Лада класса с: Модельный ряд и цены автомобилей Lada (Лада) — Quto.ru

No comments

Содержание

Рейтинг малолитражек в B-классе по итогам 2021 возглавила Lada Vesta

А Volkswagen Polo сильнее других провалился в продажах

Эксперты Банкавто (цифровая платформа РГС Банка) проанализировали, как изменялись продажи наиболее популярных малолитражек B-класса. Hyundai Solaris неожиданно стал возмутителем спокойствия давно сформировавшегося сегмента, Volkswagen Polo сильнее других провалился в продажах, а Lada Vesta доросла до звания лидера рейтинга.

Рейтинг автомобилей В-класса в России давно сформировался и последние несколько лет практически не менялся. Тем интересней, что по итогам 2021 года он претерпел заметные изменения. Прежде всего, здесь поменялся лидер. Частые простои конвейеров в Тольятти и более стабильная работа завода в Ижевске привели к тому, что автомобили Lada Vesta было проще купить, чем Granta. В итоге (пусть и совсем с небольшим преимуществом) лидером рейтинга оказалась именно первая модель. Всего покупателей нашли 113 698 Lada Vesta. В то время как Granta (111 430 а/м), оказавшаяся на втором месте, недосчиталась 12% от прежнего объема реализации.

Kia Rio также потерял в объеме продаж за год (82 941 а/м; -6%). Но это не отразилось на его положении в рейтинге. Автомобиль по-прежнему остается третьим в абсолюте и первым среди всех иномарок.

А вот продажи его «брата» по концерну – Hyundai Solaris – возросли почти на четверть (61 061 а/м; +24%), обеспечив четвертое место в рейтинге малолитражек. Поставки комплектующих на завод под Санкт-Петербургом для этой модели проходили на удивление почти без задержек. Чего нельзя сказать про завод Volkswagen в Калуге. Эта одна из главных причин того, что Polo (48 887 а/м; -20%) провалился в продажах сильнее всех в B-классе, оказавшись на пятом месте.

По Skoda Rapid (41 680 а/м; +18%) автопроизводитель также не смог обеспечить сборку в нужных количествах, а в декабре продажи модели упали почти на треть. Но за счет роста в первой половине года модель показала итоговый годовой прирост, обеспечивший ей шестое место рейтинга.

Renault Logan и Sandero в продажах падали – на 9% и 14% соответственно. Французские малолитражки собирают в Тольятти, по соседству с Lada Granta. И почти всю вторую половину прошлого года они имели те же проблемы с комплектующими и логистикой, что и модели АвтоВАЗа.

На фоне дефицита большинства моделей Lada у АвтоВАЗа существенно выросли продажи прежде не особо востребованного хэтчбека X-Ray (22 107 а/м; +15%), занявшего девятое место рейтинга. Он, как известно, построен на платформе Renault Sandero, стоит примерно как Lada Vesta SW, но заметно поигрывает ей во вместительности, плавности хода и раньше сильнее уступал в популярности. И наконец, замкнул топ-10 хэтчбек Mini (1 403 а/м; -12%). Он традиционно очень существенно уступает в продажах прочим представителям B-сегмента и оказался в их компании только из-за схожести размеров, но отнюдь не имиджа.

В целом по итогам 2021 года количество автомобилей размерного класса В по-прежнему уверенно превышает отметку в полмиллиона. Однако в прошлом году продажи снизились примерно на 1,5%. В то же время нельзя сказать, что эта тенденция будет долгосрочной. Седаны и хэтчбеки малого класса остаются на нашем рынке самыми доступными машинами. В условиях низкой покупательной способности населения они в любом случае будут иметь спрос.

LADA Vesta время выходить на новый уровень?

Так ли престижна «Веста», как ее хотят видеть владельцы? В сети разгораются споры.

Лада Веста, массовое производство и продажи которой начаты в 2016 году, стала третьей после «Копейки» и «Восьмерки» отправной точкой новой вехи не только в истории «АвтоВАЗа», но и в целом развития отечественного автопрома.

Благодаря «Весте», особенно совершенствуемым «молодым» моделям, российский автопром уже может уверенно конкурировать с зарубежным в бюджет-классе. Сегодня же на внутреннем рынке Vesta и вовсе получает конкурентное преимущество как автомобиль, по уровню сборки, материалов, оснастки не уступающий корейским автомобилям KIA Rio и Hyundai Solaris, но на более выгодных условиях. Эстетическая сторона «Весты» хоть и вызывает споры, но абсолютное большинство автолюбителей устраивает.

«Веста» «выигрывает» у основных конкурентов по простору в салоне и вместимости багажника, особенно кросс-универсал LADA Vesta SW Cross. Однако «вестоводам» уже недостаточно просто наслаждаться преимуществами приобретенного и эксплуатируемого автомобиля. Есть мнение, что «АвтоВАЗ» в лице «Весты» «дорос» до С-класса, и LADA Vesta правомерно сравнивать не с «Рио» и «Солярисами» (уверенный бюджетный «В»), а с «нормальными машинами». Сама же «Веста» — переворот в мировом С-классе, феномен – первый в мире такого рода автомобиль по честной цене В-класса, а то и ниже.

В качестве аргументов приводятся габариты автомобиля, судя по которым «Веста» действительно вписывается в «современный «С» и уровень оснастки и комфорта. Впрочем, проектировалась LADA Vesta на платформе, за основу которой взята С-платформа. Таким образом, «Веста» уже «выросла» из «В», ей, а также автовладельцам, в этом классе «тесно», но они понимают, что официальный перевод машины в «С» повлечет и повышение цены. Это сделает пока еще «народный» автомобиль атрибутом престижа.

«Не для перевозки картошки девочку «рожали»: В сети вспомнили о редком кабриолете LADA Natasha

Как обычно, лучшие отечественные проекты уходили на экспорт.

Оппоненты же взывают к «голосу разума», указывая на то, что ориентироваться, все же, стоит на официальные данные: «На сайте дилера «Лады» прямо написано что «Веста» это В-класс», а также на то, что некогда топ-менеджер «АвтоВАЗа» Бу Инге Андерссон, под руководством которого создавалась и выводилась «в свет» Vesta, подчеркивал, что «Веста» одна из самых крупных машин в В-классе. О «С» речи не шло, да и пока рано превозносить еще «сыроватый» автомобиль.

Симферополь | Автоваз выпустит LADA–С класса

Новую LADA класса С, кроссовер и седан, АвтоВАЗ планирует выпускать на ижевском автозаводе уже в конце 2016 года.

После того, как с конвеера сойдут серийные LADA XRAY, АвтоВАЗ вплотную начнёт разрабатывать автомобили класса С, сейчас работа пока идёт над схемой вместимости и разрабатывается модель пропорций, выбирается внешний вид будущего автомобиля и интерьер салона.

Остаётся неизвестным, какая Лада первой выйдет в производство: седан или полноприводный внедорожник, по неофициальным источникам стало известно, что это всё-таки будет седан. Возможно речь идёт о преемнике бывшей “Ниве” – LADA 4Х4.

Напомним, что созданием автомобиля этого класса занялись в 2000 годы, но проект был заморожен. Только сейчас, несмотря на то, что на АвтоВАЗ пришёл альянс Renault-Nissan, этот проект возрождается.

Сейчас на АвтоВАЗе вплотную идёт подготовка к серийному производству LADA XRAY , тестовый автомобиль которой проходит уже испытания на дорогах.

Автор:Таисия ПРОНИНА

Фото: ls-dyna.ru

Источник


Загрузка. ..
  • 20
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
    • Новости Новороссии 2 Anastasia Комментарии (0) Добавление комментария
    Информация
    Посетители, находящиеся в группе Гости , не могут оставлять комментарии к данной публикации.
    Меню сайта
  • Главная страница
  • Информация о сайте
  • Форум
  • Фотоальбомы
  • Обратная связь
    • Данный материал опубликован на сайте BezFormata 11 января 2019 года,
    ниже указана дата, когда материал был опубликован на сайте первоисточника!

    Связанные с белками рецепторы класса C G: оживление старых пар с новыми партнерами

  • Брок С, Уэслати Н, Солер С, Будье Л, Рондар П, Пин Дж. П. (2007) Активация димерного метаботропного глутаматного рецептора путем межсубъединичной перегруппировки. J Biol Chem 282:33000–33008

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Calebiro D, Rieken F, Wagner J, Sungkaworn T, Zabel U, Borzi A, Cocucci E, Zurn A, Lohse MJ (2013) Одномолекулярный анализ флуоресцентно меченных рецепторов, связанных с G-белком, выявляет комплексы с различными динамика и организованность.Proc Natl Acad Sci USA 110:743–748

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Comps-Agrar L, Kniazeff J, Nørskov-Lauritsen L, Maurel D, Gassmann M, Gregor N, Prezo L, Bettler B, Durroux T, Trinquet E, Pin JP (2011) Наборы олигомерных состояний GABA

    B Эффективность передачи сигналов рецептора . EMBO J 30:2336–2349

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Comps-Agrar L, Kniazeff J, Brock C, Trinquet E, Pin JP (2012) Стабильность олигомеров рецептора GABA B , выявленная с помощью двойного TR-FRET и лекарственного нацеливания на клеточную поверхность. FASEB J 26:3430–3439

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Couve A, Филиппов AK, Connolly CN, Bettler B, Brown DA, Moss SJ (1998) Внутриклеточное удержание рекомбинантных GABA B рецепторов. J Biol Chem 273:26361–26367

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Doumazane E, Scholler P, Zwier JM, Trinquet E, Rondard P, Pin JP (2011) Новый подход к анализу белковых комплексов клеточной поверхности выявляет специфические гетеродимерные метаботропные глутаматные рецепторы.FASEB J 25:66–77

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Думазан Э., Шоллер П., Фабр Л., Цвир Дж. М., Тринкет Э., Пин Дж. П., Рондар П. (2013) Освещение механизмов активации и аллостерических свойств метаботропных глутаматных рецепторов. Proc Natl Acad Sci USA 110:E1416–E1425

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Duthey B, Caudron S, Perroy J, Bettler B, Fagni L, Pin JP, Prezeau L (2002) Для активации G-белка гетеродимерным рецептором GABA B требуется одна субъединица (GB2).

    J Biol Chem 277:3236–3241

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • El Moustaine D, Granier S, Doumazane E, Scholler P, Rahmeh R, Bron P, Mouillac B, Baneres JL, Rondard P, Pin JP (2012) Различная роль димеризации метаботропных рецепторов глутамата в активации агонистов и G- белковое соединение. Proc Natl Acad Sci USA 109:16342–16347

    Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Fredriksson R, Lagerstrom MC, Lundin LG, Schioth HB (2003) Связанные с G-белком рецепторы в геноме человека образуют пять основных семейств.Филогенетический анализ, паралогонные группы и отпечатки пальцев. Мол Фармакол 63:1256–1272

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Galvez T, Parmentier ML, Joly C, Malitschek B, Kaupmann K, Kuhn R, Bittiger H, Froestl W, Bettler B, Pin JP (1999) Мутагенез и моделирование внеклеточного домена рецептора GABA

    B поддерживают a Механизм связывания лиганда венериной мухоловкой. J Biol Chem 274:13362–13369

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Galvez T, Prézeau L, Milioti G, Franek M, Joly C, Froestl W, Bettler B, Bertrand HO, Blahos J, Pin JP (2000) Картирование сайта связывания агониста субъединицы ГАМК B типа 1 проливает свет на процесс активации рецепторов GABA B .J Biol Chem 275:41166–41174

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Galvez T, Duthey B, Kniazeff J, Blahos J, Rovelli G, Bettler B, Prézeau L, Pin JP (2001) Аллостерические взаимодействия между субъединицами GB1 и GB2 необходимы для оптимальной функции рецептора GABA B . EMBO J 20:2152–2159

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Гассманн М., Шабан Х., Вигот Р., Сансиг Г., Халлер С., Барбьери С., Юмо Ю., Шулер В., Мюллер М. , Кинзель Б., Клебс К., Шмутц М., Фростл В., Хейд Дж., Келли П.Х., Джентри C, Jaton AL, Van der Putten H, Mombereau C, Lecourtier L, Mosbacher J, Cryan JF, Fritschy JM, Lüthi A, Kaupmann K, Bettler B (2004) Перераспределение белка GABA B(1) и атипичного GABA Ответы B у мышей с дефицитом GABA B(2) .J Neurosci 24:6086–6097

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Генг Ю., Сюн Д., Мосяк Л., Малито Д.Л., Князефф Дж., Чен Ю., Бурмакина С., Квик М., Буш М., Джавич Дж.А., Пин Дж.П., Фан К.Р. (2012) Структура и функциональное взаимодействие внеклеточного домена человеческого GABA

    B рецептора GBR2. Nat Neurosci 15:970–978

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Geng Y, Bush M, Mosyak L, Wang F, Fan QR (2013)Структурный механизм активации лиганда в рецепторе GABA B человека. Природа 504:254–259

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Goudet C, Kniazeff J, Hlavackova V, Malhaire F, Maurel D, Acher F, Blahos J, Prezeau L, Pin JP (2005) Асимметричное функционирование димерных метаботропных рецепторов глутамата, раскрытое положительными аллостерическими модуляторами. J Biol Chem 280:24380–24385

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Hlavackova V, Goudet C, Kniazeff J, Zikova A, Maurel D, Vol C, Trojanova J, Prézeau L, Pin JP, Blahos J (2005) Доказательства включения одного семиспирального домена при активации димера GPCR.EMBO J 24:499–509

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Huang S, Cao J, Jiang M, Labesse G, Liu J, Pin JP, Rondard P (2011) Междоменные движения при активации метаботропных рецепторов глутамата. Proc Natl Acad Sci USA 108:15480–15485

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Джонс К.А., Боровски Б., Тамм Дж.А., Крейг Д.А., Дуркин М.М., Дай М., Яо В.Дж., Джонсон М., Гунвальдсен С., Хуан Л.И., Тан С., Шен К., Салон Дж.А., Морс К., Лаз Т., Смит KE, Nagarathnam D, Noble SA, Branchek TA, Gerald C (1998) Рецепторы GABA B функционируют как гетеромерная сборка субъединиц GABA B R1 и GABA B R2.Природа 396:674–679

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Kammermeier PJ (2012) Функциональные и фармакологические характеристики метаботропных рецепторов глутамата 2/4 гетеродимеров. Мол Фармакол 82:438–447

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Каупманн К., Маличек Б., Шулер В., Хейд Дж., Фростл В. , Бек П., Мосбахер Дж., Бишофф С., Кулик А., Шигемото Р., Карщин А., Беттлер Б. (1998) GABA B -подтипы рецепторов в сборе в функциональные гетеромерные комплексы.Природа 396: 683–687

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Kniazeff J, Galvez T, Labesse G, Pin JP (2002) Для активации и аллостерического взаимодействия между субъединицами не требуется связывания лиганда в субъединице GB2 рецептора GABA B . J Neurosci 22:7352–7361

    CAS пабмед Google Scholar

  • Kniazeff J, Bessis AS, Maurel D, Ansanay H, Prézeau L, Pin JP (2004) Закрытое состояние обоих связывающих доменов гомодимерных рецепторов mGlu необходимо для полной активности.Nat Struct Mol Biol 11:706–713

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Кунисима Н., Шимада Ю., Цудзи Ю., Сато Т., Ямамото М. , Кумасака Т., Наканиши С., Джингами Х., Морикава К. (2000) Структурная основа распознавания глутамата димерным метаботропным рецептором глутамата. Природа 407:971–977

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Margeta-Mitrovic M, Jan YN, Jan LY (2000) Контрольно-пропускной пункт контролирует гетеродимеризацию ГАМК B рецептора.Нейрон 27:97–106

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Margeta-Mitrovic M, Jan YN, Jan LY (2001a) Функция субъединиц GB1 и GB2 в связывании G-белка с рецепторами GABA B . Proc Natl Acad Sci USA 98:14649–14654

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Margeta-Mitrovic M, Jan YN, Jan LY (2001b) Лиганд-индуцированная передача сигнала в гетеродимерном GABA B рецепторе.Proc Natl Acad Sci USA 98:14643–14648

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Maurel D, Comps-Agrar L, Brock C, Rives ML, Bourrier E, Ayoub MA, Bazin H, Tinel N, Durroux T, Prézeau L, Trinquet E, Pin JP (2008) Белок-белок клеточной поверхности анализ взаимодействия с технологиями FRET и snap-tag с временным разрешением: приложение к олигомеризации GPCR. Nat Methods 5:561–567

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Monnier C, Tu H, Bourrier E, Vol C, Lamarque L, Trinquet E, Pin JP, Rondard P (2011) Трансактивация между доменами 7TM: участие в гетеродимерной активации GABA B рецептора.EMBO J 30:32–42

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Muto T, Tsuchiya D, Morikawa K, Jingami H (2007)Структуры внеклеточных областей метаботропных глутаматных рецепторов группы II/III. Proc Natl Acad Sci USA 104:3759–3764

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Нельсон Г., Хун М.А., Чандрашекар Дж., Чжан Ю., Рыба Н.Дж., Цукер К.С. (2001) Рецепторы сладкого вкуса млекопитающих.Сотовый 106: 381–390

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Нельсон Г. , Чандрашекар Дж., Хун М.А., Фэн Л., Чжао Г., Рыба Н.Дж., Цукер К.С. (2002) Аминокислотный вкусовой рецептор. Природа 416:199–202

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Niswender CM, Jones CK, Lin X, Bubser M, Thompson Gray A, Blobaum AL, Engers DW, Rodriguez AL, Loch MT, Daniels JS, Lindsley CW, Hopkins CR, Javitch JA, Conn PJ (2016) Разработка и противопаркинсоническая активность VU0418506, селективного положительного аллостерического модулятора 4 гомомеров метаботропного рецептора глутамата без активности в отношении гетеромеров mGlu 2/4 .ACS Chem Neurosci 7:1201–1211

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Olofsson L, Felekyan S, Doumazane E, Scholler P, Fabre L, Zwier JM, Rondard P, Seidel CA, Pin JP, Margeat E (2014) Тонкая настройка субмиллисекундной конформационной динамики контролирует эффективность агонистов метаботропных глутаматных рецепторов . Национальная коммуна 5:5206

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Пагано А., Ровелли Г., Мосбахер Дж., Ломанн Т., Дути Б., Штауффер Д., Ристиг Д., Шулер В., Мейгель И., Ламперт С., Штейн Т., Презо Л., Блахос Дж., Пин Дж., Фростл В., Кун R, Heid J, Kaupmann K, Bettler B (2001)С-концевое взаимодействие необходимо для переноса на поверхность, но не для гетеромерной сборки рецепторов GABA B .J Neurosci 21:1189–1202

    CAS пабмед Google Scholar

  • Pin JP, Bettler B (2016) Организация и функции рецепторных комплексов mGlu и GABA B . Природа 540:60–68

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Prosser HM, Gill CH, Hirst WD, Grau E, Robbins M, Calver A, Soffin EM, Farmer CE, Lanneau C, Gray J, Schenck E, Warmerdam BS, Clapham C, Reavill C, Rogers DC, Sean T, Upton N, Humphreys K, Randall A, Geppert M, Davies CH, Pangalos MN (2001)Эпилептогенез и усиленное ингибирование предимпульса у мышей с дефицитом GABA B1 . Mol Cell Neurosci 17:1059–1070

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Queva C, Bremner-Danielsen M, Edlund A, Ekstrand AJ, Elg S, Erickson S, Johansson T, Lehmann A, Mattsson JP (2003) Влияние агонистов ГАМК на регуляцию температуры тела при ГАМК -/- B(1) мышей. Br J Pharmacol 140:315–322

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Robbins MJ, Calver AR, Filippov AK, Hirst WD, Russell RB, Wood MD, Nasir S, Couve A, Brown DA, Moss SJ, Pangalos MN (2001) GABA B2 необходим для связывания g-белка гетеродимера рецептора GABA B .J Neurosci 21:8043–8052

    CAS пабмед Google Scholar

  • Шулер В., Люшер С., Бланше С., Кликс Н., Сансиг Г., Клебс К., Шмутц М., Хайд Дж., Джентри С., Урбан Л., Фокс А. , Спурен В., Джейтон А.Л., Вигуре Дж., Поцца М., Келли PH, Mosbacher J, Froestl W, Kaslin E, Korn R, Bischoff S, Kaupmann K, van der Putten H, Bettler B (2001)Эпилепсия, гипералгезия, нарушение памяти и потеря пре- и постсинаптических ответов GABA B в мыши, лишенные ГАМК B(1) .Нейрон 31:47–58

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Швенк Дж., Мец М., Золлес Г., Туречек Р., Фрициус Т., Билдл В., Тарусава Э., Кулик А., Унгер А., Иванкова К., Седдик Р., Тиао Дж.Ю., Раджалу М., Троянова Дж., Роде В., Гассманн M, Schulte U, Fakler B, Bettler B (2010) Нативные рецепторы GABA B представляют собой гетеромультимеры с семейством вспомогательных субъединиц. Природа 465:231–235

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Suzuki Y, Moriyoshi E, Tsuchiya D, Jingami H (2004) Отрицательная кооперативность связывания глутамата в димерном метаботропном рецепторе глутамата подтипа 1. J Biol Chem 279:35526–35534

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Tateyama M, Kubo Y (2011) Механизмы внутримолекулярной активации димерного метаботропного глутаматного рецептора 1 различаются в зависимости от типа G-белков. Нейрофармакология 61:832–841

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Вафабахш Р., Левитц Дж., Исаков Э.Ю. (2015)Конформационная динамика рецептора, связанного с G-белком класса C.Природа 524:497–501

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Vischer HF, Castro M, Pin JP (2015)Мультимеры рецепторов, связанных с G-белком: вопрос все еще остается открытым, несмотря на использование новых подходов. Мол Фармакол 88:561–571

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • White JH, Wise A, Main MJ, Green A, Fraser NJ, Disney GH, Barnes AA, Emson P, Foord SM, Marshall FH (1998) Гетеродимеризация необходима для образования функционального ГАМКВ-рецептора. Природа 396:679–682

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Wu H, Wang C, Gregory KJ, Han GW, Cho HP, Xia Y, Niswender CM, Katritch V, Meiler J, Черезов V, Conn PJ, Stevens RC (2014) Структура метаботропного глутамата GPCR класса C рецептор 1 связан с аллостерическим модулятором. Наука 344:58–64

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Xu H, Staszewski L, Tang H, Adler E, Zoller M, Li X (2004) Различные функциональные роли субъединиц T1R в гетеромерных вкусовых рецепторах.Proc Natl Acad Sci USA 101:14258–14263

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Сюэ Л., Ровира Х., Шоллер П., Чжао Х., Лю Дж., Пин Дж. П., Рондард П. (2015) Основная лиганд-индуцированная перестройка интерфейса семиспирального домена в димере GPCR. Nat Chem Biol 11:134–140

    CAS Статья пабмед Google Scholar

  • Yin S, Noetzel MJ, Johnson KA, Zamorano R, Jalan-Sakrikar N, Gregory KJ, Conn PJ, Niswender CM (2014)Избирательное действие новых аллостерических модуляторов выявляет функциональные гетеромеры метаботропных рецепторов глутамата в ЦНС. J Neurosci 34: 79–94

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Zhao GQ, Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Erlenbach I, Ryba NJ, Zuker CS (2003) Рецепторы сладкого вкуса и вкуса умами у млекопитающих. Сотовый 115: 255–266

    CAS Статья пабмед Google Scholar

    • Конформационная динамика рецептора, сопряженного с G-белком, класса C

    Abstract

    Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), составляют самое большое семейство мембранных рецепторов у эукариот.Кристаллические структуры дали представление о взаимодействии GPCR с лигандами и G-белками 1,2 , но наше понимание конформационной динамики активации является неполным. Метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) представляют собой димерные GPCR класса C, которые модулируют возбудимость нейронов, синаптическую пластичность и служат лекарственными мишенями при неврологических расстройствах 3,4 . Лиганд-связывающий домен «раскладушка» (LBD), который содержит сайт связывания лиганда, связан с трансмембранным доменом (TMD) через домен, богатый цистеином, и закрытие LBD, по-видимому, является первым шагом в активации 5,6 .Кристаллические структуры выделенных димеров LBD mGluR привели к предположению, что активация также включает переориентацию интерфейса димера из «расслабленного» в «активное» состояние 7,8 , но взаимосвязь между связыванием лиганда, закрытием LBD и интерфейсом димера перегруппировка в активации остается неясной. Мы использовали одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции (smFRET) для исследования механизма активации полноразмерных mGluR группы II млекопитающих. Мы обнаружили, что LBD взаимопревращаются между тремя конформациями: в покое, в активированном состоянии и в короткоживущем промежуточном состоянии.Ортостерические агонисты индуцируют переходы между этими конформационными состояниями с эффективностью, определяемой занятостью активной конформации. В отличие от mGluR2, mGluR3 демонстрирует базальную динамику, которая зависит от Ca 2+ и приводит к базовой активации белка. Наши результаты подтверждают общий механизм активации mGluR, при котором связывание агониста вызывает закрытие LBD с последующей переориентацией интерфейса димера. Наша экспериментальная стратегия должна широко применяться для изучения конформационной динамики GPCR и других мембранных белков.

    smFRET-спектроскопия является мощным инструментом для исследования конформационных изменений белков с высоким разрешением 9 и недавно была применена для изучения мембранных белков 10,11,12 . Чтобы визуализировать лиганд-индуцированные перестройки полноразмерных mGluR, мы использовали ранее описанные N-концевые SNAP- или CLIP-меченые белки (), позволяющие селективно и ортогонально вводить либо донорный, либо акцепторный флуорофор FRET в каждую субъединицу димера, вблизи ЛБД 13,14 .Электрофизиологические записи в клетках, коэкспрессирующих G-белок-управляемый калиевый канал внутреннего выпрямления (GIRK), показали, что эти конструкции были физиологически функциональными (4). SNAP-mGluR2 и CLIP-mGluR2 экспрессировали в клетках HEK293T и метили флуорофорами FRET-донора (DY-547) и акцептора (Alexa-647) соответственно (методы) (). Глутамат индуцировал зависимое от концентрации уменьшение ансамбля FRET (), как показано ранее 15 . Для анализа smFRET мы использовали анализ одной молекулы (SiMPull) 16 с анти-С-концевым антителом для in situ иммуноочистку меченых рецепторов из клеточного лизата HEK293T с последующей флуоресцентной микроскопией полного внутреннего отражения (; ).Пулл-даун был специфичным, mGluR2 оставался димером после пулл-дауна () и не было перекрестного мечения между метками SNAP и CLIP ().

    Анализ FRET с одной молекулой выявляет три конформации пути активации mGluR2

    a, Кристаллические структуры mGluR1 в «расслабленном» (PDB ID: 1EWT) и «активном» состояниях (PDB ID: IEWK) показывают увеличение на расстоянии между N-концами при активации. Зеленые и красные овалы показывают приблизительное положение тегов SNAP и CLIP. b, Схема измерений FRET одной молекулы. c, Графики интенсивности донора (зеленый) и акцептора (красный) во времени и график FRET (синий) в отсутствие (вверху) или в присутствии (внизу) 1 мМ глутамата показывают снижение FRET в присутствии насыщающего глутамата. d, Репрезентативные кривые smFRET при 4 мкМ глутамата показывают быструю динамику между 3 состояниями. Подгонка с тремя состояниями, полученная из скрытого марковского анализа, накладывается на отфильтрованные необработанные данные. e, гистограммы smFRET в присутствии диапазона концентраций глутамата или конкурентного антагониста ({«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″ ,»term_text»:»LY341495″}}LY341495).Синие линии показывают глобальные 3-компонентные гауссовы соответствия, которые показывают высокое (~ 0,45), среднее (~ 0,35) и низкое (0,2) состояния FRET. Сумма всех трех компонентов показана красным цветом. f, Кривая титрования для низкого пика FRET г, Графики взаимной корреляции показывают ограниченную динамику в отсутствие глутамата (черный) или при насыщении глутамата (1 мМ, зеленый), но усиленную динамику при промежуточных концентрациях (8 мкМ , пурпурный). ч, Зависимость от концентрации времени пребывания на низком уровне FRET, полученная из анализа времени пребывания. i , Графики плотности FRET, построенные из синхронизированных переходов от высокого к низкому состоянию FRET, показывают короткое время пребывания на среднем уровне FRET (желтая рамка). Столбики погрешностей

    В отсутствие глутамата эффективность smFRET составляла ~0,45 (вверху), а насыщение глутаматом (1 мМ) приводило к смещению эффективности smFRET до ~0,2 (внизу), что соответствовало совокупности FRET (). Оба состояния 0 и 1 мМ глутамата были стабильны в пределах нашего временного разрешения (30 мс) с небольшими переходами на другие уровни FRET.Однако при промежуточных концентрациях глутамата mGluR2 демонстрировал быстрые переходы между тремя различными состояниями: уровень FRET 0,45 (высокий), наблюдаемый в глутамате 0, уровень FRET 0,2 (низкий), наблюдаемый в глутамате 1 мМ, и кратковременный уровень FRET 0,35 (средний). Уровень FRET (; ). Конкурентный антагонист {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 дал аналогичную гистограмму FRET по сравнению с наблюдаемым в 0 глутамате: основной высокий пик FRET (0,45) и второстепенный средний пик FRET (~ 0,45).35) (, низ). Около 20% индивидуальных траекторий FRET показали посещение низкого состояния FRET в 0-глутамате (), но эти переходы были редкими и короткими и, таким образом, почти не обнаруживались на гистограммах FRET (вверху). Контрольные эксперименты с антителом против N-конца mGluR2 вместо С-конца показали идентичные гистограммы (). Кроме того, применение GTP или апиразы, соответственно, для содействия ассоциации рецептора или диссоциации от G-белков не изменяет гистограммы smFRET (1), указывая на то, что G-белки не ко-иммунопреципитируются с mGluR2.

    Поскольку mGluR2 не индуцирует передачу сигналов G-белка в 0-глутамате или в {«type»:»entrez-нуклеотиде»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text» :»LY341495″}}LY341495 (), мы предположили, что высокие и средние состояния FRET представляют собой функционально неактивные конформации и что низкое состояние FRET соответствует активному состоянию. В соответствии с этой интерпретацией зависимость глутамата от концентрации в состоянии низкого уровня FRET имела EC 50 5,7 ± 0,3 мкМ (; ), что соответствует зависимости активации тока GIRK от концентрации в клетках HEK293T (3.2 ± 0,3 мкМ) (). Более того, глутамат не влиял на гистограмму FRET у нечувствительного к глутамату мутанта mGluR2-YADA (Y216A и D295A) 17 (). Наконец, добавление {«type»:»entrez-нуклеотида»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 к глутамату отменило низкое состояние FRET (). Эти наблюдения подтверждают отнесение низкого пика FRET к активной конформации.

    Затем мы количественно определили колебания, вызванные глутаматом, с помощью анализа взаимной корреляции и времени пребывания.Амплитуда взаимной корреляции сигналов донора и акцептора увеличивалась с увеличением концентрации глутамата, достигая максимума вблизи ЕС 50 и уменьшаясь при высоких концентрациях глутамата (1). Антикорреляция между донором и акцептором практически исчезала при насыщении глутаматом (1 мМ), что подтверждает стабилизацию активного состояния. Кинетический анализ отдельных следов показал время пребывания в активном состоянии ~ 84 мс, которое почти не зависело от концентрации глутамата (;), предполагая, что время пребывания в активном состоянии отражает скорость диссоциации глутамата и присущую стабильность активной конформации.Двумерные гистограммы, полученные из синхронизированных переходов в состояние низкого FRET или из него, показали короткую задержку при среднем значении FRET ~ 0,35, что дает дополнительные доказательства того, что это состояние является промежуточным в пути активации (;).

    Затем мы исследовали взаимосвязь между эффективностью лиганда и конформацией рецептора. Мы изучили два агониста mGluR группы II, эффективность которых отличается от эффективности глутамата () 15 . В то время как DCG-IV увеличивал заполнение состояния низкого FRET, даже при насыщающих концентрациях (≥100 мкМ), состояние низкого FRET не было полностью заполнено, и ~ 30% распределения оставалось в состояниях высокого и среднего FRET (). Следы отдельных молекул в насыщающем DCG-IV показали повторяющиеся переходы из состояния низкого FRET (;). Напротив, полный агонист {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY379268″,»term_id»:»1257807854″,»term_text»:»LY379268″}}LY379268 заселен те же три состояния FRET, но с более полной занятостью активного состояния, чем у глутамата (; ). В соответствии с этими результатами кросс-корреляционный анализ показал, что mGluR2 сохранил существенную динамику в насыщении DCG-IV, но не в насыщении глутаматом или {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY379268″ ,»term_id»:»1257807854″,»term_text»:»LY379268″}}LY379268 ().Интересно, что при концентрациях, которые давали сравнимую занятость в низком состоянии FRET (), взаимный корреляционный анализ показал, что {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY379268″,»term_id»: «1257807854»,»term_text»:»LY379268″}}LY379268 вызывал более длительные колебания временной шкалы и более длительное время пребывания в активном состоянии, чем глутамат и DCG-IV (; ). Двумерные гистограммы показали, что и DCG-IV, и {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY379268″,»term_id»:»1257807854″,»term_text»:»LY379268″ }}LY379268, подобно глутамату, посещает среднее состояние FRET в качестве промежуточного звена во время активации ().Таким образом, в отличие от ионотропных рецепторов, где эффективность агониста зависит от степени закрытия LBD 18 , в mGluR2 агонисты с разной эффективностью стабилизируют одни и те же конформационные состояния, при этом степень эффективности зависит от занятости одного активная конформация. Данные свидетельствуют о том, что эффективность лиганда больше зависит от скорости перехода в активное состояние, чем от времени пребывания в активном состоянии, 90–407, т. е. 90–408, что агонисты различаются по тому, как они вызывают закрытие LBD и последующую переориентацию.Кроме того, mGluR2-специфический положительный аллостерический модулятор, LY48739, и мутации TMD Q679V и C770A 19,20 , которые все увеличивают эффективность DCG-IV, также увеличивали относительную занятость состояния низкого FRET (), что еще больше подтверждает роль занятости в активном состоянии в определении эффективности агониста и подтверждение того, что иммобилизованные рецепторы сохраняют функцию TMD и связь с LBD.

    Конформационная основа частичного агонизма mGluR2

    a, Ансамбль FRET-титрования в клетках HEK 293T, экспрессирующих mGluR2, в присутствии глутамата (красный), DCG-IV (синий) или {«type»:»entrez-нуклеотид» ,»attrs»:{«text»:»LY379268″,»term_id»:»1257807854″,»term_text»:»LY379268″}}LY379268 (черный).Значения FRET в каждом состоянии нормированы на реакцию на 1 мМ глутамата. b, smFRET гистограмма для DCG-IV показывает те же 3 состояния, что и для глутамата (пунктирные линии), с дозозависимой занятостью низкого состояния FRET. c, Репрезентативная кривая smFRET показывает переходы из состояния низкого FRET в насыщающем DCG-IV. d, Графики кросс-корреляции для динамики насыщения агонистом показывают = DCG-IV > глутамат > {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY379268″,»term_id»:»1257807854 «,»term_text»:»LY379268″}}LY379268. e, smFRET гистограммы для насыщения агонистом; занятость низкого состояния FRET = DCG-IV < глутамат < {"type":"entrez-нуклеотид","attrs":{"text":"LY379268","term_id":"1257807854","term_text":" LY379268"}}LY379268 (вставка). фг, При концентрациях, которые приводят к сопоставимой популяции в активном состоянии, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY379268″,»term_id»:»1257807854″,»term_text «:»LY379268»}}LY379268 вызывает более медленную динамику, чем DCG-IV и глутамат, как показано на кросс-корреляции (f) и репрезентативных кривых smFRET (g). ч, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY379268″,»term_id»:»1257807854″,»term_text»:»LY379268″}}LY379268 индуцирует значительно более продолжительное низкое Время пребывания в состоянии FRET по сравнению с глутаматом и DCG-IV (двусторонний Т-критерий, P = 0,0084). Столбики погрешностей

    Затем мы задались вопросом, применимы ли свойства mGluR2 к другим mGluR. Мы обратились к другому mGluR группы II, mGluR3, который обладает примерно 70% идентичностью последовательности с mGluR2. Конструкции mGluR3 с меткой SNAP или CLIP были физиологически функциональными () и подвергались зависимому от глутамата снижению FRET ансамбля, аналогичному mGluR2, но с более низкой EC 50 (0,00017). 5 ± 0,2 мкМ). Поразительно, что траектории одиночных молекул mGluR3 в 0-глутамате демонстрировали частые переходы между тремя состояниями FRET (вверху), что приводило к заполнению ~30% активного состояния с низким FRET (), которое было устранено с помощью {«type»:»entrez- нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 (, внизу; ). {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 вызывал значительное снижение содержания глутамата Ток GIRK (;) и ансамбль FRET () в клетках, экспрессирующих mGluR3, но не в клетках, экспрессирующих mGluR2, что указывает на то, что, в отличие от mGluR2, mGluR3 обладает базовой активностью.Важно отметить, что распределение mGluR3 по 0-глутамату smFRET было нечувствительным к GTP, что указывает на то, что различная базовая активность mGluR3 не связана с ассоциацией с G-белком (14).

    mGluR3 имеет высокую базальную структурную динамику и активность

    a, Репрезентативные mGluR3 smFRET-следы показывают базальную динамику в отсутствие глутамата (вверху), которые устраняются конкурентным антагонистом {«type»:»entrez-нуклеотид»,» attrs»:{«текст»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 (внизу). b, В клетках HEK293T, коэкспрессирующих каналы GIRK, mGluR3 обладает базовой активностью в отсутствие глутамата, которая блокируется {«type»:»entrez-нуклеотидом»,»attrs»:{«text»:»LY341495″ ,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495. c, Базальная активность ([I LY341495 ]/([I LY341495 ] +[I Glu ]) для mGluR2 и mGluR3. -хвостый Т-критерий; р = 0,0097). d, Гистограммы smFRET для mGluR3 показывают занятость низкого состояния FRET, которое устраняется удалением Ca 2+ или введением мутации S152D. e, Репрезентативные кривые smFRET для mGluR3 в отсутствие Ca 2+ либо с 0 (вверху), либо с насыщением (внизу) глутаматом . f, Графики взаимной корреляции для mGluR3. г–ч, Время пребывания активного состояния для mGluR3 в присутствии глутамата (100 нМ) или Са 2+ (2 мМ) по сравнению с mGluR2 (4 мкМ глутамата) (непарный, двусторонний Т-критерий , р=0. 00055). Столбики погрешностей

    В более ранних работах предполагалось, что некоторые mGluR, включая mGluR3, но не mGluR2, чувствительны к кальцию 21 . Однако прямое связывание Ca 2+ было поставлено под сомнение, и активность Ca 2+ была приписана косвенным нижестоящим сигнальным эффектам 22 . Измерения smFRET mGluR3 в 0 глутамате и 0 Ca 2+ показали значительное снижение базовой динамики и занятости низкого состояния FRET (; ). В 0 глутамате мы наблюдали зависимое от концентрации увеличение Ca 2+ в динамике занятости в низком состоянии FRET ().Напротив, удаление Ca 2+ не изменило свойства smFRET mGluR2 (10). Насыщающий глутамат (0,5 мМ) индуцировал ту же самую гистограмму mGluR3 smFRET в 0 и 2 мМ Ca 2+ , что указывает на то, что Ca 2+ не требуется для полного агонизма mGluR3 (). Подобно ортостерическим агонистам на mGluR2, в mGluR3 Ca 2+ индуцирует временную занятость промежуточного состояния FRET (1). Мутация S152D, которая, как сообщается, устраняет чувствительность Ca 2+ как mGluR1, так и mGluR3 21 , устраняет эффект {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:» LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 на mGluR3 (), что указывает на устранение основной активности.В соответствии с этим, smFRET-анализ mGluR3-S152D выявил значительное снижение базовой низкой FRET-популяции и чувствительности Ca 2+ (; ) и снижение динамики рецепторов (; ). Анализ времени пребывания mGluR3 в присутствии 2 мМ Ca 2+ или 100 нМ глутамата (;) показал среднее время жизни в активном состоянии 183 мс, что значительно больше, чем время жизни ~80 мс в mGluR2 (), что указывает на то, что активный конформация mGluR3 более стабильна, чем у mGluR2. В соответствии с этим временная шкала взаимной корреляции донора и акцептора для mGluR3 во всех условиях была намного медленнее, чем для mGluR2 (10).В целом измерения smFRET показали, что mGluR3 переходит между теми же тремя состояниями FRET, что и mGluR2. Однако, в отличие от mGluR2, mGluR3 чувствителен к Ca 2+ и поэтому активен в основном в физиологических условиях.

    Обнаружив три лиганд-зависимых состояния FRET в LBD как mGluR2, так и mGluR3, мы стремились идентифицировать основные конформационные перестройки в пути активации. Доступные структуры LBD mGluR были охарактеризованы как «расслабленные», когда нижние доли LBD расположены далеко друг от друга, или как «активные», когда нижние доли LBD расположены ближе друг к другу (; ).Мы предположили, что электростатические взаимодействия между заряженными остатками в нижней доле, включая консервативный лизин (K240 в mGluR2), стабилизируют активную конформацию. Действительно, нейтрализация K240 (K240A) снижала кажущуюся аффинность к глутамату как в анализе активации ансамбля FRET, так и в анализе активации GIRK в клетках. В анализе smFRET даже при насыщающих концентрациях глутамата (10 мМ) этот мутант заселял низкое состояние FRET меньше, чем mGluR2 дикого типа (WT) (10). Траектории отдельных молекул показали частые переходы из состояния низкого FRET в состояние насыщения глутамата (;), что согласуется с дестабилизацией активного состояния.Эти результаты подтверждают идею о том, что нижние доли mGluR2 сближаются в активном состоянии и помогают его стабилизировать.

    Модель активации mGluR с тремя состояниями

    a–b, Мутация остатка K240 на границе раздела димера LBD нижней доли (синий маркер) (a) снижает занятость состояния low FRET при насыщении (10 мМ) глутаматом . (б). c, Репрезентативные кривые smFRET для K240A в присутствии глутамата показывают переходы из состояния низкого FRET. d – e, Гетеродимеры WT mGluR2 и глутамат-нечувствительный мутант mGluR2 (YADA) (d) демонстрируют повышенную занятость среднего состояния FRET (e). f, Репрезентативные кривые smFRET для гетеродимеров WT/YADA показывают переходы между высоким и средним состояниями FRET с ограниченным переходом в низкое состояние FRET. g, Структурная модель mGluR с тремя состояниями, основанная на внутрисубъединичных (от закрытого «C» до открытого «O») и межсубъединичных (от расслабленного «R» до активного «A») конформационных изменениях. Столбики погрешностей s.Эм.

    Затем мы исследовали конформации, соответствующие высокому (0,45) и среднему (0,35) состояниям FRET. Принимая во внимание сравнительно небольшое изменение расстояния между высоким и средним состояниями FRET (~ 4 Å) по сравнению со средним и низким состояниями FRET (~ 8 Å), а также наблюдение, что среднее состояние FRET кажется неактивным, мы предположили, что среднее состояние соответствует к «расслабленной» конформации, когда закрыт только один LBD. Если это так, ожидается, что гетеродимер mGluR2, состоящий из субъединицы WT и субъединицы YADA (WT/YADA), будет связывать глутамат только в LBD WT и, следовательно, заполнять среднее состояние FRET больше, чем гомодимер WT.Анализ smFRET показал, что при концентрациях субъединицы WT, близких к насыщению, WT/YADA имел ~ 55% занятости среднего состояния FRET, тогда как WT/WT имел максимальную среднюю заполняемость FRET ~ 25% (;). В отличие от монофазной зависимости занятости состояния низкого FRET от концентрации, наблюдаемой у WT mGluR2 (1), WT/YADA продемонстрировал двухфазное распределение (2), напоминающее ранее описанную дозозависимую активацию эффектора гетеродимером WT/YADA mGluR5. 19 , и поддерживая присвоение конформации low smFRET активному состоянию.Кривые smFRET при 50 мкМ глутамата показали многочисленные переходы между высоким и средним состояниями FRET с редкими и краткими посещениями низкого состояния FRET (;), что согласуется с активностью этого гетеродимера и, возможно, из-за случайного связывания глутамата с субъединицей YADA. или спонтанное закрытие субъединицы YADA в отсутствие глутамата.

    Наш кинетический, мутационный и функциональный анализы показывают, что mGluR2 и mGluR3 подвержены лиганд-зависимым колебаниям между тремя конформациями: покоящейся и неактивной конформацией OO/R, активной конформацией CC/A и промежуточной неактивной короткоживущей конформацией CO/R ( ). Относительная нестабильность промежуточной конформации может объяснить, почему кристаллические структуры не были получены в состоянии C-O/R. Электростатические взаимодействия на интерфейсе LBD нижней доли стабилизируют активное состояние, предполагая, что для активации mGluR требуется закрытие обоих LBD с последующей перестройкой димерного интерфейса (1), и это согласуется с выводами о том, что для активации требуется реориентация нижестоящего уровня на межсубъединичных интерфейсах между доменами, богатыми цистеином. и TMD 23,24, 25,26 .Мы наблюдали время заполнения от десятков миллисекунд до секунд — на шкале времени передачи сигналов G-белком 27 — как для конформаций O-O/R, так и для конформаций C-C/A. Это дольше субмиллисекундных флуктуаций, наблюдаемых в изолированных LBD с использованием FRET 28 на основе диффузии, что позволяет предположить, что TMD интактного рецептора стабилизирует LBD в состояниях R и A, давая рецепторам широкий динамический диапазон активности. Наши данные свидетельствуют о том, что фракционная занятость конформации CC/A определяет эффективность агониста, что согласуется со спектроскопией отдельных молекул LBD 28 и кристаллическими структурами, где степень закрытия аналогична для полных и частичных агонистов 18,19,29 .Наконец, мы выявили кинетические различия между mGluR2 и mGluR3 и обнаружили, что mGluR3 имеет более стабильное активное состояние и активируется физиологическими концентрациями внешнего Ca 2+ , что приводит к значительной базовой передаче сигналов G-белка в клетках. Наше исследование обеспечивает основу для изучения механизмов активации других двухлопастных LBD моллюсков, таких как рецептор GABA B и рецепторы ионотропных нейротрансмиттеров.

    Онлайн-методы

    Культура клеток

    Клетки HEK293T культивировали в среде DMEM с 5% FBS на покровных стеклах, покрытых поли-L-лизином.Клетки HEK 293T были получены из центра культивирования тканей MCB Калифорнийского университета в Беркли, аутентифицированы DDC Medical и дали отрицательный результат на заражение микоплазмой. Ранее описанная кДНК mGluR крысы, меченная HA-SNAP и FLAG-CLIP, была предоставлена ​​Jean-Phillipe Pin (IGF-Monpellier). Плазмиды ДНК трансфицировали в клетки с использованием липофектамина 2000 (Sigma). Для электрофизиологических экспериментов клетки трансфицировали WT-mGluR2 или WT-mGluR3, GIRK1-F137S и YFP (в качестве маркера трансфекции) в соотношении 7:7:1 с 0.7 мкг плазмиды/лунка для рецептора и канала. Для экспериментов FRET клетки трансфицировали SNAP- и CLIP-мечеными конструкциями в соотношении 1:2 с 0,3 мкг ДНК SNAP-mGluR/лунку.

    Пэтч-клэмп-электрофизиология

    Пэтч-клэмп-записи целых клеток из отдельных изолированных клеток проводили через 24–48 часов после трансфекции во внеклеточном растворе с высоким содержанием калия, содержащем (в мМ): 120 KCl, 29 NaCl, 1 MgCl 2 , 2 CaCl 2 и 10 HEPES, pH 7,4. Клетки ограничивали напряжением до -60 мВ с использованием усилителя Axopatch 200B (Axon Instruments) и регистрировали мембранные токи.Стеклянные пипетки сопротивлением от 3 до 8 МОм заполняли внутриклеточным раствором, содержащим (в мМ): 140 KCl, 10 HEPES, 3 Na 2 АТФ, 0,2 Na 2 GTP, 5 EGTA и 3 MgCl 2 , pH 7. 4. Данные были получены с частотой сбора данных 2 кГц и отфильтрованы с помощью 4-полюсного фильтра Бесселя усилителя на частоте 1 кГц. Сбор и анализ данных проводили с использованием программного обеспечения pCLAMP 10 (Axon Instruments).

    Ensemble FRET

    Через 24–48 часов после трансфекции клетки метили, прикрепив их к покровным стеклам, покрытым поли-L-лизином.Культуральную среду удаляли, покровные стекла промывали и переносили во внеклеточный раствор, содержащий (в мМ): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , 10 HEPES, pH 7,4. Клетки метили при 37°C 2,5 мкМ бензилгуанина Alexa-647 (NEB) в течение 45 минут, а затем 5 мкМ бензилцитозина DY-547 (NEB) в течение 45 минут. Флуорофоры разводили во внеклеточном растворе и покровные стекла промывали между мечением донором и акцептором. После мечения клетки помещали в вертикальный сканирующий конфокальный микроскоп (Zeiss LSM 780) и визуализировали с помощью объектива с 20-кратным увеличением.Возбуждение донора осуществляли с помощью лазера с длиной волны 561 нм, а изображения снимали в донорном и акцепторном каналах с частотой 1 Гц. Кластеры клеток анализировали вместе и FRET рассчитывали как FRET=(I Акцептор )/(I Донор +I Акцептор ), где I представляет собой интенсивность флуоресценции. Для отдельных следов FRET нормализовали к базовому значению FRET, наблюдаемому до применения каких-либо препаратов. Изменения FRET, рассчитанные для кривых доза-реакция, были нормализованы к насыщению глутамата (1 мМ), а кривые доза-реакция были получены для нескольких кластеров клеток и усреднены по крайней мере из 3 экспериментов.Подгонку кривых доза-реакция проводили с помощью Prism (Graphpad). Все препараты были приобретены у Tocris и доставлены с помощью гравитационной перфузионной системы.

    Измерения smFRET

    Для ингибирования неспецифической адсорбции белка проточные ячейки для экспериментов с одиночными молекулами готовили, как описано ранее, с использованием покровных стекол mPEG (Laysan Bio), пассивированного стекла (VWR) и легированного биотином PEG 16 . Перед каждым экспериментом покровные стекла инкубировали с NeutrAvidin (Thermo), а затем с 10 нМ биотинилированными вторичными антителами (ослиные антикроличьи, Jackson ImmunoResearch).Для иммуноочистки рецептора в камере инкубировали либо 10 нМ первичного антитела против mGluR2 (Cell Signaling, #12056), либо 10 нМ антитела против mGluR3 (abcam), либо 15 нМ антитела против HA (abcam, #ab26228). Между каждым этапом конъюгации камеры промывали для удаления свободных реагентов. Разведения и отмывки антител проводили в буфере Т50 (50 мМ NaCl, 10 мМ Трис, рН 7,5).

    Для экспериментов с отдельными молекулами свежие клетки, экспрессирующие меченые конструкции mGluR, метили, как описано выше.После мечения клетки извлекали из покровных стекол путем инкубации с буфером PBS, не содержащим Ca 2+ , в течение 20–30 минут с последующим осторожным пипетированием. Затем клетки осаждали и лизировали в буфере для лизиса, состоящем из 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, смеси ингибиторов протеазы (Thermo Scientific) и 1,2% IGEPAL (Sigma) или 1% н-додецил-BD-мальтозида (DDM) (Anatrace). . После 1 ч инкубации при 4°С клетки центрифугировали при 16 000 g в течение 20 мин, собирали надосадочную жидкость и хранили на льду. Клеточный лизат разбавляли для достижения редкой иммобилизации меченых рецепторов на поверхности (в диапазоне от 5-кратного до 50-кратного разведения в зависимости от экспрессии и эффективности мечения) и наносили на покровные стекла.После достижения оптимальной поверхностной иммобилизации (~400 молекул в области визуализации 2000 мкм 2 ) несвязанные рецепторы вымывали из проточной камеры, а затем интенсивно промывали проточные ячейки (до 50-кратного объема клетки). Наконец, рецепторы визуализировали в буфере для визуализации, состоящем из (в мМ) 3 Trolox, 120 KCl, 29 NaCl, 2 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , 50 HEPES, 0,04% IGEPAL и системы удаления кислорода (0,8% декстроза, 0,8 мг/мл глюкозооксидазы и 0,02 мг/мл каталазы), рН 7.4. Реагенты были приобретены у Sigma, и все они были класса UltraPure (чистота > 99,99%). Все буферы готовили на дистиллированной воде UltraPure (Invitrogen). Для экспериментов, проведенных в отсутствие Ca 2+ , к буферу для визуализации добавляли 10 мМ EGTA и 1 мМ EDTA. Каталазу разводили в буфере Т50 и пропускали через спин-колонку 3x (BioRad). Чтобы дополнительно гарантировать отсутствие загрязнения глутаматом для экспериментов, проведенных в отсутствие глутамата, раствор для поглощения кислорода обрабатывали глутамин-пировиноградной трансаминазой (Sigma) в присутствии 2 мМ пирувата натрия (Gibco) для удаления возможных следов глутамата.

    Образцы визуализировали с помощью объектива ×60 (Olympus) на флуоресцентном микроскопе полного внутреннего отражения с временным разрешением 30 мс, если не указано иное. Для возбуждения донора или акцептора использовали лазеры с длиной волны 532 нм (Cobolt) и 632 нм (Melles Griot). Эффективность FRET была рассчитана как ( I A — 0,1

    7 I d ) / ( I D + I

    8 A ) Где I D — донор и I A — интенсивность акцептора после вычитания фона.

    Анализ данных smFRET

    Были собраны следы интенсивности отдельных молекул, показывающие фотообесцвечивание одного донора и одного акцептора со стабильной общей интенсивностью в течение более 5 с (20–30% от общего количества молекул на площадь изображения). Отдельные трассы были сглажены с использованием нелинейного фильтра от Haran et al 30 с параметрами фильтра: окно=2, M=2 и p=15. Каждый эксперимент был повторен не менее пяти раз независимо, чтобы обеспечить воспроизводимость результатов, и представлен один набор данных для каждого условия.Гистограммы FRET были составлены, по крайней мере, для 200 молекул в каждом состоянии (временное разрешение 30 мс). Столбики погрешностей на гистограммах представляют стандартную ошибку как минимум шести независимых фильмов. Чтобы убедиться, что трассы разной длины вносят одинаковый вклад, гистограммы отдельных трасс были нормализованы до единицы перед компиляцией. Подгонка под гистограммы производилась в Origin Pro. Синхронизированные графики плотности были построены из выбранных вручную переходов, которые были синхронизированы с точкой данных, где сигнал FRET падает ниже (прямой переход) или выше (обратный переход) порогового значения 0. 3. Доля динамических трасс вычислялась вручную из необработанных трасс smFRET. Каждая молекула, которая демонстрировала хотя бы один FRET-переход (определяемый антикоррелированными изменениями сигналов донора и акцептора) и длилась не менее двух точек данных, считалась имеющей динамику. Анализ времени задержки выполнялся с использованием нефильтрованных трасс, чтобы избежать артефактов сглаживания. Сначала каждый сигнал донора и акцептора был идеализирован до сигнала с двумя состояниями со значением идеализированной интенсивности, полученным из двух основных пиков на гистограмме интенсивности.Затем из идеализированных сигналов донора и акцептора рассчитывали идеализированный FRET и дополнительно анализировали для расчета времени пребывания в активном состоянии. Из-за ограничений временного разрешения измерение времени задержки представляет собой оценку верхнего предела. Все переходы проверялись индивидуально, чтобы убедиться, что переходы FRET были реальными, на основе антикорреляции сигналов интенсивности донора и акцептора при переходе. Количество следов, использованных в анализе времени пребывания для mGlu2 с глутаматом, {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY379268″,»term_id»:»1257807854″,»term_text» :»LY379268″}}LY379268 и DCG-IV — это 53, 61 и 41, полученные как минимум из шести независимых фильмов, а планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку.Анализировалось более 300 переходов в каждом случае. Скрытая марковская подгонка была выполнена с использованием HaMMy 31 . Перекрестная корреляция 32 дна-донорских и акцепторных интенсивных следов τ определяется как CC ( τ ) = < Δi D ( T )

    7 Δi A     ( T + τ )> / (< I D ( T )> + < I A ( T )>) Где Δi D ( T ) = I D ( T ) — < I D ( T )> и Δi A ( T ) = I A ( T ) — 〈 I A ( т )〉. 〈 I D ( t )〉 и 〈 I A ( t )〉 – средние по времени интенсивности донора и акцептора. Вычисление кросс-корреляции выполнялось на тех же кривых, которые использовались для гистограммы. Мы подгоняем данные взаимной корреляции к одной экспоненциальной функции, чтобы получить два параметра: характерное время экспоненты (τ) и амплитуду экспоненты.

    Из-за низкой анизотропии донорных и акцепторных флуорофоров при прикреплении к этим меткам SNAP и CLIP 24 и с учетом их спектрального перекрытия для оценки расстояний был использован радиус Фёрстера, равный 52 Å.

    Структура и распознавание лигандов GPCR класса C

  • George SR, O’Dowd BF, Lee SP . Олигомеризация рецептора, связанного с G-белком, и ее потенциал для открытия лекарств. Nat Rev Drug Discov 2002; 1 : 808–20.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Lagerstrom MC, Schioth HB . Структурное разнообразие рецепторов, связанных с G-белком, и значение для открытия лекарств. Nat Rev Drug Discov 2008; 7 : 339–57.

    ПабМед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Pin JP, Galvez T, Prezeau L . Эволюция, структура и механизм активации рецепторов, связанных с G-белком семейства 3/C. Pharmacol Ther 2003; 98 : 325–54.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Рондар П., Гуде С., Князефф Дж., Пин Дж.П., Презо Л. . Сложность механизма их активации открывает новые возможности для модуляции рецепторов mGlu и GABAB класса CG, связанных с белками. Нейрофармакология 2011; 60 : 82–92.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Урвайлер С . Аллостерическая модуляция рецепторов, связанных с G-белком семейства C: от молекулярного понимания до терапевтических перспектив. Pharmacol Ред. 2011 г.; 63 : 59–126.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Князефф Дж., Презо Л., Рондар П., Пин Дж. П., Гуде К. .Димеры и не только: функциональные загадки GPCR класса C. Pharmacol Ther 2011; 130 : 9–25.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Конн П.Дж., Кристопулос А., Линдсли К.В. Аллостерические модуляторы GPCR: новый подход к лечению расстройств ЦНС. Nat Rev Drug Discov 2009; 8 : 41–54.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Конн П.Дж.Пин J-P. Фармакология и функции метаботропных рецепторов глутамата. Annue Rev Pharmacol Toxicol 1997; 37 : 205–37.

    КАС Google Scholar

  • Нисвендер К. М., Конн П.Дж. Метаботропные рецепторы глутамата: физиология, фармакология и болезни. Annue Rev Pharmacol Toxicol 2010; 50 : 295–322.

    КАС Google Scholar

  • Пин JP, Acher F .Метаботропные рецепторы глутамата: структура, механизм активации и фармакология. Лекарство Curr нацелено на неврологическое расстройство ЦНС 2002; 1 : 297–317.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Джонсон К.А., Конн П.Дж., Нисвендер К.М. Глутаматные рецепторы как терапевтические мишени при болезни Паркинсона. Лекарственные препараты для лечения нейролептиков ЦНС 2009; 8 : 475–91.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Долен Г., Карпентер Р.Л., Окаин Т.Д., Медведь М.Ф.Основанные на механизмах подходы к лечению ломкой X. Pharmacol Ther 2010; 127 : 78–93.

    ПабМед Google Scholar

  • Марьино М.Дж. Уильямс Д.Л. младший, О’Брайен Дж.А., Валенти О., Макдональд Т.П., Клементс М.К., и др. . Аллостерическая модуляция метаботропного глутаматного рецептора 4 группы III: потенциальный подход к лечению болезни Паркинсона. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100 : 13668–73.

  • Конн П.Дж., Линдсли К.В., Джонс К.К. Активация метаботропных рецепторов глутамата как новый подход к лечению шизофрении. Trends Pharmacol Sci 2009; 30 : 25–31.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Беттлер Б., Тиао Д.Ю. Молекулярное разнообразие, трафик и субклеточная локализация ГАМКВ-рецепторов. Pharmacol Ther 2006; 110 : 533–43.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Джонс К. А., Боровски Б., Тамм Дж.А., Крейг Д.А., Дуркин М.М., Дай М., и др. . Рецепторы ГАМКВ функционируют как гетеромерная сборка субъединиц GABABR1 и GABABR2. Природа 1998; 396 : 674–79.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Каупманн К., Маличек Б., Шулер В., Хайд Дж., Фростл В., Бек П., и др. .Подтипы ГАМКВ-рецепторов собираются в функциональные гетеромерные комплексы. Природа 1998; 396 : 683–7.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Гальвес Т., Парментье М.Л., Джоли С., Маличек Б., Каупманн К., Кун Р., и др. . Мутагенез и моделирование внеклеточного домена ГАМКВ-рецептора подтверждают механизм связывания лиганда венериной мухоловкой. J Biol Chem 1999; 274 ​​ : 13362–9.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Маргета-Митрович М. , Ян Ю.Н., Ян Л.И. Функция субъединиц GB1 и GB2 в связывании G-белка с рецепторами GABAB. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98 : 14649–54.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Курамото Н., Уилкинс М.Е., Фэйрфакс Б.П., Ревилла-Санчес Р., Терунума М., Тамаки К., и др. .Фосфозависимая функциональная модуляция ГАМКВ-рецепторов метаболическим сенсором АМФ-зависимой протеинкиназой. Нейрон 2007; 53 : 233–47.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Дэйв К.Р., Ланге-Ашенфельдт С., Раваль А.П., Прадо Р., Бусто Р., Сол I, и др. . Ишемическое прекондиционирование снижает эксайтотоксичность за счет смещения высвобождения глутамата/гамма-аминомасляной кислоты и биосинтеза. J Neurosci Res 2005; 82 : 665–73.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Tu H, Xu C, Zhang W, Liu Q, Rondard P, Pin JP, и др. . Активация рецептора ГАМКВ защищает нейроны от апоптоза посредством трансактивации рецептора ИФР-1. J Neurosci 2010; 30 : 749–59.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Гуде К., Магнаги В., Ландри М., Надь Ф. .Gereau RW 4th, Pin JP. Метаботропные рецепторы глутамата и ГАМК при боли. Brain Res Rev 2009; 60 : 43–56.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Крайан Дж. Ф., Каупманн К. . Не волнуйтесь, «Б» счастлив!: роль ГАМКВ-рецепторов в тревоге и депрессии. Trends Pharmacol Sci 2005; 26 : 36–43.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Бауэри Н.Г.Рецептор ГАМКВ: место терапевтического эффекта. Curr Opin Pharmacol 2006; 6 : 37–43.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Коричневый EM . Клинические уроки рецептора, чувствительного к кальцию. Nat Clin Pract Endocrinol Metab 2007; 3 : 122–33.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Сделка С . Будущие терапевтические цели при остеопорозе. Curr Opin Rheumatol 2009; 21 : 380–5.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Коричневый EM . Антитела к паратиреоидным и кальцийчувствительным рецепторам при аутоиммунном гипопаратиреозе. Endocrinol Metab Clin North Am 2009; 38 : 437–45.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Монмайор Дж.П., Либерлес С.Д., Мацунами Х., Бак Л.Б.Кандидатный ген рецептора вкуса рядом с локусом сладкого вкуса. Nat Neurosci 2001; 4 : 492–8.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Нельсон Г. , Хун М.А., Чандрашекар Дж., Чжан И., Рыба Н.Дж., Цукер К.С. Рецепторы сладкого вкуса млекопитающих. Сотовый 2001; 106 : 381–90.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Чжан Ф., Клебански Б., Файн Р.М., Сюй Х., Пронин А., Лю Х., и др. .Молекулярный механизм вкусового синергизма умами. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105 : 20930–4.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Цао Дж., Хуан С., Цянь Дж., Хуан Дж., Джин Л., Су З., и др. . Эволюция модулей венериновых мухоловок GPCR класса C включала положительно выбранную функциональную дивергенцию. BMC Evol Biol 2009; 9 : 67.

    ПабМед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Кунисима Н., Шимада Ю., Цудзи Ю., Сато Т. , Ямамото М., Кумасака Т., и др. .Структурные основы узнавания глутамата димерным метаботропным рецептором глутамата. Природа 2000; 407 : 971–7.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Цучия Д., Кунисима Н., Камия Н., Джингами Х., Морикава К. . Структурные изображения лиганд-связывающих ядер метаботропного рецептора глутамата в комплексе с антагонистом, глутаматом и Gd 3+ . Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99 : 2660–5.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Бессис А.С., Рондард П., Гавен Ф., Брабет И., Трибалло Н., Презо Л., и др. . Закрытие модуля венериной мухоловки рецептора mGlu8 и процесс активации: выводы из мутаций, превращающих антагонисты в агонисты. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99 : 11097–102.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Князефф Дж. , Сенто П.П., Гуде С., Лю Дж., Шарне А., Гийон Г., и др. .Блокировка димерного ГАМКВ-рецептора, связанного с G-белком, в его активном состоянии. J Neurosci 2004; 24 : 370–7.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Цудзи Ю., Шимада Ю., Такешита Т., Кадзимура Н., Номура С., Секияма Н., и др. . Скрытый димерный интерфейс и доменная организация внеклеточной области метаботропного глутаматного рецептора подтипа 1. J Biol Chem 2000; 275 : 28144–51.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Романо С., Миллер Дж. К., Хирк К., Дикранян С., Меннерик С., Такеучи Ю., и др. . Ковалентные и нековалентные взаимодействия опосредуют димеризацию метаботропного глутаматного рецептора mGlu5. Мол Фармакол 2001; 59 : 46–53.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Ray K, Hauschild BC, Steinbach PJ, Goldsmith PK, Hauache O, Spiegel AM . Идентификация остатков цистеина в амино-концевом внеклеточном домене человеческого рецептора Ca 2+ , критического для димеризации. Значение для функции мономерного Ca 2+ рецептора. J Biol Chem 1999; 274 ​​ : 27642–50.

    КАС Google Scholar

  • Рэй К., Хаушильд Британская Колумбия. Cys-140 имеет решающее значение для димеризации метаботропного глутаматного рецептора-1. J Biol Chem 2000; 275 : 34245–51.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Лю Дж., Морел Д., Эцол С., Брабет И., Ансанай Х., Пин Дж.П., и др. . Молекулярные детерминанты, участвующие в аллостерическом контроле аффинности агониста в ГАМКВ-рецепторе с помощью субъединицы ГАМКВ2. J Biol Chem 2004; 279 : 15824–30.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Рондар П. , Хуанг С., Монье С., Ту Х., Бланшар Б., Уэслати Н., и др. .Функционирование внеклеточного домена димерного рецептора ГАМКВ, выявленное сканированием гликанового клина. EMBO J 2008; 27 : 1321–32.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Муто Т., Цутия Д., Морикава К., Джингами Х. Структуры внеклеточных областей метаботропных глутаматных рецепторов II/III групп. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104 : 3759–64.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Hu J, Hauache O, Spiegel AM .Богатый цистеином домен человеческого рецептора Ca 2+ . Анализ функции мутантных и химерных рецепторов. J Biol Chem 2000; 275 : 16382–9.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Цзян П. , Цзи Кью, Лю З., Снайдер Л.А., Бенард Л.М., Маргольский РФ, и др. . Богатая цистеином область T1R3 определяет реакцию на сильно сладкие белки. J Biol Chem 2004; 279 : 45068–75.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Rondard P, Liu J, Huang S, Malhaire F, Vol C, Pinault A, и др. . Связь связывания агониста с активацией эффекторного домена в метаботропных глутамат-подобных рецепторах. J Biol Chem 2006; 281 : 24653–61.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Goudet C, Gaven F, Kniazeff J, Vol C, Liu J, Cohen-Gonsaud M, et al .Гептаспиральный домен метаботропного глутаматного рецептора 5 ведет себя как родопсин-подобные рецепторы. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101 : 378–83.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Князефф Дж. , Бессис А.С., Морел Д., Ансанай Х., Презо Л., Пин Дж.П. Закрытое состояние обоих связывающих доменов гомодимерных рецепторов mGlu необходимо для полной активности. Nat Struct Mol Biol 2004; 11 : 706–13.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Хуанг С., Цао Дж., Цзян М., Лабес Г., Лю Дж., Пин Дж. П., и др. . Междоменные движения при активации метаботропных рецепторов глутамата. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108 : 15480–5.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Monnier C, Tu H, Bourrier E, Vol C, Lamarque L, Trinquet E, и др. .Трансактивация между доменами 7TM: участие в активации гетеродимерного ГАМКВ-рецептора. EMBO J 2011; 30 : 32–42.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Брок С. , Уэслати Н., Солер С., Будье Л., Рондар П., Пин Дж. П. . Активация димерного метаботропного глутаматного рецептора путем межсубъединичной перестройки. J Biol Chem 2007; 282 : 33000–8.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Татеяма М., Абэ Х., Наката Х., Сайто О., Кубо Ю. .Лиганд-индуцированная перестройка димерного метаботропного глутаматного рецептора 1альфа. Nat Struct Mol Biol 2004; 11 : 637–42.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Татеяма М., Кубо Ю. . Двойная передача сигналов по-разному активируется различными активными состояниями метаботропного глутаматного рецептора 1альфа. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103 : 1124–8.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Маркаджи П. , Муто Х., Димитров Д., Беато М., Кнопфель Т. .Оптическое измерение конформационных изменений mGluR1 выявляет быструю активацию, медленную деактивацию и сенсибилизацию. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106 : 11388–93.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Pin JP, Joly C, Heinemann SF, Bockaert J . Домены, участвующие в специфичности активации G-белка в метаботропных рецепторах глутамата, связанных с фосфолипазой C. EMBO J 1994; 13 : 342–8.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Бай М., Триведи С., Браун Э.М. Димеризация внеклеточного рецептора, чувствительного к кальцию (CaR), на клеточной поверхности клеток HEK293, трансфицированных CaR. J Biol Chem 1998; 273 : 23605–10.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Ямасита Т. , Теракита А., Шичида Ю. . Вторая цитоплазматическая петля метаботропного рецептора глутамата функционирует в положении третьей петли родопсина. J Biochem 2001; 130 : 149–55.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Фраули М., Юбер Н., Шанн С., Трибалло Н., Бертран Х.О., Ахер Ф., и др. . Аминопирролидинтрикарбоновые кислоты дают новое представление о механизме активации метаботропных глутаматных рецепторов группы III. Мол Фармакол 2007; 71 : 704–12.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Браунер-Осборн Х., Веллендорф П., Дженсен А.А.Структура, фармакология и терапевтические перспективы рецепторов, связанных с G-белком семейства C. Curr Drug Targets 2007; 8 : 169–84.

    ПабМед Google Scholar

  • Ху Дж. , Рейес-Круз Г., Чен В., Якобсон К.А., Шпигель А.М. Идентификация кислотных остатков во внеклеточных петлях семитрансмембранного домена рецептора Ca 2+ человека, критических для ответа на Ca 2+ и положительного аллостерического модулятора. J Biol Chem 2002; 277 : 46622–31.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Буревестник С., Кесслер А., Маслах Ф., Даубан П., Додд Р.Х., Рогнан Д., и др. . Моделирование и мутагенез сайта связывания Calhex 231, нового негативного аллостерического модулятора внеклеточного Ca 2+ -чувствительного рецептора. J Biol Chem 2003; 278 : 49487–94.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Буревестник С., Кесслер А., Даубан П., Додд Р. Х., Рогнан Д., Руат М. .Положительные и отрицательные аллостерические модуляторы Ca 2+ -чувствительного рецептора взаимодействуют в пределах перекрывающихся, но не идентичных сайтов связывания в трансмембранном домене. J Biol Chem 2004; 279 : 18990–7.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Ху Дж., Макларнон С.Дж., Мора С., Цзян Дж., Томас С., Якобсон К.А., и др. . Область в семитрансмембранном домене человеческого рецептора Ca 2+ , критическая для ответа на Ca 2+ . J Biol Chem 2005; 280 : 5113–20.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Пагано А., Рюгг Д., Личиг С., Стоер Н., Стирлин С., Генрих М., и др. . Неконкурентные антагонисты 2-метил-6-(фенилэтинил)пиридин и этиловый эфир 7-гидроксииминоциклопропан[b]хромен-1а-карбоновой кислоты взаимодействуют с перекрывающимися связывающими карманами в трансмембранной области метаботропных глутаматных рецепторов группы I. J Biol Chem 2000; 275 : 33750–8.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Malherbe P, Kratochwil N, Knoflach F, Zenner MT, Kew JN, Kratzeisen C, et al . Мутационный анализ и молекулярное моделирование аллостерического сайта связывания нового селективного неконкурентного антагониста метаботропного рецептора глутамата 1. J Biol Chem 2003; 278 : 8340–7.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Malherbe P, Kratochwil N, Zenner MT, Piussi J, Diener C, Kratzeisen C, и др. .Мутационный анализ и молекулярное моделирование кармана связывания негативного модулятора метаботропного рецептора глутамата 5 2-метил-6-(фенилэтинил)пиридина. Мол Фармакол 2003; 64 : 823–32.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Чжан Ф., Клебански Б., Файн Р.М., Лю Х., Сюй Х., Слуга Г., и др. . Молекулярный механизм усилителей сладкого вкуса. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107 : 4752–7.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Triballeau N, Acher F, Brabet I, Pin JP, Bertrand HO . Разработка рабочего процесса виртуального скрининга на основе кривой «рабочей характеристики приемника». Приложение для высокопроизводительного докинга метаботропных рецепторов глутамата подтипа 4. J Med Chem 2005; 48 : 2534–47.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Selvam C, Oueslati N, Lemasson IA, Brabet I, Rigault D, Courtiol T, et al .Виртуальный скрининг открывает новые возможности для разработки агонистов метаботропных глутаматных рецепторов группы III. J Med Chem 2010; 53 : 2797–813.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Цзян П., Цуй М., Чжао Б., Снайдер Л.А., Бенард Л.М., Осман Р., и др. . Идентификация сайта взаимодействия цикламата в трансмембранном домене субъединицы рецептора сладкого вкуса человека T1R3. J Biol Chem 2005; 280 : 34296–305.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Цзян П. , Цуй М., Чжао Б., Лю З., Снайдер Л.А., Бенард Л.М., и др. . Лактизол взаимодействует с трансмембранными доменами T1R3 человека, подавляя сладкий вкус. J Biol Chem 2005; 280 : 15238–46.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Грегори К.Дж., Донг Э.Н., Мейлер Дж., Конн П.Дж. Аллостерическая модуляция метаботропных рецепторов глутамата: понимание структуры и терапевтический потенциал. Нейрофармакология 2011; 60 : 66–81.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Muhlemann A, Ward NA, Kratochwil N, Diener C, Fischer C, Stucki A, et al . Определение ключевых аминокислот, участвующих в аллостерической модуляции 3,3′-дифторбензалдазином рецепторов mGlu5 крыс. Евро J Pharmacol 2006; 529 : 95–104.

    ПабМед Google Scholar

  • Chen Y, Goudet C, Pin JP, Conn PJ . N-{4-Хлор-2-[(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)метил]фенил}-2-гидроксибензамид (CPPHA) действует через новый сайт как положительный аллостерический модулятор метаботропных глутаматных рецепторов группы 1. Мол Фармакол 2008; 73 : 909–18.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Личиг С., Гаспарини Ф., Рюегг Д., Стоер Н., Флор П.Дж., Вранешич И., и др. . CPCCOEt, неконкурентный метаботропный антагонист рецептора глутамата 1, ингибирует передачу сигналов рецептора, не влияя на связывание глутамата. Мол Фармакол 1999; 55 : 453–61.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Нофлах Ф., Мутель В., Джолидон С., Кью Дж. Н., Малерб П., Виейра Э., и др. . Положительные аллостерические модуляторы метаботропного рецептора глутамата 1: характеристика, механизм действия и сайт связывания. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98 : 13402–7.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Hemstapat K, de Paulis T, Chen Y, Brady AE, Grover VK, Alagille D, et al .Новый класс положительных аллостерических модуляторов метаботропного рецептора глутамата подтипа 1 взаимодействует с сайтом, отличным от сайта отрицательных аллостерических модуляторов. Мол Фармакол 2006; 70 : 616–26.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Роу Б.А., Шаффхаузер Х., Моралес С., Любберс Л.С., Боннефус С., Каменечка Т.М., и др. . Транспозиция трех аминокислот трансформирует человеческий метаботропный глутаматный рецептор (mGluR)-3-положительный сайт аллостерической модуляции в mGluR2 и дополнительную характеристику mGluR2-положительного сайта аллостерической модуляции. J Pharmacol Exp Ther 2008; 326 : 240–51.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Grillon C, Cordova J, Levine LR . Морган Калифорния 3-й. Анксиолитические эффекты нового агониста метаботропных глутаматных рецепторов группы II (LY354740) в парадигме испуга, потенцированной страхом, у людей. Психофармакология (Берл) 2003; 168 : 446–54.

    КАС Google Scholar

  • Патил С.Т., Чжан Л., Мартеньи Ф., Лоу С.Л., Джексон К.А., Андреев Б.В., и др. .Активация рецепторов mGlu2/3 как новый подход к лечению шизофрении: рандомизированное клиническое исследование фазы 2. Nat Med 2007; 13 : 1102–7.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Суонсон С.Дж., Бурес М., Джонсон М.П., ​​Линден А.М., Монн Дж.А., Шоепп Д.Д. Метаботропные глутаматные рецепторы как новые мишени для тревожных и стрессовых расстройств. Nat Rev Drug Discov 2005; 4 : 131–44.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Urwyler S, Mosbacher J, Lingenhoehl K, Heid J, Hofstetter K, Froestl W, et al . Положительная аллостерическая модуляция нативных и рекомбинантных рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (В) 2,6-ди-трет-бутил-4-(3-гидрокси-2,2-диметил-пропил)-фенолом (CGP7930) и его альдегидным аналогом CGP13501. Мол Фармакол 2001; 60 : 963–71.

    КАС пабмед Google Scholar

  • ДеЛапп СЗ . Сцинтилляционный анализ близости с захватом антител [ 35 S]GTPgammaS: новый мощный метод анализа фармакологии GPCR. Trends Pharmacol Sci 2004; 25 : 400–1.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Мацусита С., Наката Х., Кубо Ю., Татеяма М. . Лиганд-индуцированные перестройки ГАМКВ-рецептора, выявляемые по резонансному переносу энергии флуоресценции. J Biol Chem 2010; 285 : 10291–9.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Бине В. , Бражон С., Ле Корре Л., Ашер Ф., Пин Ж.П., Презо Л. .Гептаспиральный домен GABAB2 активируется непосредственно CGP7930, положительным аллостерическим модулятором рецептора GABAB. J Biol Chem 2004; 279 : 29085–91.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Tu H, Rondard P, Xu C, Bertaso F, Cao F, Zhang X, и др. . Доминирующая роль GABAB2 и Gbetagamma для пути ERK1/2/CREB, опосредованного рецептором GABAB, в нейронах мозжечка. Сотовый сигнал 2007; 19 : 1996–2002 гг.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Urwyler S, Pozza MF, Lingenhoehl K, Mosbacher J, Lampert C, Froestl W, et al . N,N’-Дициклопентил-2-метилсульфанил-5-нитропиримидин-4,6-диамин (GS39783) и структурно родственные соединения: новые аллостерические усилители функции рецептора гамма-аминомасляной кислоты B. J Pharmacol Exp Ther 2003; 307 : 322–30.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Malherbe P, Masciadri R, Norcross RD, Knoflach F, Kratzeisen C, Zenner MT, и др. .Характеристика ( R,S )-5,7-ди- трет -бутил-3-гидрокси-3-трифторметил-3 H -бензофуран-2-она как положительного аллостерического модулятора ГАМКВ-рецепторов. Br J Pharmacol 2008; 154 : 797–811.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Керр Д.И., Онг Дж., Пуспавати Н.М., Прагер Р.Х. Арилалкиламины представляют собой новый класс положительных аллостерических модуляторов ГАМКВ-рецепторов в неокортексе крыс. Евро J Pharmacol 2002; 451 : 69–77.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Керр Д.И., Онг Дж. Потенцирование метаботропных ГАМКВ-рецепторов L -аминокислотами и дипептидами в неокортексе крыс. Евро J Pharmacol 2003; 468 : 103–8.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Уайз А., Грин А., Мейн М.Дж., Уилсон Р., Фрейзер Н., Маршалл Ф.Х.Чувствительные к кальцию свойства ГАМКВ-рецептора. Нейрофармакология 1999; 38 : 1647–56.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Гальвес Т., Урвайлер С., Презо Л., Мосбахер Дж., Джоли С., Малицчек Б., и др. . Ca 2+ потребность в высокоаффинном связывании гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) с рецепторами ГАМКВ: участие серина 269 субъединицы GABABR1. Мол Фармакол 2000; 57 : 419–26.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Браунер-Осборн Х. , Дженсен А.А., Шеппард П.О., О’Хара П., Крогсгаард-Ларсен П. . Агонист-связывающий домен рецептора, чувствительного к кальцию, расположен в амино-концевом домене. J Biol Chem 1999; 274 ​​ : 18382–6.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Zhang Z, Qiu W, Quinn SJ, Conigrave AD, Brown EM, Bai M .Три соседних серина во внеклеточных доменах CaR необходимы для L -аминокислотно-опосредованного потенцирования функции рецептора. J Biol Chem 2002; 277 : 33727–35.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Сайдак З., Бразьер М., Камел С., Ментаверри Р. . Агонисты и аллостерические модуляторы рецептора, чувствительного к кальцию, и их терапевтическое применение. Мол Фармакол 2009; 76 : 1131–44.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Сильв С, Буревестник С, Лерой С, Брюэль Х, Маллет Э, Рогнан Д, и др. . Очерчивание кармана для связывания Ca 2+ в модуле венериной мухоловки человеческого рецептора, чувствительного к кальцию. J Biol Chem 2005; 280 : 37917–23.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Arey BJ, Seethala R, Ma Z, Fura A, Morin J, Swartz J, и др. .Новый антагонист чувствительных к кальцию рецепторов кратковременно стимулирует секрецию паратиреоидного гормона in vivo . Эндокринология 2005; 146 : 2015–22.

    КАС пабмед Google Scholar

  • Фитцпатрик Л.А., Смит П.Л., Макбрайд Т.А., Фрайс М.А., Хоссейн М., Дабровски К.Е., и др. . Ронакалерет, антагонист кальциевых рецепторов, не оказывает существенного влияния на время заживления переломов лучевой кости: результаты рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого клинического исследования II фазы. Кость 2011; 49 : 845–52.

    КАС пабмед Google Scholar

    • Сенсоры на основе FRET расшифровывают активацию и аллостерическую модуляцию ГАМКВ-рецептора Структурная динамика GABA

    B рецептор

    •
    •
    •
    •
    •

    GABA B Конформационные изменения меньше, чем у метаботропных глютаматных рецепторов

    •

    Датчики TRBRET являются надежными инструментами для анализа лиганда и скрининга

    •

    Сенсоры — дополнительные инструменты для различения агонистов и ПАМ

    Резюме

    Основной тормозной нейротрансмиттер, γ-аминомасляная кислота (ГАМК), модулирует многие синапсы, активируя рецептор, связанный с G-белком 16 B 900, 900 который является мишенью для различных терапевтических приложений.Это обязательный гетеродимер, состоящий из GB1 и GB2, который можно регулировать положительными аллостерическими модуляторами (PAM). Молекулярный механизм активации рецептора GABA B остается плохо изученным. Здесь мы разработали конформационные датчики GABA B на основе FRET, совместимые с высокопроизводительным скринингом. Мы идентифицировали конформационные изменения, происходящие во внеклеточном и трансмембранном доменах при активации рецептора, которые меньше, чем наблюдаемые в родственных метаботропных рецепторах глутамата.Эти датчики также позволяют различать агонисты с разной эффективностью и ПАМ с разным механизмом действия, что не всегда было возможно при использовании обычных функциональных анализов. Наше исследование дает важную новую информацию о механизме активации рецептора GABA B и должно облегчить скрининг и идентификацию новых химических веществ, нацеленных на этот рецептор.

    Ключевые слова

    Ключевые слова

    BioSensors

    ALLOSTERY

    Tag Tag

    ACP TAG

    RETONAL RESONANCE RESONANCE

    LET

    Time-Breved Energy

    Молекулярная фармакология

    Предварительный лиц Лиганд

    0)

    © 2017 Elsevier Ltd.

    Рекомендуемые статьи

    Цитирующие статьи

    Конформационная динамика между трансмембранными доменами и аллостерическая модуляция метаботропного глутаматного рецептора

    Резюме:

    В этой статье используется комбинация тщательно разработанных зондов, вставленных в изолированные рецепторные домены, и полноразмерный mGluR2 для экспериментов FRET на живых клетках и фотообесцвечивания отдельных молекул. […] Мы просим вас решить следующие проблемы, некоторые из которых, вероятно, потребуют повторной интерпретации, удаления данных из рукописи и значительного переписывания.

    Мы благодарим рецензентов за конструктивные комментарии к рукописи. Мы ответили на каждый из приведенных ниже конкретных запросов на пересмотр, которые включали изменения в рукопись, а также новые эксперименты. Мы приняли близко к сердцу комментарии рецензентов и приложили усилия, чтобы более тщательно поместить нашу работу в контекст более широкой области mGluR с изменениями в разделах «Аннотация», «Введение» и «Обсуждение». Мы предоставили ответы на конкретные вопросы ниже.

    В целом, мы считаем, что наше исследование вносит ценный вклад в две основные области исследований. Во-первых, мы обеспечиваем новое понимание механизмов сборки, конформации и функционирования трансмембранного домена mGluR (TMD). Понимание TMD как автономной единицы является ключевым шагом к получению полного представления об активации GPCR класса C. Во-вторых, мы сообщаем о результатах молекулярной фармакологии аллостерических модуляторов mGluR, которые выявляют новые формы гетерогенности между родственными соединениями.Мы хотели бы подчеркнуть следующие аспекты нашего исследования, которые представляют собой либо новые результаты, либо важные разъяснения нерешенных вопросов:

    1) полноразмерный mGluR2 можно активировать с помощью PAM.

    2) PAM могут активировать mGluR2 без необходимости связывания ортостерического агониста или закрытия LBD.

    3) TMD mGluR взаимодействуют с достаточной аффинностью для димеризации в отсутствие LBD.

    4) TMD mGluR2 проявляют более высокую склонность к димеризации, чем все другие mGluR группы I и II.

    5) перегруппировка между TMD может происходить независимо от аллостерического входа от LBD.

    6) PAM имеют как разную аффинность, так и разную эффективность по отношению друг к другу.

    7) ПАМ проявляют более медленное начало и обратное действие, чем глутамат.

    8) PAM обладают переменной обратимостью и кинетикой OFF, частично из-за взаимодействия липидного бислоя.

    9) Ксантуреновая кислота, предполагаемый эндогенный аллостерический агонист, не действует непосредственно на mGluR2 TMD.

    10) NAM могут быть нейтральными или служить обратными агонистами.

    11) Для описания конформационной динамики между TMD требуется не менее 3 состояний.

    Основные версии:

    1) Половина максимальной дозы в дозозависимой реакции на один порядок отличается для FRET (рис. 3F) от текущей дозозависимой реакции (рис. 1F), как будто эти два явления не сильно связаны. Что это означает?

    Мы благодарим рецензентов за указание на отсутствие соответствия между значениями EC 50 , наблюдаемыми в анализе TMD FRET и текущем анализе GIRK.Нет ничего необычного в том, что функциональные и конформационные или связывающие показания GPCR или любого сигнального белка различаются, потому что многие факторы влияют на форму и среднюю точку кривой доза-ответ. Например, резервные пулы рецепторов могут способствовать сдвигу влево EC 50 в функциональном анализе по сравнению с K d , измеренным в анализах связывания (например, см. Adler et al., 1987 или Adham et al., 1993). ). Кроме того, нелинейность/амплификация на последующих стадиях передачи сигналов также может способствовать таким несоответствиям между связыванием, конформационными и функциональными кривыми доза-реакция.Например, положительная кооперативность в отношениях между связыванием G ß и током GIRK (Berlin et al. , 2010; Yakubovich et al., 2015), вероятно, способствует смещению влево зависимости доза-реакция. В связи с этим стоит отметить, что наши предыдущие измерения FRET между LBD также показывают количественно аналогичное несоответствие между EC 50 , измеренным с помощью FRET, и измерениями тока GIRK. В Levitz et al. (2016) мы сообщили о значении EC 50 для глутамата ~ 20 мкМ и ~ 3 мкМ в функциях FRET и GIRK между LBD соответственно.Это семикратное соотношение соответствует шестикратному соотношению, указанному здесь для FRET между TMD (EC 50 ~ 1,2 мкМ) и функции GIRK (EC 50 ~ 0,2 мкМ).

    Чтобы дополнительно изучить реакцию на PAM, мы провели новые эксперименты с другим функциональным считыванием. Рисунок 1 — дополнение к рисунку 1c-d показывает репрезентативную кривую и кривую доза-ответ LY48, полученную с помощью визуализации кальция в клетках HEK 293T, еще одного широко используемого считывания GPCR. Широко используемая химера G-белка (Conklin et al. , 1993) котрансфицировали, чтобы позволить mGluR2 передавать сигналы через путь Gq. В этой системе мы измерили EC 50 , равную 1,2 мкМ, что соответствует измерению с помощью показаний TMD FRET, но сдвинуто вправо относительно GIRK. Это подтверждает агонизм PAM, о котором сообщалось в нашем исследовании, и еще раз подтверждает мнение о том, что различные показания GPCR демонстрируют тонкие сдвиги в кривых доза-ответ.

    Наконец, также стоит отметить, что приведенные здесь относительные значения кажущейся аффинности между различными PAM согласуются между анализами и согласуются с опубликованными значениями (Johnson et al., 2003; Боннефус и др., 2005 г.; Джонсон и др., 2005 г.; Хиёси и др., 2014). Кроме того, относительная эффективность трех протестированных PAM согласуется между текущими анализами FRET и GIRK (рис. 4H, I). Вместе эти наблюдения подтверждают связь между конформационными изменениями, обнаруженными сигналом FRET, и активацией рецептора.

    2) Данные на рисунке 5B и дополнительном рисунке 13, рисунке 6 — дополнение к рисунку 3 и рис. 7 — дополнение к рисунку 1 по большей части неубедительны, и трудно сделать механистическую интерпретацию в отношении модуляции рецепторов и стробирования.Хотя авторы измеряют время нарастания от 10 до 90%, форма индивидуальных откликов существенно различается, и некоторые данные не имеют смысла. Что на самом деле представляет кинетика? Действительно ли активация mGluR2 требует нескольких минут для достижения равновесия? Почему время выключения зависит от концентрации растворимого лиганда, такого как глутамат? Ответы на глутамат намного медленнее, чем регистрируются в синапсах. На Рисунке 6 — дополнение к рисунку 1 наклон зависимости концентрации от CBiPES почти плоский по сравнению с другими лигандами.Авторы также находят трудным вымывание BINA и предполагают, что BINA изолирован в мембране. Это также, вероятно, верно для некоторых других используемых соединений (или должен быть какой-то другой фактор, который делает вымывание медленным и зависит от концентрации), поскольку скорость выведения зависит от концентрации (чего не должно быть, если имеет место простое вымывание вещества). соединение). Авторы должны решить эти кинетические проблемы или удалить данные из рукописи.

    Мы благодарим рецензентов за то, что они выразили свою обеспокоенность по поводу кинетических данных, которые мы улучшили за счет дополнительных экспериментов и дальнейшего анализа.Основные выводы, которые мы хотели бы подчеркнуть в этом разделе, следующие: (1) ответы PAM демонстрируют более медленную кинетику включения и выключения, чем ответы глутамата, и (2) что BINA демонстрирует гораздо более медленную кинетику включения и отсутствие обратимости по сравнению с другими PAM из-за того, что при по крайней мере частично, к двухслойным взаимодействиям.

    После дальнейшего изучения наших условий перфузии мы решили повторить эти эксперименты с более быстрой перфузией (25 мл/мин против 5 мл/мин в камере на 0,5 мл). Предполагая хорошо перемешиваемой камеры, константы времени для перфузии составляет ~ 1.2 с. Мы считаем, что в случае глутамат-индуцированных ответов LBD FRET кинетика, вероятно, является просто отражением вымывания и вымывания лекарственного средства. Как отметили эксперты, mGluRs должны быть готовы подавать сигналы даже быстрее в ответ на глутамат, чем время промывки ~ 1 с, наблюдаемое в наших измерениях (см. Reiner and Levitz, 2018). Однако значительно более медленная кинетика ON LY48, которая поддерживается быстрой перфузией, показывает, что либо связывание, либо индуцированные связыванием конформационные изменения действительно медленнее для PAM, нацеленных на TMD.В соответствии с этой интерпретацией полноразмерные ответы mGluR2 в анализе GIRK быстрее для насыщения (1 мМ) глутамата, чем для насыщения (10 мкМ) LY48, и LY48-индуцированные изменения в LBD FRET также намного медленнее, чем глутамат-индуцированные изменения FRET ( см. новый рисунок 5 — дополнение к рисунку 1C-D). Чтобы подчеркнуть это сравнение, мы теперь разбили данные кинетики на две основные фигуры: на рисунке 5 показано сравнение между кинетикой, индуцированной глутаматом между LBD, и кинетикой, индуцированной между TMD LY48, а на рисунке 6 показан сравнительный анализ различных PAM. Примечательно, что скорость различных PAM лишь немного увеличивается при быстрой перфузии (см. Рисунок 6A, B), и все PAM, несмотря на различия друг относительно друга, демонстрируют более медленную кинетику, чем глутамат. На Рисунке 5 (дополнение к рисунку 1A и B) мы показываем сравнение между расчетным течением времени для обмена препарата в ванне, ожидаемой кривой связывания для концентрации, в десять раз превышающей EC 50 , и необработанными ответами FRET для 100 мкМ глутамата с LBD. FRET (A) или для 10 мкМ LY48 с TMD FRET (B).

    В соответствии с этим анализом, важным моментом, который мы добавили в раздел «Обсуждение», является то, что отсутствие сайта связывания для эндогенных лигандов внутри TMD предполагает наличие ограниченных эволюционных ограничений на этот сайт связывания. Это, как предполагалось ранее во многих фармакологических контекстах (см. Niswender and Conn, 2010), может объяснить, почему для этого сайта легче разработать подтип-специфические лиганды, а также согласуется с наблюдаемой медленной и изменчивой кинетикой.

    Вторичное наблюдение заключается в том, что кинетика выключения PAM (LY48, CBiPES и TASP), но не кинетика выключения глутамата, слабо зависит от дозы (см. рис. 5C и рис. 6 — дополнение к рисунку 1A). Учитывая наши условия быстрой перфузии, эта зависимость от дозы вряд ли связана просто с повторным связыванием вследствие медленного вымывания. Медленное вымывание из липидных компартментов, которое, как ранее было показано, приводит к дозозависимой кинетике выключения гидрофобных препаратов, нацеленных на рецепторы ГАМК (см. Gingrich et al., 2009), является вероятным объяснением этого результата, который мы обсуждаем в подразделе «Конформационное и функциональное разнообразие аллостерических модуляторов mGluR » . Крайний случай такого взаимодействия с мембраной наблюдается у BINA, который очень гидрофобен (cLogP ≈ 7,8). В отличие от 3 других протестированных PAM, ответы BINA как в тестах TMD FRET (рис. 6A), так и в анализах GIRK (рис. 6C) были полностью необратимыми даже при высокой скорости перфузии. Мы считаем, что это важный результат, который можно объяснить с помощью модели мембранного разделения.На рисунке 6D мы показываем, что NAM MNI 137 обращает вспять увеличение FRET, вызванное BINA, но ответ BINA возвращается после вымывания MNI. Этот результат указывает на популяцию молекул BINA, которые не могут быть вымыты, потому что они разделены либо на плазматическую мембрану, либо на внутриклеточные мембраны. Кроме того, мы используем хорошо зарекомендовавший себя анализ на основе липосом in vitro (Ingolfsson and Andersen, 2010), чтобы показать, что BINA в большей степени, чем все другие PAM, изменяет физические свойства мембраны.Чтобы прояснить это измерение, мы предоставили схематические и репрезентативные кривые, чтобы более четко описать этот эксперимент (рис. 6 — дополнение к рисунку 3A, B). Мы также добавили в текст информацию о зарегистрированных значениях logP для каждого протестированного PAM и NAM, чтобы предоставить больше контекста.

    Для дальнейшего изучения кинетики PAM мы также сообщили об эффектах доминантно-негативного G-белка, который стабилизирует активное состояние TMD (рис. 6 — дополнение к рисунку 2). Как сообщалось в исходной рукописи, G-белок ускорял кинетику как включения, так и выключения ответа на LY48.Теперь мы включаем данные, полученные при быстрой перфузии, когда общий эффект ускорения сохраняется и дозозависимость кинетической реакции выключения ясна. Эффект, наблюдаемый для кинетики ON, согласуется с повышенной кажущейся аффинностью, которую обеспечивает G-белок. Противоречивый эффект на кинетику выключения предполагает, как мы утверждали в первоначальном представлении, что G-белок стабилизирует активное состояние с улучшенной доступностью внеклеточного раствора, чтобы обеспечить более быстрое обращение.

    Наконец, мы также сообщаем обновленные кинетические данные для Ro 64, полученные с помощью быстрой перфузии. В соответствии с данными в исходной рукописи, Ro 64 демонстрирует кинетику включения, сравнимую с LY48 (рис. 7 — дополнение к рисунку 1B), но кинетику выключения, которая намного медленнее, чем у LY48, TASP или CBiPES. Учитывая отсутствие явного влияния на мембрану в нашем анализе in vitro (рис. 7 — дополнение к рисунку 1C), мы предполагаем, что это указывает на то, что, в отличие от влияния G-белка на активное состояние, полностью неактивное состояние показывает снижение доступности лиганда.Как упоминалось в разделе «Обсуждение», это согласуется с недавней работой, показывающей, что доступность лигандов GPCR может зависеть от состояния (Devree et al., 2016). Однако в ходе обсуждения мы также отмечаем, что гидрофобная природа Ro 64 (cLogP ≈ 4,9) также может способствовать его медленному обращению.

    Вышеупомянутые экспериментальные и аналитические модификации можно найти в разделах «Результаты» и «Материалы и методы».

    3) Следующие утверждения вводят в заблуждение и должны быть исправлены в свете недавних полноразмерных структур mGluR, упомянутых в разделе «Обсуждение».Аннотация: «остается неизвестным, как происходит активация mGluR на уровне трансмембранных доменов (TMD)». Введение: «Остается неясным, взаимодействуют ли TMD напрямую друг с другом».

    Мы приносим свои извинения, если эти заявления были восприняты как игнорирование прогресса, достигнутого в области mGluR в ключевом вопросе взаимодействия между TMD и активации рецепторов; это, конечно, не было нашим намерением. На момент подготовки рукописи и первоначального представления полноразмерная структура mGluR5 еще не сообщалась.

    Тем не менее, мы утверждаем, что общий смысл наших первоначальных заявлений верен. Вкратце, общее мнение в этой области заключается в том, что димеризация mGluR опосредуется в первую очередь взаимодействиями между LBD, основанными на наличии кристаллических структур димеров LBD для подтипов групп I, II и III (Kunishima et al., 2010; Tsuchiya et al. ., 2002; Muto et al., 2007; Monn et al., 2015; Koehl et al., 2019), измерения trFRET рецепторных конструкций без LBD (El Moustaine et al., 2012) и указания на то, что трансмембранные домены GPCR обычно не образуют стабильных димеров (см. Sleno and Hebert, 2018).Однако относительно хорошо изученные перестройки между LBD, которые управляют активацией (Olofsson et al. , 2014; Vafabakhsh et al., 2015; Levitz et al., 2016), подняли вопрос о взаимодействии и перестройке между TMD. В ряде элегантных исследований FRET была обнаружена реаранжировка между TMD в полноразмерных рецепторах после связывания с агонистом, основанная на вставке флуоресцентных белков во внутриклеточные петли или на С-конце (Tateyama et al., 2004; Tateyama and Kubo, 2006; Marcaggi). и другие., 2009; Главачкова и др., 2012). Эти исследования, которые были сосредоточены на mGluRs группы I, оценивали только эффекты ортостерических агонистов и проводились в конструкциях, которые не могли связываться с G-белками, что повышает необходимость дальнейшей работы в этой области. В то же время структуры с атомарным разрешением послужили дополнительной мотивацией для изучения взаимодействий между TMD. Совсем недавно связанная с NAM кристаллическая структура TMD mGluR1 показала опосредованную холестерином димеризацию (Wu et al., 2014), но связанные с NAM структуры TMD mGluR5 являются мономерными (Dore et al. , 2014; Кристофер и др., 2015). К сожалению, отсутствует структурная информация о трансмембранных доменах группы II или III. Тем не менее, знаковое исследование, проведенное Xue et al. (2015), показало перекрестное связывание между TMD как в неактивном, так и в активном состоянии рецептора. Важно отметить, что все предыдущие исследования не смогли отличить относительный вклад перестроек TMD, вызванных LBD, по сравнению с теми, которые управляются автономно на уровне TMD, особенно в ответ на PAM и NAM. Совсем недавно полноразмерные крио-ЭМ структуры mGluR5 дополнительно мотивировали необходимость понимания природы взаимодействий между TMD и механизма действия аллостерических препаратов.Koehl et al. (2019) обнаружили четкое взаимодействие между субъединицами mGluR5 через TM6 в структуре глутамата, нанотела и PAM-связанного рецептора в мицеллах детергента. Важно отметить, что в этой структуре TMD остаются в неактивном состоянии. Интересно, что в структуре апо не наблюдается четкого взаимодействия между TMD, хотя TM4 и TM5 расположены напротив друг друга. Стоит отметить, что, в отличие от структуры, связанной с агонистом, эта структура была решена в липидных нанодисках, а не в детергенте.Несмотря на то, что это, несомненно, новаторское исследование, эта работа не дает четкого понимания способов взаимодействия и перестройки TMD в процессе активации в биологической мембране. Кроме того, весьма вероятно, что разные подтипы рецепторов обнаруживают различия во взаимодействиях внутри и между субъединицами, что позволяет им настраиваться на свои различные физиологические контексты в разных синаптических локализациях, которые воспринимают различную динамику глутамата.

    Вместе мы считаем, что эта ценная работа выявила необходимость дальнейших исследований способности mGluR TMD взаимодействовать в различных функциональных состояниях, их способности перестраиваться независимо от аллостерического привода от LBD, а также функциональных и конформационных эффектов аллостерических препаратов. .Мы решили сосредоточиться на mGluR2, потому что это наиболее понятный подтип с точки зрения начальных конформационных изменений, которые происходят в LBD, а также из-за нейробиологической и клинической мотивации для понимания аллостерических препаратов, которые нацелены на TMDs этого рецептора. Вышеупомянутые открытые вопросы и связанная с ними литература прямо упоминаются во введении, а также в разделах «Результаты» и «Обсуждение», чтобы читатель мог поместить наше исследование в более широкий контекст области.

    Чтобы прояснить формулировку и более четко признать понимание, полученное из недавних структур, мы изменили эти конкретные утверждения, чтобы прочитать, что «остается неясным, как активация mGluR происходит на уровне трансмембранных доменов (TMD)» и «остается неясным». могут ли TMD образовывать стабильные взаимодействия, зависят ли такие взаимодействия от состояния и управляются ли потенциальные перестройки между TMD автономно или зависят от аллостерического ввода от LBD».

    Изначально мы стремились сделать введение кратким и простым, чтобы избежать излишне подробного обсуждения, и решили включить более полное описание соответствующих предшествующих исследований, поскольку они относились к конкретным экспериментам, в разделе «Результаты».Однако в исправленной версии мы включили во Введение более подробное обсуждение предыдущей работы, а также самое последнее структурное исследование.

    4) Авторы предполагают, что Ro-64 действует как обратный агонист, так как он угнетает базовый ток. Однако не является ли это просто антагонизмом базовой активности mGLUR2? MNI-137 также снижает базовый ток, но авторы предполагают, что MNI-137 действует как нейтральный антагонист. Просьба уточнить?

    Мы благодарим судей за указание на необходимость уточнения этого момента.По определению, обратный агонист снижает базальную активацию, в то время как нейтральный антагонист просто конкурирует за сайт связывания, чтобы ингибировать эффекты других препаратов (см. Wacker et al., 2017 для недавнего всестороннего обзора фармакологии GPCR). Механически это считается результатом относительной аффинности лиганда к различным конформациям рецептора (см. Manglik et al., 2015; Staus et al., 2016). Мы предполагаем, что Ro 64 является обратным агонистом, поскольку он изменяет конформацию TMD в отсутствие какого-либо другого препарата (рис. 6B, C) и снижает базальную активность полноразмерного mGluR2 (рис. 6E, F).Напротив, MNI-137 не оказывает заметного влияния на конформацию рецептора в нашем анализе (рис. 6B, C), а также не вызывает существенного изменения базального тока, вызванного mGluR2 (рис. 6D, F).

    5) Тот факт, что Ro-64 (NAM) индуцирует тот же TMD FRET, что и LY-48 (PAM), вызывает некоторое беспокойство: не означает ли это, что сигнал TMD FRET на самом деле не является хорошим репортером активации?

    Мы согласны с тем, что это противоречивый результат. Действительно, изначально мы ожидали, что NAM либо не окажут прямого влияния на FRET TMD (как это было замечено с MNI 137), либо уменьшат FRET на основе увеличения FRET, наблюдаемого с PAM.Такой результат поддержал бы модель конформации между TMD с двумя состояниями. Мы согласны с тем, что увеличение TMD FRET, вызванное Ro 64, приводит к некоторым осложнениям, если кто-то наивно использует этот анализ для скрининга лекарств. Однако мы также обнаруживаем, что конформационная сложность, обнаруженная этим увеличением FRET, является важным и неожиданным аспектом этой статьи. Наконец, мы отмечаем, что, поскольку Ro 64 оказывает минимальное модифицирующее воздействие на бислой (рис. 7 — дополнение к рисунку 1C), мы можем исключить, что Ro 64-индуцированные изменения в FRET обусловлены неспецифической перестройкой TMD, опосредованной мембранами.

    6) Уравнение FRET (подраздел «Измерения FRET на живых клетках») неверно для макроскопического анализа FRET. Донор F на 50% состоит из димеров с двумя донорными флуорофорами. Кроме того, Facceptor представляет собой смесь просачивания донора, прямого возбуждения акцепторов и возбуждения FRET акцепторов. Внесите, пожалуйста, поправки в расчеты эффективности FRET или, по крайней мере, поясните, в чем заключаются недостатки нынешних расчетов.

    Мы согласны с экспертами в отношении сложности расчета надежных значений FRET на основе ансамблевых измерений в живых клетках.По этой причине мы не сообщали и не обсуждали фактические скорректированные значения FRET или связанные с ними расстояния между флуорофорами, а вместо этого сосредоточились на относительных изменениях FRET в ответ на применение препарата. Из-за акцента на относительных изменениях FRET мы не корректировали значения FRET. Вместо этого мы определили базальный уровень FRET (определяемый по уравнению эффективности = F A / [F D + F A ]) равным 1,0 и проанализировали только относительные изменения FRET. Кроме того, весь анализ амплитуды FRET TMD проводился относительно насыщения LY48.Чтобы еще больше прояснить этот момент, мы добавили его описание в раздел «Материалы и методы».

    7) На рисунке 4C-D: является ли концентрация DCG-IV насыщающей? На рисунке 6D: что произойдет, если концентрация MNI-137 увеличится?

    Да, 10 мкМ либо насыщают, либо почти насыщают (~EC 80 -EC 90 ) для DCG-IV в анализе LBD FRET, как сообщалось ранее (Doumazane et al., 2013; Vafabakhsh et al., 2015). ). Мы выбрали эту концентрацию, потому что она ранее была показана Doumazane et al., что первичный эффект применения PAM заключается в увеличении максимального ответа FRET между LBD, а не в увеличении кажущегося сродства к агонистам.

    Точно так же 1 мкМ является насыщающей концентрацией для MNI-137. Первоначальная характеристика (Hemstapat et al., 2007) в ряде анализов показала IC 50 в диапазоне 10–70 нМ. Кроме того, мы обнаружили, что 1 мкМ полностью блокирует функциональный ответ на LY48 (рис. 1 — дополнение к рисунку 1B). Для сравнения, сообщалось, что Ro 64 имеет более высокую IC 50 100-500 нМ (Cartmell et al., 1998; Kalczewski et al., 1999), поэтому мы использовали 10 мкМ в качестве насыщающей дозы. Однако для подтверждения этого результата мы повторили функциональные измерения обратного агонизма с 5 мкМ MNI-137 и получили идентичные результаты. Изображение ответа автора 1 суммирует этот новый набор данных с 5 мкМ MNI-137 и 10 мкМ Ro 64. Мы решили сохранить исходные данные в рукописи, поскольку используемые концентрации соответствуют данным LBD FRET.

    8) Подраздел «PAM-индуцированные ответы FRET между TMD тесно коррелируют с функциональной аффинностью и эффективностью PAM». «Этот результат свидетельствует о том, что доступность ортостерических и аллостерических сайтов связывания различается и что время начала последующих эффектов, вызванных агонистами по сравнению с PAM, будет другим». Неясно, можно ли отличить доступность от медленных индуцированных конформационных изменений.

    Мы согласны и изменили предложение, включив в него возможность того, что различия во времени конформационных перестроек могут также объяснить расхождение в кинетике, наблюдаемое для ортостерических и аллостерических препаратов.Наше пересмотренное предложение гласит: «Этот результат предполагает, что либо доступность ортостерических и аллостерических сайтов связывания, либо время связанных конформационных изменений различаются, и что время начала нижестоящих эффектов, вызванных агонистами по сравнению с PAM, будет другим».

    9) Подраздел «PAM-индуцированные ответы FRET между TMD тесно коррелируют с функциональной аффинностью и эффективностью PAM». «Присутствие G-белка ускоряет кинетику как включения, так и выключения».Кинетика Off не отличается при низких концентрациях LY48, так что, возможно, никакого эффекта, если зависимость от концентрации Off является артефактом (см. пункт 2 выше)?

    Мы благодарим судей за предложение. Как описано выше (см. пункт 2), мы повторили этот эксперимент с более быстрой перфузией и обнаружили, что ускорение кинетики включения и выключения G-белка сохраняется при всех концентрациях (см. Рисунок 6 — дополнение к рисунку 2).

    10) Подраздел «Inter-TMD FRET показывает, что NAM mGluR2 служат либо нейтральными антагонистами, либо обратными агонистами, которые стабилизируют состояние высокого FRET».«предполагая, что конформация TMD в состоянии покоя не изменяется под действием этого соединения». Вы смотрели только на одно место в белке, поэтому в других местах, на которые вы не смотрели, могло произойти много изменений.

    Мы согласны со скептицизмом рецензента в отношении возможности сделать такой вывод из измерений FRET с одним положением флуорофора. Тем не менее, мы хотели подчеркнуть, что из всех протестированных препаратов это единственное, которое само по себе не вызывало изменения FRET. Это согласуется с конформационно нейтральным ответом, но мы не можем исключить возможность того, что конформационные изменения, к которым наши сенсоры нечувствительны, действительно происходят.Мы изменили предложение следующим образом: «…предполагая, что конформация TMD не изменена, хотя мы признаем, что наши датчики могут быть не в состоянии обнаруживать более локализованные конформационные изменения».

    11) В подразделе «Роль взаимодействия между TMD в модуляции и активации mGluR» указано, что эти конформационные изменения, вероятно, представляют собой процесс активации, аналогичный тому, который инициируется глутаматом». Это тоже кажется натяжкой, тем более, что NAM индуцирует тот же сигнал FRET.

    Чтобы не выходить за рамки того, что показывают данные, мы изменили его следующим образом: «указывает, что эти конформационные изменения могут представлять собой путь активации, связанный с тем, который инициируется глутаматом».

    12) Введение: «mGluR2.… переориентация между TMD подчеркивается уникальной высокой склонностью к димеризации mGluR2 TMD, которая не наблюдается в других подтипах mGluR группы I и II или в канонических GPCR класса A». Нет сомнений в том, что GPCR класса A отличаются, но, учитывая, что GPCR класса C являются функциональными димерами, «уникальная, высокая склонность» к mGluR2 по сравнению с другими mGluR сомнительна, и не было убедительно продемонстрировано, что наблюдаемые различия являются механистически значимыми.

    Спасибо. Чтобы уточнить, когда мы обсуждаем уникальную склонность mGluR2 к димеризации, мы имеем в виду исключительно взаимодействие между TMD. Как сообщалось ранее многими группами, все полноразмерные mGluR образуют конститутивные димеры в сопоставимых степенях (Doumazane et al., 2011; Levitz et al., 2016), отчасти из-за консервативной межсубъединичной дисульфидной связи, которая, вероятно, делает сборку необратимый. Однако вопрос о том, взаимодействуют ли TMD друг с другом напрямую в состоянии покоя и изменяется ли это во время активации, остается спорным.

    Здесь мы обнаруживаем, что изолированные TMD всех протестированных подтипов mGluR демонстрируют склонность к димеризации выше фоновых уровней, как определено по сравнению с измерениями с β-2 адренергическими рецепторами. Однако mGluR2-TMD показал значительно более высокую долю двухэтапного фотообесцвечивания по сравнению с mGluR5-TMD и mGluR3-TMD. Это говорит о том, что природа взаимодействий между TMD различается среди подтипов mGluR. Хотя мы не ожидаем, что эти различия изменят стехиометрию полноразмерных рецепторов, относительная сила взаимодействий между TMD может регулировать свойства активации для различных комбинаций димеров.Кроме того, повышенная сила димеризации TMD mGluR2 может объяснить, почему поперечное связывание mGluR2 в неактивном состоянии наблюдалось в Xue et al., (2015), но этот интерфейс TMD наблюдался только в связанном с агонистом состоянии в крио-ЭМ mGluR5. исследование (Koehl et al., 2019).

    Чтобы расширить этот анализ, мы провели тот же эксперимент на изолированном, меченном SNAP TMD mGluR1 и наблюдали ~ 30% двухэтапного фотообесцвечивания, которое было похоже на TMD mGluR3 и mGluR5, но значительно меньше, чем у mGluR2, и больше, чем у TMD mGluR2. β-2-адренорецептор (см. обновленный рисунок 2D).Этот результат дополнительно подтверждает общую склонность к димеризации TMD mGluR и уникальность интерфейса димера TMD mGluR2.

    13) Подраздел «Положительные аллостерические модуляторы напрямую активируют mGluR2 с минимальным вкладом внеклеточных доменов»: «Применение LY48 к клеткам, экспрессирующим mGluR2 и GIRK, вызывало большие обратимые внутренние токи, которые по амплитуде были аналогичны тем, которые индуцируются насыщением глутаматом (рис. 1B). , Рисунок 1—дополнение к рисунку 1А).«Это неправда; данные показывают, что реакция на глутамат составляет 70 %.

    Приносим извинения за эту неточность и соответствующим образом изменили текст.

    14) Рисунок 6C: подгонка к данным для MNI 137 не имеет смысла; оба должны быть опущены, показывая только Ro 64.

    Благодарим судей за указание на эту ошибку. Мы не имели в виду, что возможна подгонка к данным MNI-137. Мы решили сохранить точки данных без какой-либо подгонки на графике для сравнения с Ro 64, поскольку мы хотели бы прояснить, что Ro 64, но не MNI-137, вызывает измеримое изменение FRET.

    15) Рисунок 6, панели D-F: неясно, как оценивался обратный агонизм в F и как это соотносится с необработанными данными в D и E.

    Мы благодарим рецензентов за указание на необходимость четко объяснить, как рассчитывался обратный агонизм. Мы добавили описание этого в раздел «Материалы и методы». Вкратце, обратный агонизм рассчитывали как абсолютное значение амплитуды ответа на NAM, деленное на общий ток. Общий ток определяли как сумму амплитуды ответа NAM и амплитуды ответа глутамата.

    [Примечание редактора: перед принятием были запрошены дополнительные изменения, как описано ниже.]

    Основные версии:

    В этой пересмотренной рукописи авторы намного лучше представляют свою работу в контексте предыдущих исследований mGluRs, четко объясняя, как комбинация независимых измерений FRET как для LBD, так и для TMD в функционально активных GPCR в более контролируемых условиях , дает более полное представление о действии аллостерических модуляторов и димерных сборок mGluR. Ограничением исследования является то, что как положительные, так и некоторые отрицательные аллостерические модуляторы дают одно и то же изменение FRET в TMD, которое авторы моделируют как отражение двух разных, но неизвестных конформаций. Несмотря на это ограничение, работа делает успехи, которые должны представлять интерес для тех, кто работает над GPCR типа C, и, возможно, для более широкой аудитории. Хотя рукопись значительно улучшена, особенно в аннотации и введении, пересмотренный раздел «Обсуждение» читается как свободная ассоциация весьма спекулятивных идей, некоторые из которых выходят далеко за рамки того, что на самом деле могут дать данные.Мы призываем авторов сократить обсуждение, особенно предположения об эволюции, кинетике и исследованиях in vivo.

    Мы благодарим рецензентов за положительную оценку исправленной рукописи и их конструктивные предложения по дальнейшему улучшению. Как и было предложено, мы оптимизировали обсуждение, чтобы удалить отрывки, которые являются чрезмерно спекулятивными и отклоняются от данных, представленных в этом исследовании. Изменения выделены желтым цветом в исправленной рукописи и включают следующее:

    — Мы удалили предложение, оспаривающее интерпретацию предыдущих нейрофизиологических и поведенческих исследований с PAM, поскольку наши данные не касаются этого вопроса напрямую (раздел «Обсуждение»).

    — Мы удалили обсуждение потенциальных различий в аллостерическом сайте связывания между лигандами. Учитывая отсутствие надежных структурных данных в этой области, мы решили вместо этого просто заявить, что различия в аллостерической эффективности, вероятно, являются результатом различных положений в пределах общего сайта связывания.

    — Мы удалили короткий отрывок об отсутствии эволюционных ограничений на аллостерический сайт связывания, чтобы избежать спекуляций (раздел «Обсуждение»).

    — Мы удалили гипотезу о потенциальной роли мембранно-лекарственных взаимодействий в кинетике активации рецепторов и обсуждение возможного зависимого от состояния доступа NAM к аллостерическому сайту связывания (раздел «Материалы и методы»).

    — Мы удалили гипотезу о потенциальных различиях PAM mGluR2 in vivo и возможности смещенных аллостерических лигандов для mGluRs (раздел «Материалы и методы»). Теперь мы просто упомянем, что наша работа мотивирует сравнительные исследования эффективности и времени действия различных аллостерических модуляторов.

    https://doi.org/10.7554/eLife.45116.029

    c-Myc (человек) LANCE Ultra TR-FRET Detection Kit, 500 точек анализа

    проверить количество

    Только для исследовательских целей; не для диагностических процедур.Все продукты должны использоваться в соответствии с применимыми законами и правилами, включая, помимо прочего, требования к потреблению и утилизации в соответствии с европейскими правилами REACH (EC 1907/2006).

    Запросить дополнительную информацию купить сейчас Добавить в корзину Запрос цитаты

    Пожалуйста, введите действительное количество

    Пожалуйста, войдите, чтобы добавить в избранное.

    ПУСТАЯ ИЛИ ПУСТАЯ КОРЗИНА

    Обзор

    Набор для обнаружения c-Myc LANCE Ultra предназначен для обнаружения и количественного определения пептидной метки c-Myc в буферных растворах и средах для культивирования клеток с использованием гомогенного анализа TR-FRET (без этапов промывки, без этапов разделения).

    • Без промывки, без разделения
    • Технология TR-FRET
    • Чувствительное обнаружение
    • Высокая воспроизводимость
    • Более быстрое получение результатов
    • Легкая автоматизация
    • 96-луночный, 384-луночный и 1536-луночный форматы

    LANCE и LANCE (возбуждение хелата лантанидов) Ultra — это наши TR-FRET (передача энергии резонанса флуоресценции с временным разрешением), гомогенные (без промывки) технологии.Одно представляющее интерес антитело помечено акцепторным флуорофором [краситель U Light ™]. «Трейсерный» аналит биотинилирован и связывает стрептавидин, меченный донорным Eu-хелатом. При возбуждении на длине волны 320 или 340 нм энергия может передаваться от донорного хелата европия к акцепторному флуорофору, если он достаточно близок для FRET (~ 10 нм). Это приводит к излучению света с длиной волны 665 нм. В присутствии достаточного количества небиотинилированного аналита это излучение будет уменьшено.

    Полипептидная метка c-myc получена из гена c-myc.Метку можно использовать во время аффинной хроматографии и для отделения белка дикого типа от рекомбинантного белка. Метка c-myc может использоваться в анализах непрямого обнаружения, для которых нет антител к мишени.

    Характеристики
    Мишень для анализа с-Мус
    Целевой класс анализа Пептид
    Совместимость с автоматикой Да
    Метод обнаружения Флуоресценция с временным разрешением (TRF), TR-FRET
    Торговая марка продукта КОРПУС Ультра
    Условия поставки Синий лед
    Терапевтическая зона Онкология
    Типоразмер 500 точек анализа
    более

    Одномолекулярная FRET-визуализация димеров GPCR в живых клетках — Mayo Clinic

    @article{0488510b6d974a318b255c2e745cf9d4,

    title = «Одномолекулярная FRET-визуализация димеров GPCR в живых клетках»,

    abstract Известно, что рецепторы (GPCR) образуют стабильные гомодимеры или гетеродимеры, важные для функционирования, но олигомерный статус рецепторов классов A и B, которые составляют >90% всех GPCR, остается предметом горячих дискуссий. Резонансный перенос энергии флуоресценции одной молекулы (smFRET) — это мощный подход, который может раскрыть ценную информацию об организации GPCR, но редко используется в живых клетках для изучения белковых систем. Здесь мы сообщаем об общеприменимых методах использования smFRET для обнаружения и отслеживания трансмембранных белков, диффундирующих в плазматической мембране клеток млекопитающих. Мы используем этот внутриклеточный подход smFRET, чтобы показать индуцированную агонистом структурную динамику в отдельных димерах метаботропных рецепторов глутамата.Мы применяем эти методы к репрезентативным рецепторам классов A, B и C, находя доказательства существования мономеров рецепторов, димеров, зависящих от плотности, и конститутивных димеров, соответственно». {Майкл Д.} и Гилмор, {Грант Т.} и Пати, {Авик К.} и Йожеф Месарош и Терри, {Дэниел С.} и Сигне Матиасен и Калишевски, {Меган Дж.} и Макколи, {Митчел Д. } и Алехья Говиндараджу, Чжоу Чжоу и Харикумар, {Калекал Г.} и Хулуд Джакаман и Миллер, {Лоуренс Дж.

    No related posts.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *