в эффективности FRET примерно 1-2% можно различить при больших размерах выборки.Однако меньшие различия кажутся неразрешимыми. Этот анализ служит ценным индикатором и может использоваться в качестве приблизительного индикатора, когда небольшие выборки не являются показательными для статистики населения. Мы предлагаем, чтобы исследователи использовали эти идеи и аналогичные анализы для разработки собственного экспериментального плана исследований с датчиками натяжения на основе FRET.

( A ) Неопределенность в оценке средней эффективности FRET в популяции как функции размера выборки для TSMod, выраженного в живых ( n = 454) и фиксированных ( n = 378) винкулин - / - MEF.Для каждого размера выборки неопределенность представляет собой ширину 95% доверительного интервала среднего распределения, которое возникает в результате моделирования экспериментальной выборки, описанной в материалах и методах. ( B ) Такой же анализ был проведен на данных живых винкулин - / - MEF, экспрессирующих TSMod ( n = 454), VinTS-I997A ( n = 161) или VinTS ( n = 173). .

Обсуждение

Основываясь на ранее установленных методах использования сенсибилизированной эмиссии для расчета эффективности FRET 36, 40, в этой работе описаны подходы к минимизации и количественной оценке изменчивости в расчетах FRET.Чтобы уменьшить вариабельность расчетов эффективности FRET, мы сначала разработали численные методы для точного расчета необходимых калибровочных коэффициентов. Наши результаты показали, что анализ на основе режимов двух контрольных конструкций, демонстрирующих высокий и низкий FRET, обозначенных как 2x (GGSGGS) и TRAF, соответственно, обеспечил наиболее точную оценку калибровочных коэффициентов G и k . Аналогичный подход на основе режима был включен в анализ датчиков натяжения на основе FRET для повышения надежности и согласованности характеристики молекулярных нагрузок, испытываемых винкулином.Хотя целью этой статьи было улучшение измерений FRET VinTS, наша предыдущая работа уже подтвердила функцию этого датчика 14, 33, 41, 43. Примечательно, что недавние усилия по моделированию описали эффекты вращательной подвижности флуорофоров и гибкость линкера 33. Было обнаружено, что описанный подход, основанный на режимах, менее подвержен шуму и выбросам, чем подход на основе среднего, который чаще всего используется для характеристики измерений датчика натяжения на основе FRET 14, 20, 44, 65, 72.Хотя в данной работе это не исследовалось, асимметрия в распределении эффективности FRET, особенно для цитозольных сенсоров, может быть интересной темой для изучения. В настоящее время трудно определить единый механизм асимметрии данных экспериментов с биосенсорами на основе FRET. Незначительные изменения в сворачивании или функциональности подмножества датчиков, локализации датчиков в разных субклеточных компартментах или множества других переменных могут привести к изменениям, которые могут повлиять на FRET.По этой причине мы решили сосредоточиться на точной оценке режима распределений FRET, что при достаточно высоком соотношении сигнал / шум является точной количественной оценкой FRET. Кроме того, мы отмечаем, что демонстрация того, что ранее разработанные контрольные конструкции 14, 43 сообщают об ожидаемой эффективности FRET, является простым и мощным средством, гарантирующим, что экспериментальные условия позволяют достичь достаточного отношения сигнал / шум.

Используя наш надежный метод характеристики, мы также продемонстрировали, что VinTS не нарушается несколькими этапами обработки, связанными с иммуно-маркировкой, а именно фиксацией, пермеабилизацией, блокированием и маркировкой антител.Это важно, поскольку предполагает, что будущие исследователи могут одновременно измерять молекулярные нагрузки и проводить дополнительные тесты на одном и том же образце. Этот тип понимания, вероятно, приведет к значительному улучшению нашего понимания механобиологии и механочувствительных процессов 73. Например, можно было бы изучить, как адгезионный состав или сигналы изменяются в ответ на нагрузку. Однако отметим, что эти результаты могут быть неприменимы в целом. Подобные оценки по-прежнему необходимы для датчиков натяжения на основе FRET, используемых в других белках, и, вероятно, для VinTS, если они используются в клетках в различных механических микросредах, например, в трехмерной культуре клеток.Следует также отметить, что анализа in vivo , которые ограничены по размеру выборки, могут выиграть от подходов на основе FLIM, поскольку они не требуют такого большого количества контрольных конструкций 74.

Чувствительность нового метода была проверена путем сравнения эффективности FRET двух схожих, но структурно различных межмолекулярных контролей FRET. Помимо обнаружения небольшой разницы в эффективности FRET между двумя контролями, мы обнаружили, что внутренние контроли винкулина могут переоценивать количество межмолекулярного FRET, возникающего в клетках, экспрессирующих VinTS.Это демонстрирует, что темные мутанты являются более подходящим межмолекулярным контролем FRET, поскольку они почти идентичны структуре самого датчика натяжения. Мы также отмечаем, что цитозольные сенсоры, которые включают 2x (GGSGGS), TRAF и TSMod, вряд ли будут подвергаться межмолекулярному FRET, потому что их акцепторная интенсивность, показатель концентрации, приблизительно эквивалентна или меньше, чем у конструкций на основе винкулина. Ранее мы также показали, что эффективность FRET цитозольных сенсоров не зависит от концентрации сенсоров на уровне или ниже наблюдаемых уровней экспрессии 33.

Поскольку количество образцов часто ограничено для сложных биологических экспериментов, мы исследовали, как размер выборки влияет на неопределенность в нашей оценке средней эффективности FRET для популяции. Для всех конструкций мы обнаружили, что небольшие размеры выборки (<30 клеток) были связаны с высокой неопределенностью. По мере увеличения размера выборки неопределенность снижалась до очевидного предела эффективности FRET примерно 1–2%. Это говорит о том, что разница ниже этой суммы не подлежит определению.Кроме того, в нем подчеркиваются преимущества рационально разработанных датчиков, которые оптимально настроены для конкретных режимов силы 33. Мы также обнаружили, что неопределенность зависит от экспериментальных условий или молекулярной нагрузки. Чтобы получить большие размеры выборки, необходимые для этого анализа, мы использовали стабильную, а не временную экспрессию конструкций. Хотя стабильная экспрессия позволяет выбирать уровни экспрессии конструкции посредством сортировки клеток, существует риск, что гомологичная рекомбинация может происходить из-за сходства последовательностей обычно используемых флуоресцентных белков 75.Чтобы избежать гомологичной рекомбинации, стабильная экспрессия должна быть зарезервирована для модулей датчиков натяжения, состоящих из флуорофоров, происходящих от разных видов, таких как модуль mTFP1-Venus, используемый здесь, или последовательностей, которые были зашифрованы кодонами 75, 76.

Подводя итог, мы показали, что подходы, основанные на режимах, улучшают точность как калибровок микроскопа, необходимых для измерений FRET на основе сенсибилизированных выбросов, так и измерения средней эффективности FRET ячейки.Кроме того, мы предоставили оценки, которые позволяют априорных оценок количества измерений, необходимых для достижения желаемой точности. Эти основанные на режимах методы демонстрируют, что измерения VinTS совместимы с методами иммуномаркировки, такими как анализ совместной локализации флуоресценции и лигирования по близости, что позволяет предположить, что другие датчики также могут быть совместимы с этими широко используемыми и мощными подходами. Это открывает дверь для множества возможных экспериментов, которые могут помочь исследователям лучше понять основные механизмы механотрансдукции.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Бена Фабри и доктора Вольфганга Х. Гольдмана (Университет Фридриха Александра в Эрлангене-Нюрнберге) за предоставленные винкулин - / - клетки. Авторы также благодарят доктора Кристофера Гилкриста и Тимоти Кертиса Шойера за комментарии и изучение рукописи. Авторы полностью несут ответственность за содержание и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH. Любые мнения, выводы, заключения или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения NSF.

Конфликт интересов

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

.

No related posts.