Мультивен характеристики: Технические характеристики автомобилей Volkswagen Multivan / Фольксваген Мультивэн

Содержание

Технические характеристики Фольксваген Мультивен ‒ длина, размеры Volkswagen Multivan 2021-2020

Фаворит Хофф на Варшавке

Официальный дилер Volkswagen

Multivan

Цена от 2 822 200

Доступные двигатели

	2.0 TSI 150л.с.	2.0 TSI 204л.с.	2.0 TDI 102л.с	2.0 TDI 140л.с	2.0 TDI BMT 150л.с	2.0 biTDI 180л.с.	2.0 biTDI 204л.с
Тип двигателя	Бензиновый	Бензиновый	Дизельный	Дизельный	Дизельный	Дизельный	Дизельный
Число цилиндров, рабочий объём (см³)	4, 1968	4, 1968	4, 1968	4, 1968	4, 1968	4, 1968	4, 1968
Максимальная мощность (кВт)	110 при 3750-6000об/мин	150 при 4200-6000об/мин	75 при 3500об/мин	103 при 3500об/мин	110 при 3250-3750об/мин	132 при 4000об/мин	150 при 4000об/мин
Максимальный крутящий момент (Нм)	280 при 1500-3750об/мин	350 при 1500-4000об/мин	250 при 1500-2500об/мин	340 при 1750-2500об/мин	340 при 1500-3000об/мин	400 при 1500-2000об/мин	450 при 1400-2400об/мин
Объём бака (л)	80	80	80	80	70 (опция — 80)	80	70 (опция — 80)
Ручная коробка передач	Механическая	—	Механическая	—	—	—	—
Автоматическая коробка передач	—	DSG	—	DSG	DSG	DSG	DSG
Привод	Передний	Передний / Полный	Передний	Передний	Передний / Полный	Передний / Полный	Передний / Полный

Расход топлива Volkswagen Multivan

	КПП, привод	Экологический стандарт	Максимальная скорость (км/ч)	Выброс CO₂ в среднем (г/км)	Расход топлива в городе / по трассе / в среднем от — до (л/100км)	Ускорение 0-80 / 0-100км/ч (с)	Эластичность 80-120км/ч, 4/5/6-я передача или «D» на АКПП (с)
2.0 TSI 150л.с. (110кВт)	МКПП, передний	Euro 5	182	224	12.8 / 7.8 / 9.6	7.4 / 11.5	— / 15.4 / 21.2
2.0 TSI 204л.с. (150кВт)	DSG, передний	Euro 5	202	236	13.5 / 8.1 / 10.1	6.1 / 8.7	6.1
2.0 TSI 204л.с. (150кВт)	DSG, полный	Euro 5	198	245	14.0 / 8.5 / 10.5	6.4 / 9.1	6.4
2.0 TDI 102л.с. (75кВт)	МКПП, передний	Euro 5	157	193	9.5 / 6.1 / 7.3	10.1 / 16.4	15.0 / 19.0 / —
2.0 TDI 140л.с. (103кВт)	МКПП, передний	Euro 5	173	198	9.6 / 6.3 / 7.5	8.4 / 13.1	— / 14.4 / 19.0
2.0 TDI 140л.с. (103кВт)	DSG, передний	Euro 5	172	211	10.2 / 6.7 / 8.0	8.4 / 13.0	10.6
2.0 TDI 140л.с. (103кВт)	МКПП, полный	Euro 5	170	219	10.4 / 7.1 / 8.3	8.6 / 13.6	— / 14.6 / 21.1
2.0 TDI BMT 150л.с. (110кВт)	DSG, передний	Euro 6	181	156	6.7-6.8 / 5.5-5.6 / 6.0-6.1	7.8 / 12.0	10.5
2.0 TDI BMT 150л.с. (110кВт)	DSG, полный	Euro 6	178	167	7.1 / 6.0 / 6.4	8.0 / 12.5	11.0
2.0 biTDI 180л.с. (132кВт)	DSG, передний	Euro 5	191	208	10.0 / 6.7 / 7.9	7.1 / 10.2	7.5
2.0 biTDI 180л.с. (132кВт)	DSG, полный	Euro 5	188	232	11.1 / 7.5 / 8.8	7.4 / 10.8	8.3
2.0 biTDI BMT 204л.с. (150кВт)	DSG, передний	Euro 6	203	173	8.0 / 5.8 / 6.6	6.3 / 9.1	6.5
2.0 biTDI BMT 204л.с. (150кВт)	DSG, полный	Euro 6	199	178	8.1 / 6.1 / 6.8	6.5 / 9.6	7.5

Надежные турбодизельные моторы мощностью 102, 140, либо 180 л.с., а также 150 или 204-сильные бензиновые двигатели TSI специально подобраны для шестого поколения легендарных Volkswagen Multivan. Технические характеристики просторного 7-местного автомобиля, такие как динамика и расход топлива, сравнимы с показателями легковой машины. Максимальная скорость автомобиля с бензиновым силовым агрегатом составляет 200 км/ч, при этом колесная база короткой версии равна впечатляющим 3000 мм, а в длинном кузове эта величина достигает целых 3400 мм.

Коммерческий автомобиль бизнес-класса, независимо от того, какой тип трансмиссии Вы выберете, опционально оборудован системой полного привода 4MOTION, позволяющей VW Multivan легко справляться с любыми дорожными ситуациями. Высокий дорожный просвет в любой комплектации гарантирует отличную проходимость новому Фольксваген Мультивен. Технические характеристики автомобилей 2021-2020 года подробно описаны в таблице. Дополнительную информацию о Volkswagen Multivan можно получить в салоне официального дилера немецкой марки в Москве – в дилерском центре Фольксваген Фаворит Хофф.

Фаворит Хофф на Варшавке

Москва, 1-й Дорожный проезд, д.4, стр.1

пн.-пт.: 09:00-21:00

Volkswagen Multivan — обзор, цены, видео, технические характеристики Фольксваген Мультивен

Одна из модификаций нового Volkswagen T7 называется Multivan. Популярный микроавтобус от немецкого производителя теперь предлагается только как семейный автомобиль либо бизнес-шаттл. Современная стильная внешность скрывает под собой небольшую революцию в линейке «Мультивэнов». Ведь именно Т7 сделан на новой модульной платформе компании. Она сменила уже устаревшую T5, которая была в строю с 2002-го. Поэтому новинка от VW является ультрасовременной и внешне, и по содержанию.

РАЗМЕРЫ

Точные размеры пока не приведены, но производитель дал понять, что по всем основным параметрам новая модель будет отличаться от предшественницы не сильно, но в сторону увеличения. Стоит ждать прибавки в высоте, колесной базе и колее. Машина стала эффективнее и вместительнее предшественницы.

ДВИГАТЕЛИ И ТРАНСМИССИЯ

Новый микроавтобус дебютировал в лице гибридной версии, которая называется eHybrid. Здесь 150-сильный мотор 1,4 TSI работает в паре с 85-киловаттным электромотором. Суммарная мощность установки – 218 л.с. Через шестиступенчатую роботизированную DSG тяга передается на передние колеса. Под полом автомобиля располагается батарея на 13 кВт/ч. Пока не известно, сколько километров и с какой скоростью машина способна проезжать только на электричестве. Также на автомобиль будут устанавливать бензиновые двигатели 1,5 TSI (136 л.с.) и 2,0 TSI (204 л.с.). Годом позже в гамме появится турбодизель мощностью 150 сил. Со всеми моторами идет семиступенчатый «робот» DSG. Привод только передний.

ОСНАЩЕНИЕ

В базовом оснащении VW Multivan можно обнаружить: систему Ready 2 Discover с подключением к сервисам We Connect и We Connect Plus с навигационной системой и информацией о пробках в реальном времени, слоты для подключения смартфонов. Здесь также установлен комплекс связи Car2X, системы помощи при вождении и безопасности IQ.Drive (в частности машина может двигаться на скорости о 0 до 210 км/ч в полуавтоматическом режиме). Цифровая приборная панель представлена дисплеем диагональю 10,25 дюйма, центральный монитор — на 10 дюймов. Редкость для коммерческого автомобиля – возможна установка проекционного дисплея на лобовом стекле. Система трансформации салона стала удобнее. Кресла двигаются в широком диапазоне, сиденья второго ряда можно разворачивать на 180 градусов. В центре салона обнаруживается многофункциональный подлокотник (с выдвижными столиками). Его можно двигать по направляющим от одного конца салона до другого, настраивать по высоте. Новая конструкция сидений сделала их на 25% легче прошлых, демонтаж отнимет меньше сил. Планируется также выпуск удлинённой версии автомобиля, в которой за передними сиденьями можно будет освободить погрузочную площадку общим объемом в 4053 л.

В базе есть еще и функция автоматического торможения в городе, а также активное удержание полосы. Опционально — аудиосистема Harman/Kardon (840 Вт, 14 динамиков). Другие опции – панорамная крыша или матричные фары IQ.Light (в «базе» — диоды).

ИТОГ

На европейских рынках новый «Мультивэн» должен появиться ближе к концу лета 2021 года. Цены пока не объявлены. Машину стоит ожидать и в России, но еще позже. Никаких сроков пока объявлено не было.

ВИДЕО

Технические характеристики Multivan 6.1

Фольксваген Центры Авторусь

Официальные дилеры Volkswagen

Multivan

Цена от 4 058 400

Multivan (короткая база)

Расход топлива и динамические характеристики Volkswagen Multivan

Короткая база

	КПП, привод	Экологический стандарт	Максимальная скорость (км/ч)	Выброс CO₂ в среднем (г/км)	Расход топлива в городе / по трассе / в среднем от — до (л/100км)	Ускорение 0-80 / 0-100км/ч (с)	Эластичность 80-120км/ч, 4/5/6-я передача или «D» на АКПП (с)
2.0 TSI 150л.с. (110кВт)	МКПП, передний	Euro 5	182	224	12.8 / 7.8 / 9.6	7.4 / 11.5	— / 15.4 / 21.2
2.0 TSI 204л.с. (150кВт)	DSG, передний	Euro 5	202	236	13.5 / 8.1 / 10.1	6.1 / 8.7	6.1
2.0 TSI 204л.с. (150кВт)	DSG, полный	Euro 5	198	245	14.0 / 8.5 / 10.5	6.4 / 9.1	6.4
2.0 TDI 102л.с. (75кВт)	МКПП, передний	Euro 5	157	193	9.5 / 6.1 / 7.3	10.1 / 16.4	15.0 / 19.0 / -
2.0 TDI 140л.с. (103кВт)	МКПП, передний	Euro 5	173	198	9.6 / 6.3 / 7.5	8.4 / 13.1	— / 14.4 / 19.0
2.0 TDI 140л.с. (103кВт)	DSG, передний	Euro 5	172	211	10.2 / 6.7 / 8.0	8.4 / 13.0	10.6
2.0 TDI 140л.с. (103кВт)	МКПП, полный	Euro 5	170	219	10.4 / 7.1 / 8.3	8.6 / 13.6	— / 14.6 / 21.1
2.0 TDI BMT 150л.с. (110кВт)	DSG, передний	Euro 6	181	156	6.7-6.8 / 5.5-5.6 / 6.0-6.1	7.8 / 12.0	10.5
2.0 TDI BMT 150л.с. (110кВт)	DSG, полный	Euro 6	178	167	7.1 / 6.0 / 6.4	8.0 / 12.5	11.0
2.0 biTDI 180л.с. (132кВт)	DSG, передний	Euro 5	191	208	10.0 / 6.7 / 7.9	7.1 / 10.2	7.5
2.0 biTDI 180л.с. (132кВт)	DSG, полный	Euro 5	188	232	11.1 / 7.5 / 8.8	7.4 / 10.8	8.3
2.0 biTDI BMT 204л.с. (150кВт)	DSG, передний	Euro 6	203	173	8.0 / 5.8 / 6.6	6.3 / 9.1	6.5
2.0 biTDI BMT 204л.с. (150кВт)	DSG, полный	Euro 6	199	178	8.1 / 6.1 / 6.8	6.5 / 9.6	7.5

Массы и нагрузки Volkswagen Multivan

Короткая база

	Экологический стандарт	Разрешённая полная масса (кг)	Снаряжённая масса, от (кг)	Грузоподъёмность, до (кг)	Максимальная нагрузка на ось перед. / зад. (кг)	Максимальный вес прицепа при уклоне до 12% с тормозами / без тормозов (кг)	Разрешённая полная масса автопоезда при уклоне до 12% (кг)
2.0 TSI 150л.с. (110кВт), 4×2, МКПП	Euro 5	3000	2007	993	1620/1515 / 1575	2500 / 750	5200
2.0 TSI 204л.с. (150кВт), 4×2, DSG	Euro 5	3080	2053	1027	1620/1515 / 1575	2500 / 750	5300
2.0 TSI 204л.с. (150кВт), 4×4, DSG	Euro 5	3080	2163	917	1620/1515 / 1575	2500 / 750	5300
2.0 TDI 102л.с. (75кВт), 4×2, МКПП	Euro 5	3000	1976	1024	1610/1515 / 1575	2200 / 750	4900
2.0 TDI 140л.с. (103кВт), 4×2, МКПП	Euro 5	3000	1980	1020	1610/1515 / 1575	2500 / 750	5200
2.0 TDI 140л.с. (103кВт), 4×2, DSG	Euro 5	3000	2005	995	1610/1515 / 1575	2500 / 750	5300
2.0 TDI 140л.с. (103кВт), 4×4, МКПП	Euro 5	3000	2129	951	1620/1515 / 1575	2500 / 750	5300
2.0 TDI BMT 150л.с. (110кВт), 4х2, DSG	Euro 6	3000 (3080)	2047	953 (1033)	1610 (1620) / 1515/1575	2500 / 750	5300
2.0 TDI BMT 150л.с. (110кВт), 4х4, DSG	Euro 6	3080	2180	900	1610/1515 / 1575	2500 / 750	5300
2.0 biTDI 180л.с. (132кВт), 4×2, DSG	Euro 5	3080	2055	1025	1620/1515 / 1575	2500 / 750	5300
2.0 biTDI 180л.с. (132кВт), 4×4, DSG	Euro 5	3080	2184	896	1620/1515 / 1575	2500 / 750	5300
2.0 biTDI BMT 204л.с. (150кВт), 4×2, DSG	Euro 6	3080	2093	987	1610/1515 / 1575	2500 / 750	5300
2.0 biTDI BMT 204л.с. (150кВт), 4×4, DSG	Euro 6	3080	2195	885	1610/1515 / 1575	2500 / 750	5300

Габариты Volkswagen Multivan

Площадь салона (включая багажное пространство) : 4.3м³
Проём боковой сдвижной двери, ширина х высота : 1011 х 1247мм
Проём задней подъёмной двери, ширина х высота : 1438 х 1262мм
Минимальный диаметр поворота : 11.9м **

* Данные значения зависят от варианта подвески и размеров колёс. Приведённые значения для базовой комплектации Trendline, Comfortline, Highline
** Значение представляет собой расстояние от центра поворота (разворота) до самой удалённой от точки автомобиля в стандартной комплектации

Multivan (длинная база)

Расход топлива и динамические характеристики Volkswagen Multivan

Длинная база

	КПП, привод	Экологический стандарт	Максимальная скорость (км/ч)	Выброс CO₂ в среднем (г/км)	Расход топлива в городе / по трассе / в среднем от — до (л/100км)
2.0 TSI 150л.с. (110кВт)	МКПП, передний	Euro 5	182	224	12.8 / 7.8 / 9.6
2.0 TSI 204л.с. (150кВт)	DSG, передний	Euro 5	202	236	13.5 / 8.1 / 10.1
2.0 TSI 204л.с. (150кВт)	DSG, полный	Euro 5	198	245	14.0 / 8.5 / 10.5
2.0 TDI 102л.с. (75кВт)	МКПП, передний	Euro 5	157	193	9.5 / 6.1 / 7.3
2.0 TDI 140л.с. (103кВт)	МКПП, передний	Euro 5	173	198	9.6 / 6.3 / 7.5
2.0 TDI 140л.с. (103кВт)	DSG, передний	Euro 5	172	211	10.2 / 6.7 / 8.0
2.0 TDI 140л.с. (103кВт)	МКПП, полный	Euro 5	170	219	10.4 / 7.1 / 8.3
2.0 TDI BMT 150л.с. (110кВт)	DSG, передний	Euro 6	181	156-158	6.7-6.8 / 5.5-5.6 / 6.0-6.1
2.0 TDI BMT 150л.с. (110кВт)	DSG, полный	Euro 6	178	167	7.1 / 6.0 / 6.4
2.0 biTDI 180л.с. (132кВт)	DSG, передний	Euro 5	191	208	10.0 / 6.7 / 7.9
2.0 biTDI 180л.с. (132кВт)	DSG, полный	Euro 5	188	232	11,1 / 7,5 / 8,8
2.0 biTDI BMT 204л.с. (150кВт)	DSG, передний	Euro 6	203	173	8.0 / 5.8 / 6,6
2.0 biTDI BMT 204л.с. (150кВт)	DSG, полный	Euro 6	199	178	8.1 / 6.1 / 6.8

Массы и нагрузки Volkswagen Multivan

Длинная база

	Экологический стандарт	Разрешённая полная масса (кг)	Снаряжённая масса, от (кг)	Грузоподъёмность, до (кг)	Максимальная нагрузка на ось перед. / зад. (кг)	Максимальный вес прицепа при уклоне до 12% с тормозами / без тормозов (кг)	Разрешённая полная масса автопоезда при уклоне до 12% (кг)
2.0 TSI 150л.с. (110кВт), 4×2, МКПП	Euro 5	3080	2104	976	1620/1680 / 1600	2500 / 750	5200
2.0 TSI 204л.с. (150кВт), 4×2, DSG	Euro 5	3080	2123	957	1620/1680 / 1600	2500 / 750	5300
2.0 TSI 204л.с. (150кВт), 4×4, DSG	Euro 5	3080	2233	847	1620/1680 / 1600	2500 / 750	5300
2.0 TDI 102л.с. (75кВт), 4×2, МКПП	Euro 5	3080	2034	1046	1620/1680 / 1600	2200 / 750	4900
2.0 TDI 140л.с. (103кВт), 4×2, МКПП	Euro 5	3080	2076	1004	1620/1680 / 1600	2500 / 750	5200
2.0 TDI 140л.с. (103кВт), 4×2, DSG	Euro 5	3080	2102	978	1620/1680 / 1600	2500 / 750	5300
2.0 TDI 140л.с. (103кВт), 4×4, МКПП	Euro 5	3080	2198	882	1620/1680 / 1600	2500 / 750	5300
2.0 TDI BMT 150л.с. (110кВт), 4х2, DSG	Euro 6	3080	2140	940	1610/1680 / 1600	2500 / 750	5300
2.0 TDI BMT 150л.с. (110кВт), 4х4, DSG	Euro 6	3080	2250	830	1610/1680 / 1600	2500 / 750	5300
2.0 biTDI 180л.с. (132кВт), 4×2, DSG	Euro 5	3080	2124	956	1620/1680 / 1600	2500 / 750	5300
2.0 biTDI 180л.с. (132кВт), 4×4, DSG	Euro 5	3080	2228	852	1620/1680 / 1600	2500 / 750	5300
2.0 biTDI BMT 204л.с. (150кВт), 4×2, DSG	Euro 6	3080	2162	918	1610/1680 / 1600	2500 / 750	5300
2.0 biTDI BMT 204л.с. (150кВт), 4×4, DSG	Euro 6	3080	2265	815	1610/1680 / 1600	2500 / 750	5300

Габариты Volkswagen Multivan

Площадь салона (включая багажная пространство) : 5.0м³
Проём боковой сдвижной двери, ширина х высота : 1011 х 1247мм
Проём задней подъёмной двери, ширина х высота : 1438 х 1262мм
Минимальный диаметр поворота : 13.2м *

* Значение представляет собой расстояние от центра поворота (разворота) до самой удалённой от точки автомобиля в стандартной комплектации

Двигатели Volkswagen Multivan

	2.0 TSI 150л.с.	2.0 TSI 204л.с.	2.0 TDI 102л.с.	2.0 TDI 140л.с.	2.0 TDI BMT 150л.с.	2.0 biTDI 180л.с.	2.0 biTDI BMT 204л.с.
Тип двигателя*	Бензиновый	Бензиновый	Дизельный	Дизельный	Дизельный	Дизельный	Дизельный
Число цилиндров, рабочий объём (см³)	4, 1968	4, 1968	4, 1968	4, 1968	4, 1968	4, 1968	4, 1968
Максимальная мощность (кВт)	110 при 3750-6000 об/мин	150 при 4200-6000 об/мин	75 при 3500 об/мин	103 при 3500 об/мин	110 при 3250-3750 об/мин	132 при 4000 об/мин	150 при 4000 об/мин
Максимальный крутящий момент (Нм)	280 при 1500-3750об/мин	350 при 1500-4000об/мин	250 при 1500-2500об/мин	340 при 1750-2500об/мин	340 при 1500-3000об/мин	400 при 1500-2000об/мин	450 при 1400-2400об/мин
Объём бака (л)	80	80	80	80	70 (опция – 80)**	80	70 (опция – 80)**
Ручная коробка передач	Механическая	-	Механическая	Механическая	-	-	-
Автоматическая коробка передач	-	DSG	-	DSG	DSG	DSG	DSG
Привод	Передний	Передний / Полный	Передний	Передний	Передний / Полный	Передний / Полный	Передний / Полный
Экологический стандарт ЕС, Экологический класс РФ	Euro-5, Пятый	Euro-5, Пятый	Euro-5, Пятый	Euro-5, Пятый	Euro-6, Пятый	Euro-5, Пятый	Euro-6, Пятый

*TSI и MPI — бензиновые двигатели, TDI и biTDI — дизельные двигатели, BMT — BlueMotion Technologies
**Уменьшает грузоподъёмность на примерно 7кг.

Любая информация, содержащаяся на настоящем сайте официального дилера, носит исключительно справочный характер и ни при каких обстоятельствах не может быть расценена как предложение заключить договор (публичная оферта). Фольксваген Россия не дает гарантий по поводу своевременности, точности и полноты информации на веб-сайте, а также по поводу беспрепятственного доступа к нему в любое время. Технические характеристики и оборудование автомобилей, условия приобретения авто, цены, спецпредложения и комплектации автомобилей, указанные на сайте, приведены для примера и могут быть изменены в любое время без предварительного уведомления.

Volkswagen Multivan (T4) характеристики, фотографии и обзор

Второе поколение «премиального» микроавтобуса Volkswagen Multivan с индексом «T4» появилось на свет в 1992 году, изменившись по сравнению с прежней моделью кардинальным образом – оно не просто получило полностью перекроенный дизайн, но и стало соврешенно другим с технической точки зрения. В 1996-м автомобиль подвергся небольшому обновлению, в рамках которого ему удлинили «нос» для размещения крупного двигателя V6.

Производство однообъемника немцы свернули в 2003 году, выпустив модель очередной генерации.

«Мультивен» второго воплощения представляет собой микроавтобус премиум-класса, ориентированный, в первую очередь, на перевозку пассажиров (хотя может быть использован и в качестве семейного автомобиля).

Габаритные размеры у «немца» таковы: 4789 мм в длину, 1920 мм в высоту и 1840 мм в ширину. Величина колесный базы и дорожного просвета у него насчитывают 2920 мм и 160 мм соответственно, а снаряженный вес колеблется от 1872 до 2071 кг в зависимости от версии.

Технические характеристики. Одна из особенностей «второго» Volkswagen Multivan – широчайший спектр доступных двигателей:

Дизельная линейка автомобиля – это рядные четырех- и пятицилиндровые моторы объемом 1.9-2.5 литра с непосредственным впрыском и турбонаддувом, развивающие 68-150 лошадиных сил и 133-295 Нм крутящего момента.
Бензиновая часть состоит из рядных «четверок» на 2.0-2.5 литра, генерирующих 84-115 «коней» и 159-200 Нм пиковой тяги, и 2.8-литровых моторов V6, вырабатывающих 140-204 «скакуна» и 240-245 Нм доступного потенциала.

В арсенале трансмиссий – 5-скоростная «механика» или 4-диапазонный «автомат». По умолчанию весь запас тяги направляется на передние колеса, а для некоторых модификаций предусматривается полноприводная трансмиссия с многодисковой муфтой, подающей мощность на заднюю ось.

В основе «Мультивена» находится архитектура «Volkswagen T4» с независимой подвеской на двойных поперечных рычагах спереди и полузависимой системой с косыми рычагами, телескопическими амортизаторами и винтовыми пружинами сзади.
На микроавтобусе применен реечный рулевой механизм с гидроусилителем. Все колеса автомобиля оборудованы дисковыми тормозами, дополненными ABS вне зависимости от модификации.

Достоинствами Volkswagen Multivan T4 принято считать: солидную внешность, качественный и функциональный салон, отличные «ездовые» характеристики, тяговитые двигатели, высокий уровень безопасности, хорошее оснащение, надежную конструкцию и комфортабельную подвеску.
Среди недостатков однообъемника владельцы чаще выделяют: высокую стоимость самого автомобиля и его содержания, маленький клиренс и большой расход топлива.

Отзывы

Технические характеристики Volkswagen Multivan

Фольксваген Центр Максимум

Официальный дилер Volkswagen

Несомненное превосходство. Уже в шестом поколении

Сразу перейдём к делу: Multivan близок к совершенству. И этому есть строгое научное объяснение: история модели насчитывает более 65 лет! У компании Volkswagen было время, чтобы учесть все пожелания потенциальных клиентов. Multivan шестого поколения — это универсальный семиместный автомобиль бизнес-класса с просторным трансформируемым салоном, мощными экономичными двигателями, опциональным полным приводом, современными ассистентами водителя и новейшими инфомедиа-системами. Заметим: Multivan любят и ценят не только в «деловых кругах». Он отлично подходит на роль вместительного семейного автомобиля, прекрасно приспособленного и к жизни в большом городе, и к длительным вояжам.

Акции и спецпредложения

Покупка

Новый будет лучше! Для ценителей больших автомобилей

Специальные условия на покупку нового Volkswagen взамен старого.

Специальные версии

Запишитесь на тест-драйв!

Купить Volkswagen Multivan в автосалоне Максимум можно после предварительной тестовой поездки. Чтобы пройти тест-драйв в автосалоне Максимум, нужно предъявить паспорт и удостоверение водителя. В ходе небольшого испытания Вы лично сможете убедиться в возможностях автомобиля, оценив ходовые качества и уровень комфорта.

Кредитный калькулятор

Не откладывайте перемены к лучшему!

Особенности

Функциональность

Хорошо сидим!

Техника

Большой динамичный автомобиль со скромным расходом

Комфорт

Комфорт — понятие всеобъемлющее

Безопасность и ассистенты

В хорошей компании

Индивидуальное предложение

Оставьте свой номер телефона — и мы перезвоним с уникальным предложением!

Технические характеристики и габариты Volkswagen Multivan

Multivan. Готовы заказать?

Уже выбрали автомобиль? Заполните форму, и наш менеджер поможет вам довести покупку до конца без лишних хлопот.

Volkswagen Multivan

Микроавтобус Фольксваген Мультивен выпускается с далеких 1950-х годов. Модель шестого поколения (T6) представляет собой современный и функциональный автомобиль с узнаваемой внешностью, богатой отделкой и достойными техническими характеристиками.

Купить Фольксваген Мультиван можно в автохолдинге «Максимум», который является официальным дилером немецкого бренда в Санкт-Петербурге. Мы предлагаем не только новые автомобили, но и с пробегом. Оплата возможна наличными, в кредит и лизинг, либо через программу трейд-ин. Прямо в автосалоне можно оформить страховку.

Плюсы модели

Вместительность без ущерба удобству. При немалых габаритах микроавтобусом несложно управлять даже на тесных парковках и старых узких улицах. Этому способствуют его ровная геометрическая форма, камеры и парковочные радары, что существенно облегчает маневрирование в любых условиях.
Безграничная функциональность. Салон Volkswagen Multivan отличается практичностью, он продуман до мельчайших деталей. Здесь предусмотрено множество ниш, карманов и перчаточных ящиков. Кнопки, переключатели и другие элементы управления расположены максимально удобно.
Комфорт в движении. По праву старшего микроавтобуса в модельном ряду Multivan обладает наибольшим количеством плюсов. Это мягкая подвеска, плавность движения, отделка качественными материалами и многое другое. Также нельзя забывать про полный привод, это всегда плюс для внушительного автомобиля.

Автохолдинг «Максимум» предлагает приобрести Фольксваген Мультивен в Санкт-Петербурге в любой доступной комплектации. Микроавтобус доступен с бензиновым (150 л. с.) или дизельным (180 л. с.) силовым агрегатом, полно- или переднеприводной трансмиссией, механической или автоматической коробкой переключения передач.

Звоните по телефону, чтобы записаться на тест-драйв, узнать больше о вариантах, которые есть в продаже. Или закажите обратный звонок прямо на этом сайте.

Юридическая информация:

ООО «Максимум Приморский»
195299, г. Санкт-Петербург, улица Руставели дом 53, лит А, пом. 201
ОГРН 1177847034661
ИНН/КПП 7804588459/781601001

Любая информация, содержащаяся на настоящем сайте, носит исключительно справочный характер и ни при каких обстоятельствах не может быть расценена как предложение заключить договор (публичная оферта). Фольксваген Россия не дает гарантий по поводу своевременности, точности и полноты информации на веб-сайте, а также по поводу беспрепятственного доступа к нему в любое время. Технические характеристики и оборудование автомобилей, условия приобретения автомобилей, цены, спецпредложения и комплектации автомобилей, указанные на сайте, приведены для примера и могут быть изменены в любое время без предварительного уведомления.

Технические характеристики Volkswagen Multivan

Описание автомобиля Volkswagen Multivan

Volkswagen Multivan представляет собой комфортабельный микроавтобус бизнес-класса. Модель подверглась рестайлингу в 2010 году. В итоге Мультивэн приобрел более представительный внешний вид.

Усовершенствованный Multivan можно заслуженно отнести к «премиум-классу». Практика показала, что имеется не малое количество желающих заплатить очень большие деньги за комфорт в пути и весьма стильный имидж. Такая машина вполне может служить в качестве многофункционального представительского автомобиля для крупной компании.

Стоит отметить, что в роскошном салоне много места и оснащения даже для деловой встречи, совещания или презентации.

Флагманский минивэн Volkswagen Multivan выпускается с 2015 года. Этот вместительный, большой автомобиль предоставляет высокий уровень комфорта салона, в котором установлены кресла, оборудованные поворотным механизмом. Отделка внутреннего интерьера осуществляется качественными, дорогостоящими материалами, по кабине распределено множество ниш, предусмотрено наличие мест, куда можно уложить бутылки с напитками, продукты. Благодаря этим и многим другим качествам данная модель является для многих идеальным семейным транспортным средством, на котором можно отправиться в длительное путешествие, или использовать его для повседневных поездок.

Облик минивэна сформирован из простых, классических линий, тем не менее, благодаря ряду элементов дизайн машины не лишен индивидуальности. К таким элементам относятся блоки головного света, части, через которые осуществляется отбор воздуха к механизмам транспорта. На корме выделяются объемные задние фонари, декоративные вставки, нанесенные на дверь багажника. В список обязательного оснащения включена уникальная система трансформации, разделенная на две рабочих зоны климат контроль, автономная отопительная система, система бесключевого и дистанционного запуска силового агрегата. За дополнительную плату раздвижная дверь в пассажирский отсек может оснащаться сервоприводом.

Экстерьер

Высокие стойки ветрового стекла Volkswagen имеют небольшую толщину, что положительно сказывается на угле обзора с передних посадочных мест, по краям капота Multivan выполнена широкая вогнутая штамповка. Ее линии сходятся к пятиугольникам блоков основного света укомплектованных парными фарами круглой формы и светодиодными ходовыми огнями. В промежуток между головным светом уложена пара длинных жалюзи, за ними просматривается сетка. Широкий передний бампер наклонен под небольшим углом, его центр пересекает секция воздухозаборника закрытая несколькими горизонтально ориентированными планками. Под воздухозаборником скомпонованы противотуманные огни, между ними установлена узкая декоративная накладка.

Раздвижные двери в пассажирский отсек кабины располагаются с обоих бортов, боковые поверхности корпуса пересекают параллельные ребра жесткости, над порогами уложена декоративная небольшой ширины накладка из светлого металла. Объемные задние фонари смонтированы в вертикальном положении, между ними на дверях багажника имеется подсвеченная ниша номерного знака. На верхнюю кромку бампера наклонена декоративная накладка, по ее краям размещаются компактные габаритные огни. Габариты кузова составляют 5006/1904/1970 мм, высота дорожного просвета – 178 мм. Диаметр разворота – 11,9 метров, колесная база – 3000 мм, снаряженная/полная масса – 2149/3000 кг.

Интерьер

В кабине Volkswagen смогут поместиться семь человек, всем сидящим в салоне Multivan пассажирам предоставляются отдельные посадочные места, оборудованные откидными подлокотниками, поворотным механизмом, стойками поддержки, валиком поясного упора и подколенной подушкой. На бортах, возле задних сидений сформированы подстаканники, центр второго ряда кресел может трансформироваться в стол или во вместительную тумбу. Между передними креслами оставлен свободный проход, на внутренних поверхностях дверей прямо на подоконной линии установлена широкая накладка с клавишами управления сервоприводом окон. Ниже присутствует широкая ниша, в ее переднюю часть помещены динамики автозвука. На блок педалей нанесены накладки из нержавеющей стали, спицы руля используются под компоновку клавиш управления автозвуком. Приборный щиток оборудован двумя крупными шкалами и дисплеем бортового процессора. В центр передней панели помещены крупные вертикально ориентированные решетки воздуховодов, между ними установлен дисплей информационной системы. Ниже указанных элементов располагаются средства управления климатическим оборудованием и бортовыми системами. К нижней части передней панели примыкает широкая тумба оборудованная селектором трансмиссии, бардачком, средствами управления стереосистемой.

Технические характеристики

Бензиновый вариант Фольксваген Мультиван комплектуется 149-сильным мотором объемом 1984 см3. Он развивает до 280 Нм крутящего момента, время разгона – 12,5 секунды, средний уровень расхода топлива – 9,8 литров. Под капотом дизельной модификации машины устанавливается 102-сильный агрегат с крутящим моментом 250 Нм, с ним разгон до сотни достигается за 17,9 секунды, максимальный крутящий момент – 250 Нм, усредненный уровень потребления топлива – 7,5 литров.

Обзор Volkswagen Multivan: цена, технические характеристики

Технические характеристики Volkswagen Multivan

Цена	3 894 000 — 6 220 000 ₽
Мин. цена	3 894 000 ₽
Макс. цена	6 220 000 ₽
Модельный год	2019
Тип кузова	Минивэн
Длина, мм	4904-5304
Ширина, мм	1904
Высота, мм	1990
Количество дверей	4
Количество мест	8-9
Объем багажника, л	5000
Экологич. класс	ЕВРО 5
Гарантия	2 года без ограничения пробега
Страна сборки	Россия

Модификации Volkswagen Multivan

Volkswagen Multivan 2.0 TDI MT 150hp

Цена от	3 894 000 ₽
Максимальная скорость, км/ч	183
Время разгона до 100 км/ч, сек	12.9
Двигатель	Дизельный с турбонаддувом
Рабочий объем, см³	1968
Мощность, л.с. / оборотах	150/3250-3750
Момент, Н·м / оборотах	340/1500-3000
Расход комби, л на 100 км	6.8
Тип коробки передач	Механическая, 6 передач
Привод	Передний
Показать все характеристики

Volkswagen Multivan 2.0 TDI DSG 150hp

Цена от	4 123 000 ₽
Максимальная скорость, км/ч	179
Время разгона до 100 км/ч, сек	13.5
Двигатель	Дизельный с турбонаддувом
Рабочий объем, см³	1968
Мощность, л.с. / оборотах	150/3250-3750
Момент, Н·м / оборотах	340/1500-3000
Расход комби, л на 100 км	7.7
Тип коробки передач	Робот, 7 передач
Привод	Полный
Показать все характеристики

Volkswagen Multivan 2.0 TDI MT 150hp Long

Цена от	4 888 000 ₽
Максимальная скорость, км/ч	183
Время разгона до 100 км/ч, сек	12.9
Двигатель	Дизельный с турбонаддувом
Рабочий объем, см³	1968
Мощность, л.с. / оборотах	150/3250-3750
Момент, Н·м / оборотах	340/1500-3000
Расход комби, л на 100 км	6.9
Тип коробки передач	Механическая, 6 передач
Привод	Передний
Показать все характеристики

Volkswagen Multivan 2.0 TDI DSG 150hp Long

Цена от	5 143 000 ₽
Максимальная скорость, км/ч	179
Время разгона до 100 км/ч, сек	13.5
Двигатель	Дизельный с турбонаддувом
Рабочий объем, см³	1968
Мощность, л.с. / оборотах	150/3250-3750
Момент, Н·м / оборотах	340/1500-3000
Расход комби, л на 100 км	7.7
Тип коробки передач	Робот, 7 передач
Привод	Полный
Показать все характеристики

Volkswagen Multivan 2.0 biTDI BMT Long

Цена от	5 739 000 ₽
Максимальная скорость, км/ч	198
Время разгона до 100 км/ч, сек	10.3
Двигатель	Дизельный с турбонаддувом
Рабочий объем, см³	1968
Мощность, л.с. / оборотах	199/3800-4000
Момент, Н·м / оборотах	450/1400-2400
Расход комби, л на 100 км	7.5
Тип коробки передач	Робот, 7 передач
Привод	Полный
Показать все характеристики

Volkswagen Multivan 2.0 biTDI BMT

Цена от	5 861 000 ₽
Максимальная скорость, км/ч	198
Время разгона до 100 км/ч, сек	10.3
Двигатель	Дизельный с турбонаддувом
Рабочий объем, см³	1968
Мощность, л.с. / оборотах	199/3800-4000
Момент, Н·м / оборотах	450/1400-2400
Расход комби, л на 100 км	7.5
Тип коробки передач	Робот, 7 передач
Привод	Полный
Показать все характеристики

Одноклассники Volkswagen Multivan по цене

От 3 840 000 ₽

До 4 259 000 ₽

Минивэн

Германия

Год: 2017

От 4 189 000 ₽

До 4 600 000 ₽

Минивэн

Канада

Год: 2017

От 3 649 740 ₽

До 4 344 740 ₽

Минивэн

Германия

Год: 2014

Отзывы владельцев Volkswagen Multivan

На этот автомобиль пока нет отзывов

Обои рабочего стола Volkswagen Multivan

1024×768

1280×1024

Обои Volkswagen Multivan

Volkswagen Multivan / Фольксваген Мультивэн

Обновленный Volkswagen Multivan Т6.1 дебютировал в феврале 2019 года. Внешне от предыдущего поколения Мультивэн отличается увеличенной радиаторной решеткой и модернизированным рисунком фар, сделанными в духе новых легковых автомобилей фирмы. Около передней светотехники появился хромированный шильдик со словом «Bulli». В интерьере видим обновленное рулевое колесо, виртуальную приборную панель и дополнительные места для хранения мелочей над ней. Украшают салон декоративные вставки на дверях и передней панели. Благодаря рельсам, проходящим по всему полу, сиденья легко перемещаются по салону, их можно все демонтировать и получить фургон с объемом в 5800 л.

Volkswagen Multivan Т6.1 комплектуется дизельными 4-х цилиндровыми рядными двигателями TDI с турбонаддувом объемом 2 л и мощностью в 150 л.с. и 199 сил. Коробки передач механическая на 6 скоростей или роботизированная с семью ступенями. Можно опционально получить полный привод 4MOTION. Предусмотрена версия с электромотором на 112 лошадок с двумя вариантами оптимизации: по нагрузке и пройденному расстоянию. Подвески независимые, спереди Макферсон, сзади 2-х рычажная, жесткость демпфирования имеет регулировку. Тормоза на всех колесах дисковые, на передней оси вентилируемые. Мультивэн имеет две колесные базы — стандартную на 3000 мм и длинную на 3400 мм.

Volkswagen Multivan Т6.1 обладает двумя комплектациями: Trendline и Comfortline. Первая включает трехзонный климат-контроль с проверкой качества воздуха, информационно-медийную систему с цветным экраном, раскладывающееся в спальное место сиденье третьего ряда, помощь на подъеме, круиз-контроль, задний и передний парктроники. Версия Comfortline дополнительно содержит ДХО и фары на светодиодах, складной столик, поворотные сиденья второго ряда, сдвижную правую дверь с электрическим приводом.

Определение многовалентности по Merriam-Webster

мульти · ти · ва · лент | \ ˌMəl-tē-vā-lənt , -ˌTī- , особенно в смысле 3 ˌməl-ˈti-və- \

2 : представлены более чем в два раза по числу соматических хромосом поливалентные хромосомы

3 : , имеющий много значений, значений или призывов

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Иммуногенные характеристики, связанные с поливалентным отображением полисахаридного антигена Vi с использованием биоразлагаемых полимерных частиц

Полимерные частицы, улавливающие вакцины-кандидаты, особенно сделанные из полилактида- co -гликолида (PLGA) или полилактида (PLA), широко использовались для разработки однократные вакцины [1], [2].Эти системы доставки вакцины в виде частиц не только доставляют антиген контролируемым образом, имитируя естественную вакцинацию, но также обеспечивают адъювантную активность, активно взаимодействуя с антигенпрезентирующими клетками [3], [4], [5], [6]. Эти системы доставки могут быть адаптированы с учетом различных свойств биоматериала, таких как морфология поверхности, геометрический размер, форма и пористость, которые, как сообщается, важны для индукции иммунного ответа [6], [7], [8], [9]. Системы доставки на основе полимерных частиц субмикронного размера предлагают более высокое соотношение площади поверхности к объему, что идеально для мультивалентной презентации антигенов клеткам иммунной системы [10], [11], [12], [13], [14].Также сообщалось, что система доставки вакцины на основе полимерных частиц вызывает улучшенный иммунный ответ антител при одноточечной иммунизации [15]. Ответ антител памяти может быть дополнительно улучшен путем облегчения взаимодействий этих частиц с дендритными клетками (ДК) через рецепторы лектина C-типа [16]. В последнее время эти полимерные частицы использовались в качестве искусственных антигенпредставляющих клеток, а также были разработаны для обеспечения окта-функциональной активности [17], [18]. В отличие от белковых антигенов, большинство полисахаридных антигенов вызывают ответы антител без необходимости помощи Т-клеток (т.е.е., они не зависят от тимуса, или антигенов TI). Фактически, они напрямую взаимодействуют со специфичными для полисахарида B-клетками, которые затем дифференцируются в плазматические клетки для производства антител. Одной из успешных углеводных вакцин является вакцина на основе капсульного полисахарида Vi против инфекций Salmonella typhi . Полисахаридный антиген Vi представляет собой линейный полимер 1,4 (2-дезокси) -2-N-ацетилгалактуроновой кислоты, в различной степени O-ацетилированный в положении C3 [19], [20]. Антитела к полисахариду Vi защищают от S.typhi и вакцины на основе очищенного полисахаридного антигена Vi неизменно демонстрируют эффективность более 60% у взрослых в эндемичных по брюшному тифу районах [21], [22], [23]. Защита, предлагаемая вакциной на основе полисахарида Vi, является кратковременной, поскольку она не вызывает ответа антител памяти. Таким образом, вакцины нуждаются в повторной иммунизации каждые 3-5 лет [21], [24]. Большинство полисахаридных антигенов, таких как антигены Vi, представляют собой большие поливалентные молекулы. Эта мультивалентность позволяет им индуцировать множественные домены сильно сшитого мембранного (m) Ig, который, как было показано, активирует высокие уровни B-клеток [25].Поскольку продолжительный контакт антигена с mIg и последующая постоянная передача сигналов B-клеток важны для индукции антиполисахаридного ответа, было бы интересно оценить возможность презентации этих антигенов на биоразлагаемых полимерных частицах. Это иммобилизует полисахаридные антигены на поверхности частиц и способствует перекрестному связыванию рецепторов B-клеток и, таким образом, улучшает ответы антиполисахаридных антител. Учитывая это, настоящее исследование направлено на повышение иммуногенности полисахарида Vi путем улавливания и доставки их с помощью биоразлагаемых полимерных частиц.На сегодняшний день имеется очень мало информации об иммунном ответе систем доставки на основе биоразлагаемых полимерных частиц, улавливающих полисахаридные антигены.

Многие вакцины на основе полисахаридов имеют дополнительные недостатки, заключающиеся в том, что они не вызывают защитные иммунные ответы у младенцев в возрасте до двух лет [26], [27] и не вызывают переключение изотипа, созревание аффинности и ответы антител с памятью [28]. Многие подходы, такие как конъюгированные вакцины, неогликоконъюгаты, пептидомиметики и т. Д., Были разработаны для обхода Т-лимфоцитарно-независимого свойства полисахаридных антигенов [26], [29].В гликоконъюгированной вакцине полисахаридный антиген ковалентно связан с белком-носителем, что делает его единым физическим объектом, и это значительно улучшает иммуногенность полисахаридного антигена, предлагая необходимую помощь Т-клеткам [26], [27], [29]. . Однако этот процесс химической конъюгации зависит от ограниченных функциональных групп, и успех конъюгированной вакцины зависит от многих факторов, таких как соотношение носитель-антиген и иммунологические свойства носителя [30], [31].Чтобы устранить эти ограничения, в текущем исследовании также изучается возможность совместного улавливания белка-носителя и полисахаридного антигена Vi в одних и тех же частицах PLA, чтобы сделать их единым физическим объектом для иммунизации. Общая цель заключалась в повышении иммуногенности полисахарида Vi с использованием системы доставки на основе полимерных частиц. Результаты указывают на то, что система доставки вакцины на основе полимерных частиц значительно улучшает иммуногенность Т-независимых антигенов после однократной иммунизации.

Текущее состояние и будущие направления развития мультивалентных металло-ионных батарей

Вейл, М., Зиманн, С. и Петерс, Дж. В книге « Поведение литий-ионных аккумуляторов в электромобилях: здоровье, производительность, безопасность» и Стоимость (редакторы Пистойя, Г. и Лиау, Б.) 59–74 (Springer International Publishing, 2018).

Salama, M. et al. Металл-серные батареи: обзор и методы исследования. ACS Energy Lett. 4 , 436–446 (2019).

Google ученый

Liu, M. et al. Соединения шпинели как катоды многовалентных батарей: систематическая оценка, основанная на расчетах ab initio. Energy Environ. Sci. 8 , 964–974 (2015).

Google ученый

Chung, S.-H. И Мантирам, А. Текущее состояние и перспективы развития металл-серных батарей. Adv. Матер. 31 , 15 (2019).

Google ученый

Rong, Z. et al. Правила конструирования материалов для подвижности многовалентных ионов в интеркаляционных структурах. Chem. Матер. 27 , 6016–6021 (2015). В этой работе предложена взаимосвязь между координационной средой иона и энергетическим барьером для твердотельной диффузии мультивалентных ионов металла .

Google ученый

Мацуи, М. Исследование электрохимически осажденного металла Mg. J. Источники энергии 196 , 7048–7055 (2011). Эта работа исследовала происхождение недендритного осаждения магния в сравнении с осаждением дендритного лития .

Google ученый

Кроу, А. Дж., ДиМеглио, Дж. Л., Стрингхэм, К. К. и Бартлетт, Б. М. Кинетика осаждения магния и удаления из неводных электролитов. J. Phys. Chem. С 121 , 20613–20620 (2017).

Google ученый

Tutusaus, O. et al. Эффективный безгалогенный электролит для использования в перезаряжаемых магниевых батареях. Angew. Chem. Int. Эд. 54 , 7900–7904 (2015). В этой работе сообщается о растворах неагрессивных, ненуклеофильных электролитов, которые обеспечивают обратимое покрытие магнием и удаление .

Google ученый

Та, К., См., К. А. и Гевирт, А. А. Выяснение механизмов электроосаждения Zn и Mg в неводных электролитах для металлических батарей следующего поколения. J. Phys. Chem. C 122 , 13790–13796 (2018).

Google ученый

10.

Jäckle, M., Helmbrecht, K., Smits, M., Stottmeister, D. & Groß, A. Барьеры самодиффузии: возможные дескрипторы роста дендритов в батареях? Energy Environ.Sci. 11 , 3400–3407 (2018).

Google ученый

11.

Jäckle, M. & Groß, A. Микроскопические свойства анодных материалов литиевых, натриевых и магниевых батарей, связанные с возможным ростом дендритов. J. Chem. Phys. 141 , 174710 (2014).

Google ученый

12.

Линг, К., Банерджи, Д. и Мацуи, М. Изучение электрохимического осаждения Mg на атомном уровне: почему он предпочитает недендритную морфологию. Электрохим. Acta 76 , 270–274 (2012).

Google ученый

13.

Грегори Т. Д., Хоффман Р. Дж. И Винтертон Р. С. Неводная электрохимия магния: приложения к накоплению энергии. J. Electrochem. Soc. 137 , 775–780 (1990).

Google ученый

14.

Davidson, R. et al. Картирование механизмов и режимов роста электроосаждения магния при высоких плотностях тока. Mater. Horiz. 7 , 843–854 (2020).

Google ученый

15.

Динг, М. С., Димант, Т., Бем, Р. Дж., Пассерини, С. и Гиффин, Г. А. Рост дендритов в металлических ячейках Mg, содержащих Mg (TFSI) ₂ / глим-электролиты. J. Electrochem. Soc. 165 , A1983 – A1990 (2018).

Google ученый

16.

Понруч, А., Фронтера, К., Барде, Ф. и Паласин, М. Р. На пути к перезаряжаемой батарее на основе кальция. Nat. Матер. 15 , 169–172 (2016).

Google ученый

17.

Wang, D. et al. Покрытие и удаление кальция в органическом электролите. Nat. Матер. 17 , 16 (2017). В этой работе сообщалось об осаждении и удалении кальция при комнатной температуре в растворе органического электролита с низкой поляризацией и относительно высокой эффективностью. .

Google ученый

18.

Shyamsunder, A., Blanc, L.E., Assoud, A. & Nazar, L.F. Обратимое покрытие и удаление кальция при комнатной температуре с использованием боратной соли. ACS Energy Lett. 4 , 2271–2276 (2019).

Google ученый

19.

Li, Z., Fuhr, O., Fichtner, M. и Zhao-Karger, Z. На пути к стабильным и эффективным электролитам для перезаряжаемых кальциевых батарей при комнатной температуре. Energy Environ. Sci. 12 , 3496–3501 (2019).

Google ученый

20.

Pan, H. et al. Обратимое водное накопление энергии цинка / оксида марганца в результате реакций конверсии. Nat. Энергетика 1 , 16039 (2016).

Google ученый

21.

Zhao, Q. et al. Водно-цинковые батареи большой емкости с экологически чистыми хиноновыми электродами. Sci. Adv. 4 , eaao1761 (2018).

Google ученый

22.

Wang, F. et al. Металлический цинк-анод с высокой степенью обратимости для водных аккумуляторов. Nat. Матер. 17 , 543–549 (2018).

Google ученый

23.

Han, S.-D. и другие. Происхождение электрохимических, структурных и транспортных свойств неводных цинковых электролитов. ACS Appl. Матер. Интер. 8 , 3021–3031 (2016).

Google ученый

24.

Qian, J. et al. Высокая скорость и стабильная работа анода из металлического лития. Nat. Commun. 6 , 6362 (2015).

Google ученый

25.

Прадхан Д. и Редди Р. Г. Бездендритное электроосаждение алюминия из AlCl ₃ -1-этил-3-метилимидазолийхлоридные ионные жидкие электролиты. Металл. Матер. Пер. В 43 , 519–531 (2012).

Google ученый

26.

Woods, J., Bhattarai, N., Chapagain, P., Yang, Y. & Neupane, S. Наблюдения с помощью просвечивающей электронной микроскопии in situ перезаряжаемых ионно-литиевых батарей. Nano Energy 56 , 619–640 (2019).

Google ученый

27.

Chen, H. et al.Оксидная пленка эффективно подавляет рост дендритов в алюминиево-ионном аккумуляторе. ACS Appl. Матер. Интер. 9 , 22628–22634 (2017).

Google ученый

28.

Пелед, Э. и Менкин, С. Обзор — SEI: Прошлое, настоящее и будущее. J. Electrochem. Soc. 164 , A1703 – A1719 (2017).

Google ученый

29.

Аурбах Д., Скалецкий Р.& Гофер, Ю. Электрохимическое поведение кальциевых электродов в некоторых органических электролитах. J. Electrochem. Soc. 138 , 3536–3545 (1991).

Google ученый

30.

Yu, J., McMahon, BW, Boatz, JA & Anderson, SL Производство наночастиц алюминия с помощью помола с ацетонитрилом: влияние жидкого и парофазного измельчения и метода измельчения на размер частиц и химический состав поверхности . Дж.Phys. Chem. C 120 , 19613–19629 (2016).

Google ученый

31.

Лу З., Шехтер А., Мошкович М. и Аурбах Д. Об электрохимическом поведении магниевых электродов в полярных растворах апротонных электролитов. J. Electroanal. Chem. 466 , 203–217 (1999).

Google ученый

32.

Singh, N. et al. Достижение высоких скоростей циклирования за счет создания активных металлических анодов из нанокомпозитов. ACS Appl. Energy Mater. 1 , 4651–4661 (2018).

Google ученый

33.

Сын, С.-Б. и другие. Искусственная граница раздела обеспечивает обратимый химический состав магния в карбонатных электролитах. Nat. Chem. 10 , 532–539 (2018).

Google ученый

34.

Gao, T. et al. Наличие твердой электролитной межфазной границы в Mg-батареях: на примере химии Mg / S. ACS Appl. Матер. Интер. 10 , 14767–14776 (2018).

Google ученый

35.

Чен Т., Седер Г., Сай Гаутам Г. и Канепа П. Оценка соединений Mg в качестве материалов покрытия в Mg-батареях. Фронт. Chem. 7 , 24 (2019).

Google ученый

36.

Tamura, S., Yamane, M., Hoshino, Y. & Imanaka, N. Высокопроводящие двухвалентные катионные твердые электролиты Mg ²⁺ с хорошо упорядоченной трехмерной сетчатой структурой. J. Solid State Chem. 235 , 7–11 (2016).

Google ученый

37.

Kisu, K. et al. Боргидрид магния и боран аммиака как ионный проводник магния. ACS Appl. Energy Mater. 3 , 3174–3179 (2020).

Google ученый

38.

Canepa, P. et al. Высокая подвижность магния в тройных халькогенидах шпинели. Nat.Commun. 8 , 1759 (2017).

Google ученый

39.

Пур, Н., Гофер, Ю., Майор, Д. Т. и Аурбах, Д. Структурный анализ растворов электролитов для перезаряжаемых Mg-батарей с помощью стереоскопических средств и расчетов методом DFT. J. Am. Chem. Soc. 133 , 6270–6278 (2011).

Google ученый

40.

Pour, N. et al. Многоядерная магниторезонансная спектроскопия и расчеты теории функции плотности для идентификации равновесных частиц в растворах металлоорганических комплексов в ТГФ, подходящих в качестве растворов электролитов для перезаряжаемых Mg-батарей. Металлоорганические соединения 32 , 3165–3173 (2013).

Google ученый

41.

Kim, H. S. et al. Структура и совместимость магниевого электролита с серным катодом. Nat. Commun. 2 , 427 (2011). В этой работе сообщалось о растворах ненуклеофильных электролитов, которые обеспечивают обратимое покрытие магнием и удаление .

Google ученый

42.

Doe, R.E. et al. Новые растворы электролитов, содержащие полностью неорганические соли с высокой анодной стабильностью для перезаряжаемых магниевых батарей. Chem. Commun. 50 , 243–245 (2014).

Google ученый

43.

Carter, T. J. et al. Кластеры бора как высокостабильные электролиты магниевых аккумуляторов. Angew. Chem. Int. Эд. 53 , 3173–3177 (2014).

Google ученый

44.

Zhao-Karger, Z. et al. К высокообратимым магниево-серным батареям с эффективным и практичным электролитом Mg [B (hfip) ₄] ₂. ACS Energy Lett. 3 , 2005–2013 (2018).

Google ученый

45.

Lipson, A. L. et al. Пределы практической устойчивости магниевых электролитов. J. Electrochem. Soc. 163 , A2253 – A2257 (2016).

Google ученый

46.

Liu, T. B. et al. Простой подход с использованием MgCl ₂ для создания высокоэффективных электролитов Mg ²⁺ для перезаряжаемых Mg батарей. J. Mater. Chem. А 2 , 3430–3438 (2014).

Google ученый

47.

Du, A. et al. Эффективный электролит на основе органического бората магния с ненуклеофильными характеристиками для магниево-серных аккумуляторов. Energy Environ. Sci. 10 , 2616–2625 (2017).

Google ученый

48.

Luo, J., Bi, Y., Zhang, L., Zhang, X. & Liu, T. L. Стабильный, некоррозионный перфторированный пинаколатоборатный электролит Mg для перезаряжаемого Mg. батарей. Энгью. Chem. Int. Эд. 58 , 6967–6971 (2019).

Google ученый

49.

Cheng, Y. W. et al. Высокоактивные электролиты для Mg-аккумуляторов на основе катионного комплекса [Mg ₂ (μ-Cl) ₂] ²⁺ в диметоксиэтане. Phys. Chem. Chem. Phys. 17 , 13307–13314 (2015).

Google ученый

50.

Shterenberg, I. et al. Оценка растворов электролитов на основе (CF ₃ SO ₂) ₂ N ^— (TFSI) для Mg аккумуляторов. J. Electrochem. Soc. 162 , A7118 – A7128 (2015).

Google ученый

51.

Чжан Ю., Лю, С., Джи, Й., Ма, Дж. И Ю, Х. Новые неводные алюминиево-ионные батареи: проблемы, состояние и перспективы. Adv. Матер. 30 , 1706310 (2018).

Google ученый

52.

Аттиас, Р., Салама, М., Хирш, Б., Гофер, Ю. и Аурбах, Д. Влияние растворителя на обратимое интеркалирование ионов магния в электроды V ₂ O ₅ . ХимЭлектроХим 5 , 3514–3524 (2018).

Google ученый

53.

Salama, M. et al. Уникальное поведение растворов диметоксиэтан (DME) / Mg (N (SO ₂ CF ₃) ₂) ₂. J. Phys. Chem. C 120 , 19586–19594 (2016).

Google ученый

54.

Сегуин, Т. Дж., Хан, Н. Т., Завадил, К. Р. и Перссон, К. А. Выяснение стабильности неводных растворителей и связанных с ними механизмов разложения для приложений хранения энергии Mg из первых принципов. Фронт. Chem. 7 , 175 (2019).

Google ученый

55.

Senoh, H. et al. Растворы электролитов на основе сульфонов для перезаряжаемых магниевых батарей с использованием положительного электрода из 2,5-диметокси-1,4-бензохинона. J. Electrochem. Soc. 161 , A1315 – A1320 (2014).

Google ученый

56.

Яги, С., Танака, А., Итикава, Ю., Ichitsubo, T. & Matsubara, E. Электрохимическая стабильность токосъемников магниевых батарей в электролите на основе реактива Гриньяра. J. Electrochem. Soc. 160 , C83 – C88 (2013).

Google ученый

57.

Hahn, N.T. et al. Повышенная стабильность аниона карба-клозо-додекабората для электролитов высоковольтных аккумуляторов за счет рациональной конструкции. J. Am. Chem. Soc. 140 , 11076–11084 (2018).

Google ученый

58.

Раджпут Н. Н., Ку, X., Са, Н., Баррелл А. К. и Перссон К. А. Связь между стабильностью и образованием ионных пар в магниевых электролитах из первых принципов квантовой механики и классической молекулярной динамики. J. Am. Chem. Soc. 137 , 3411–3420 (2015).

Google ученый

59.

Аттиас, Р., Салама, М., Хирш, Б., Гоффер, Ю. и Аурбах, Д. Интерфейсы анод-электролит во вторичных магниевых батареях. Джоуль 3 , 27–52 (2019).

Google ученый

60.

Adams, B. D., Zheng, J., Ren, X., Xu, W. & Zhang, J.-G. Точное определение кулоновской эффективности для литий-металлических анодов и литий-металлических батарей. Adv. Energy Mater. 8 , 1702097 (2018).

Google ученый

61.

Сан, X., Бонник, П. и Назар, Л. Ф. Слоистый TiS ₂ положительный электрод для Mg аккумуляторов. ACS Energy Lett. 1 , 297–301 (2016).

Google ученый

62.

Yoo, H. D. et al. Внедрение магния в слоистый оксид ванадия с высокой емкостью. ACS Energy Lett. 4 , 1528–1534 (2019).

Google ученый

63.

Canepa, P. et al. Одиссея многовалентных катодных материалов: открытые вопросы и задачи будущего. Chem. Ред. 117 , 4287–4341 (2017).

Google ученый

64.

Sa, N. et al. Является ли alpha-V ₂ O ₅ катодным материалом для Mg-вставных батарей? J. Источники энергии 323 , 44–50 (2016).

Google ученый

65.

Verrelli, R. et al. О странном случае интеркаляции двухвалентных ионов в V ₂ O ₅. J. Источники энергии 407 , 162–172 (2018). Эта работа продемонстрировала несостоятельность a -V ₂ O ₅ для хранения магния и кальция, несмотря на то, что долгое время считалось, что этот материал является хозяином для двухвалентных веществ. ионы металлов, подчеркивая важность осторожности при определении химического состава катодного накопителя для мультивалентных батарей .

Google ученый

66.

Zhao, Q. et al. Межфазные границы твердых электролитов для высокоэнергетических водных алюминиевых электрохимических ячеек. Sci. Adv. 4 , eaau8131 (2018).

Google ученый

67.

Dong, H. et al. Направление химии хранения Mg в органических полимерах в сторону высокоэнергетических Mg-аккумуляторов. Джоуль 3 , 782–793 (2019). В этой работе проводилось различие между накоплением комплексных ионов и накоплением чистых ионов металлов в катодах магниевых батарей и продемонстрирована важность последних для практических характеристик элементов .

Google ученый

68.

Lin, M.-C. и другие. Сверхбыстрый перезаряжаемый алюминиево-ионный аккумулятор. Природа 520 , 324–328 (2015).

Google ученый

69.

Kim, D. J. et al. Перезаряжаемые алюминиево-органические батареи. Nat. Энергетика 4 , 51–59 (2018).

Google ученый

70.

Li, Z. et al. Быстрая кинетика химии многовалентной интеркаляции, которая возможна благодаря сольватированным ионам магния в самоустанавливающихся металлических слоистых материалах. Nat. Commun. 9 , 5115 (2018).

Google ученый

71.

Haber, S. & Leskes, M. Что мы можем узнать из твердотельного ЯМР на границе раздела электрод-электролит? 30 , 1706496 (2018).

Google ученый

72.

Kundu, D. et al. Водные и неводные Zn-ионные батареи: последствия потери десольватации на границе раздела. Energy Environ. Sci. 11 , 881–892 (2018).

Google ученый

73.

Wu, C. et al. Электрохимически активированный оксид марганца шпинели для аккумуляторных водно-алюминиевых батарей. Nat. Commun. 10 , 7 (2019).

Google ученый

74.

Ван, Р. Ю., Уэсселс, К. Д., Хаггинс, Р. А. и Цуй, Ю. Высокообратимые наноразмерные электроды с открытым каркасом для двухвалентных ионных батарей. Nano Lett. 13 , 5748–5752 (2013).

Google ученый

75.

Крайчик, К. В., Ван, С., Пивето, Л., Кояленко, М. В. Эффективная батарея с хлоридом алюминия и природным графитом. Chem. Матер. 29 , 4484–4492 (2017).

Google ученый

76.

Aurbach, D. et al. Опытные образцы систем аккумуляторных магниевых батарей. Природа 407 , 724–727 (2000). Эта работа продемонстрировала обратимые и достаточно быстрые системы магниево-ионных батарей с открытием подходящих сложных растворов эфирных электролитов и фазовых катодов Шевреля, таких как Mo ₆ S ₈.

Google ученый

77.

Sun, X.Q. et al. Катод из тиошпинеля большой емкости для Mg аккумуляторов. Energy Environ. Sci. 9 , 2273–2277 (2016). В этой работе описан первый материал катодного накопителя магния с момента открытия Mo ₆ S ₈ , который демонстрирует убедительные характеристики .

Google ученый

78.

Pan, C., Zhang, R., Nuzzo, RG & Gewirth, AA ZnNi _x Mn _x Co _{2–2 x} O ₄ шпинель как высоковольтная и катодный материал большой емкости для неводных Zn-ионных аккумуляторов. Adv. Energy Mater. 8 , 1800589 (2018).

Google ученый

79.

Pan, C., Nuzzo, RG & Gewirth, AA ZnAl _x Co _{2– x} O ₄ шпинели в качестве катодного материала для неводных цинковых батарей с разомкнутой цепью напряжение ≤2 В. Chem. Матер. 29 , 9351–9359 (2017).

Google ученый

80.

Yaghoobnejad Asl, H. & Manthiram, A. Массоперенос двухвалентных ионов в оксидной матрице: сравнение диффузии Mg ²⁺ и Zn ²⁺ в гексагональной K _x W ₃ О ₉ бронза. Chem. Матер. 31 , 2296–2307 (2019).

Google ученый

81.

Geng, L. et al. Трансформация кристаллической структуры в фазе Шевреля Mo ₆ S ₈, индуцированная интеркаляцией алюминия. Chem. Матер. 30 , 8420–8425 (2018).

Google ученый

82.

Ван, Л. В. Ф., Пердью, Б. Р., Апблетт, К. А. и Прендергаст, Д. Механизм десольватации и интеркаляции магния на поверхности шеврельной фазы Mo ₆ S ₈. Chem. Матер. 27 , 5932–5940 (2015).

Google ученый

83.

Levi, M. D. et al. Влияние анионного каркаса Mo ₆ X ₈ фазы Шевреля (X = S, Se) на термодинамику и кинетику электрохимического внедрения ионов Mg ²⁺. Ионика твердого тела 176 , 1695–1699 (2005).

Google ученый

84.

West, A. R. in Основы химии твердого тела Ch.4 (John Wiley & Sons, 1988).

85.

Адельштейн, Н. и Вуд, Б. С. Роль динамически нарушенного разупорядочения связей в суперионном твердом электролите Li ⁺. Chem. Матер. 28 , 7218–7231 (2016).

Google ученый

86.

Mao, M. et al. Настройка анионной химии для улучшения кинетики интеркаляции Mg. Chem. Матер. 31 , 3183–3191 (2019).

Google ученый

87.

Brown, I. D. Какие факторы определяют координационные числа катиона? Acta Crystallogr. B44 , 545–553 (1988).

Google ученый

88.

Ханна, Д. К., Сай Гаутам, Г., Канепа, П., Ронг, З. и Седер, Г. Подвижность ионов магния в постшпинелях, доступных при атмосферном давлении. Chem. Commun. 53 , 5171–5174 (2017).

Google ученый

89.

Jung, S.C. & Han, Y.-K. Быстрый перенос ионов магния в двухфазном электроде Bi / Mg ₃ Bi ₂. J. Phys. Chem. C 122 , 17643–17649 (2018).

Google ученый

90.

Rong, Z. et al. Быстрая диффузия Mg ²⁺ в Mo ₃ (PO ₄) ₃ O для Mg аккумуляторов. Chem. Commun. 53 , 7998–8001 (2017).

Google ученый

91.

Zhao-Karger, Z. et al. Повышение эффективности магниево-серных батарей с модифицированными ненуклеофильными электролитами. Adv. Energy Mater. 5 , 1401155 (2015).

Google ученый

92.

Zhang, Z. et al. Новые концепции проектирования эффективных Mg-ионных электролитов для высокоэффективных магниево-селеновых и магниево-серных батарей. Adv. Energy Mater. 7 , 1602055 (2017).

Google ученый

93.

Tian, H. et al. Химический состав сверхмощных перезаряжаемых магниево-йодных батарей. Nat. Commun. 8 , 14083 (2017).

Google ученый

94.

Mao, M. et al. Перезаряжаемый Mg-аккумулятор с высокой плотностью энергии, работающий за счет реакции смещения. Nano Lett. 19 , 6665–6672 (2019).

Google ученый

95.

Gao, T. et al. Обратимый S ⁰ / MgS _x окислительно-восстановительный химический состав в электролите MgTFSI ₂ / MgCl ₂ / DME для перезаряжаемых Mg / S-батарей. Angew. Chem. Int. Эд. 56 , 13526–13530 (2017).

Google ученый

96.

Salama, M. et al. О возможности практических Mg – S батарей: практические ограничения, связанные с металлическими магниевыми анодами. ACS Appl. Матер.Интер. 10 , 36910–36917 (2018).

Google ученый

97.

Gao, T. et al. Термодинамика и кинетика серного катода при разряде в электролите MgTFSI ₂ –ДМЭ. Adv. Матер. 30 , 1704313 (2018).

Google ученый

98.

Li, X. et al. Снижение перенапряжения на магниевом аноде за счет образования ионопроводящего поверхностного слоя за счет добавки йода. Adv. Energy Mater. 8 , 1701728 (2018).

Google ученый

99.

Liu, J. et al. Пути создания практичных высокоэнергетических литий-металлических батарей с длительным циклом работы. Nat. Энергетика 4 , 180–186 (2019).

Google ученый

100.

Andrews, J. L. et al. Обратимое внедрение иона Mg в метастабильный одномерный полиморф V ₂ O ₅. Chem 4 , 564–585 (2018).

Google ученый

101.

Артур, Т. С., Синг, Н. и Мацуи, М. Электроосажденные Bi, Sb и Bi _1-x Сплавы Sb _x в качестве анодов для ионно-магниевых батарей. Электрохим. Commun. 16 , 103–106 (2012).

Google ученый

102.

Яо, З., Хегде, В. И., Аспуру-Гузик, А.& Волвертон, С. Открытие анодов из сплава кальция и металла для обратимых ионно-кальциевых батарей. Adv. Energy Mater. 9 , 1802994 (2019).

Google ученый

103.

Gershinsky, G., Yoo, HD, Gofer, Y. & Aurbach, D. Электрохимический и спектроскопический анализ интеркаляции Mg ²⁺ в тонкопленочные электроды слоистых оксидов: V ₂ O ₅ и МоО ₃. Langmuir 29 , 10964–10972 (2013).

Google ученый

104.

Licht, S. Цинк-серная батарея. Патент США 6207324 (2001).

Вирусы гриппа A используют кластеры поливалентной сиаловой кислоты для связывания клеток и активации рецепторов

Abstract

Вирус гриппа A (IAV) связывает свою хозяйскую клетку с помощью основного вирусного поверхностного белка гемагглютинина (HA). HA распознает сиаловую кислоту, гликан плазматической мембраны, который функционирует как специфический первичный фактор прикрепления (AF).Поскольку сиаловая кислота сама по себе не может выполнять сигнальную функцию, вирусу необходимо активировать нижестоящие факторы, чтобы вызвать поглощение эндоцитами. Недавно было показано, что рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), член семейства рецептор-тирозинкиназ, активируется IAV и передает сигналы входа в клетку. Однако, как связывание IAV с сиаловой кислотой приводит к вовлечению и активации EGFR, остается в значительной степени неясным. Мы использовали многоцветную микроскопию сверхвысокого разрешения для изучения латеральной организации как AFs IAV, так и его функционального рецептора EGFR в масштабе частицы IAV.Интересно, что количественный кластерный анализ показал, что AFs и EGFR организованы в частично перекрывающиеся субмикронные кластеры в плазматической мембране клеток A549. Внутри доменов AF локальная концентрация AF в среднем в 10 раз превышает фоновую концентрацию и имеет тенденцию увеличиваться к центру кластера, тем самым представляя поливалентную платформу связывания вируса. Используя экспериментально измеренные характеристики кластера, мы смоделировали распространение вируса на плоской мембране. Результаты предсказывают, что локальная концентрация AF сильно влияет на отчетливую модель подвижности IAV, что согласуется с данными отслеживания одиночных вирусов в живых клетках.В отличие от AF, EGFR находится в более мелких кластерах. Связывание вируса активирует EGFR, но, что интересно, этот процесс происходит без значительного латерального перераспределения EGFR, что указывает на активацию предварительно сформированных кластеров, которые, как мы показываем, являются долгоживущими. Взятые вместе, наши результаты дают количественное представление о начальных этапах заражения вирусом гриппа. Совместная кластеризация AF и EGFR обеспечивает совместный эффект связывания и передачи сигналов на определенных платформах, таким образом связывая их пространственную организацию с их функциональной ролью во время связывания вируса с клеткой и активации рецептора.

Сведения об авторе

Плазматическая мембрана — это главный интерфейс между клеткой и окружающей средой. Эта сложная и динамичная органелла должна защищать как барьер, но также передавать тонкие сигналы в клетку и из нее. Для IAV вируса в оболочке плазматическая мембрана представляет собой как главное препятствие, которое необходимо преодолеть во время инфекции, так и место сборки дочерних вирусных частиц. Однако организация плазматической мембраны — ключ к пониманию того, как работает проникновение вируса — в масштабе инфицирующей частицы (масштабы длины <100 нм) остается в значительной степени неизвестной.Сиалированные гликаны служат факторами прикрепления IAV, но не способны передавать сигналы через плазматическую мембрану. Было установлено, что рецепторные тирозинкиназы активируются при связывании вируса и служат функциональными рецепторами. Как IAV задействует и активирует свои функциональные рецепторы при первоначальном связывании гликанов, все еще остается предположением. Здесь мы используем микроскопию сверхвысокого разрешения для изучения латеральной организации молекул, связанных с плазматической мембраной, участвующих в инфекции IAV, а также их функциональной взаимосвязи.Мы обнаружили, что молекулы организованы в субмикронные нанодомены и, в сочетании с моделированием диффузии вирусов, представляют механистическую модель того, как IAV сначала взаимодействует с AF в плазматической мембране, чтобы впоследствии задействовать и запустить связанные с входом мембранные рецепторы.

Образец цитирования: Sieben C, Sezgin E, Eggeling C, Manley S (2020) Вирусы гриппа A используют кластеры поливалентной сиаловой кислоты для связывания клеток и активации рецепторов. PLoS Pathog 16 (7): e1008656.https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656

Редактор: Йошихиро Каваока, Университет Висконсин-Мэдисон, США

Поступила: 24 апреля 2020 г .; Дата принятия: 27 мая 2020 г .; Опубликовано: 8 июля 2020 г.

Авторские права: © 2020 Sieben et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Данные, лежащие в основе результатов, представленных в исследовании, доступны по адресу https://doi.org/10.5281/zenodo.3897432.

Финансирование: Исследования в лаборатории С.М. поддерживаются Национальным центром компетентности в исследованиях (NCCR) по химической биологии. E.S. поддерживается долгосрочной программой EMBO (ALTF 636-2013) и внутриевропейскими стипендиями Марии Склодовской-Кюри (MEMBRANE DYNAMICS 627088). Эта работа поддерживается Фондом Вольфсона (ref.18272), Советом по медицинским исследованиям (MRC, номер гранта MC_UU_12010 / программы G0

8 и MC_UU_12025), MRC / BBSRC / ESPRC (номер гранта MR / K01577X / 1) и Wellcome Доверие (грант исх.104924/14 / Z / 14). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Вирусы гриппа A (IAV) вызывают тяжелые инфекции дыхательных путей у людей, часто приводящие к сезонным локальным эпидемиям, а также периодическим глобальным пандемиям [1]. Во время связывания клеток IAV взаимодействует с низкоаффинными факторами прикрепления (AF), а также с функциональными рецепторами, чтобы запустить проникновение в клетки посредством эндоцитоза.Однако мало что известно о латеральной совместной организации обоих в масштабе заражающего вируса и о том, как их организация соотносится с их функциональной ролью во время вирусной инфекции.

Вирусный гемагглютинин (НА), тримерный гликопротеин, который покрывает ~ 90% вирусной поверхности, обеспечивает начальный контакт IAV-клетки (рис. 1A) [2]. Наиболее распространенным AF для IAV является N-ацетилнейраминовая, или сиаловая, кислота (SA), очень распространенный гликан клеточной поверхности, который в пределах своей глиозидной связи кодирует видовую специфичность IAV.Патогенные штаммы IAV человека предпочтительно связывают α-2,6-связанную SA, тогда как патогенные вирусы птиц предпочитают связывать α-2,3-связанную SA. Эта специфичность может быть объяснена топологией гликанов, которые легче образуют контакты с рецептор-связывающими доменами комплементарных ГК [3]. Общей чертой гликан-белковых взаимодействий является их низкое сродство, которое по отношению к НА-сиаловой кислоте находится в миллимолярном диапазоне [4] и должно затруднять формирование устойчивых взаимодействий вируса с клетками. Хотя AFs очень многочисленны, что может приводить к стабильной адгезии, отслеживание одного вируса показало, что IAV имеют некоторую свободу исследовать клеточную поверхность [5-7].Действительно, остается в значительной степени неясным, как первоначальное низкоаффинное взаимодействие приводит к стабильному и специфическому, но также и динамическому контакту вирус-клетка, обеспечивающему успешное инфицирование.

Рис. 1. Сиалированные факторы прикрепления IAV организованы в нанодомены на клетках A549.

( A ) Вирус гриппа представляет собой оболочечную частицу, которая инкапсулирует свой сегментированный (-) геном вРНК, состоящий из 8 вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов (вРНП). Вирусная мембрана содержит два гликопротеина — гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (НА).HA отвечает за связывание сиаловой кислоты (SA), содержащей факторы прикрепления, на плазматической мембране клетки-хозяина. После связывания с клеткой вирусу необходимо активировать функциональные рецепторы, чтобы вызвать эндоцитоз. ( B ) Конфокальная визуализация живых клеток A549, меченных SNA (конъюгированных с JF549). Клетки имеют неоднородное распределение SNA через плазматическую мембрану. На дорсальной стороне клетки можно наблюдать большие пальцеобразные выступы. ( C ) Конфокальная и STED визуализация живых клеток клеток A549, меченных SNA (конъюгированных со StarRed), подтверждает существование пальцевидных выступов, а также популяции более мелких нанодоменов диаметром ~ 100 нм ( C , справа, вставка).( D ) Чтобы увеличить разрешение и сфокусироваться на небольшом нанодомене, мы выполнили STORM-визуализацию клеток A549, меченных SNA (конъюгированных с Alexa647). Восстановленные изображения STORM подтверждают две основные структурные особенности (1) пальцевидные выступы, а также (2) небольшие нанодомены. Обработка клеток нейраминидазой (NA, 0,01 Ед / мл в течение 2 часов) привела к сильному снижению плотности локализации из-за расщепления и, следовательно, к снижению локальной концентрации SA ( D , справа, вставка).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.ppat.1008656.g001

После связывания IAV проникают в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, где клатрин-опосредованный эндоцитоз, как было показано, составляет основной [7], хотя и не единственный путь [8]. Поскольку AF не могут запускать эндоцитоз, для проникновения вируса необходимо задействовать активный рецептор обработки сигналов. Было показано, что рецепторные тирозинкиназы способны выполнять эту функцию [9]. В частности, было показано, что среди других рецептор-тирозинкиназ рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) активировался во время и необходим для эффективного входа в IAV-клетки.Однако то, как IAV находит и активирует EGFR, остается спекулятивным. В то время как молекулярная и структурная информация доступна для взаимодействий HA-SA [3] и EGFR-EGF [10], гораздо меньше известно об их пространственной коорганизации в плазматической мембране и о том, как это может способствовать активации EGFR во время инфицирования клеток IAV. .

За последние десятилетия электронная микроскопия предоставила подробную структурную картину изолированных частиц вируса гриппа [2], а также их индивидуальных белков [11].Однако получение изображений и количественный анализ гетерогенных клеточных структур и их динамики на наноуровне остается сложной задачей. Микроскопия сверхвысокого разрешения представляет собой отличный инструмент для изучения клеточной организации в масштабе заражающей вирусной частицы (<100 нм) [12]. Здесь мы объединили два взаимодополняющих подхода, которые вместе обеспечивают универсальный набор инструментов для решения этой проблемы [12,13]. Для получения изображения молекулярной организация и отслеживание отдельных молекул внутри плазматической мембраны клеток-хозяев IAV [15-17].

Мы количественно проанализировали пространственную организацию AFs IAV, а также EGFR на поверхности альвеолярных эпителиальных клеток человека. Мы обнаружили, что AF организованы в кластеры размером с вирус с градиентом плотности, который уменьшается от плотного центрального ядра к периферии. Используя их экспериментально определенные характеристики, мы использовали моделирование, чтобы исследовать их роль во взаимодействиях вирус-клетка. Эти модели хорошо согласуются с экспериментами по отслеживанию вирусов на живых клетках, и вместе они предполагают, что пространственная организация AF в значительной степени влияет на взаимодействия вирус-клетка во время ранней фазы вирусной инфекции.Мы также показали, что нанодомены AF неслучайно перекрываются с кластерами EGFR, тем самым способствуя AF-опосредованной активации EGFR. Интересно, что наши результаты также подтверждают, что уже существующие кластеры EGFR ответственны за IAV-опосредованную активацию рецепторов. Мы предлагаем новый взгляд на начальные события инфицирования вирусом гриппа и предлагаем новое понимание функциональной роли пространственной организации AF и рецепторов на клеточной поверхности.

Результаты

Факторы прикрепления IAV, содержащие сиаловую кислоту, организованы в нанодомены на плазматической мембране клеток A549

Чтобы изучить пространственную организацию AFs IAV внутри плазматической мембраны пермиссивных эпителиальных клеток, мы стремились селективно пометить фрагменты сиаловой кислоты, которые предпочтительно распознаются патогенными IAV человека, такими как h4N2 / X31 [4], используемыми здесь.Для этой цели мы использовали растительный лектин Sambuccus nigra aglutinin (SNA), который маркирует α-2,6-связанную SA, чтобы служить в качестве первичной метки IAV AF (S1 Text, S1 Fig). Используя конфокальную микроскопию, мы обнаружили, что SNA сильно метила плазматическую мембрану живых клеток A549 (рис. 1B), показывая неоднородное окрашивание и обогащение пальцеобразными выступами, которые морфологически оказались микроворсинками. Затем мы использовали STED-микроскопию, чтобы более тщательно изучить более гладкие участки плазматической мембраны между микроворсинками.На живых клетках A549 мы обнаружили сильную гетерогенность мечения поверхности клеток SNA, включая небольшие кластеры в масштабе 100–200 нм (рис. 1C, правая панель, вставка).

Наша следующая цель состояла в том, чтобы исследовать латеральную организацию AFs IAV в масштабе интерфейса вирус-клетка в фиксированных клетках, чтобы избежать размытости движения. Первоначально мы подтвердили, что наш протокол фиксации клеток успешно иммобилизовал молекулы плазматической мембраны (S2 рис.), Затем выполнили STORM и STED параллельно, чтобы отобразить плазматическую мембрану в масштабе небольших сферических вирионов h4N2 / X31 (средний диаметр 120 нм [2]). .STORM (Рис. 1D) и STED (S3A Рис.) Изображений фиксированных клеток A549 подтвердили наши наблюдения, сделанные на живых клетках, что SNA окрашивает различные небольшие наноструктуры на плоских частях плазматической мембраны. Мы также обнаружили аналогичное распределение на клетках MDCK, которые очень чувствительны к IAV (S3B фиг.). В качестве SNA-независимого контроля мы использовали агглютинин зародышей пшеницы (WGA), общий SA-связывающий лектин. WGA пометил клетки A549 с более высокой плотностью, снова выделяя микроворсинки и наноразмерные кластеры (S3C, фиг.).Наконец, мы пометили клетки, используя антитела против эзрина, актин-связывающего белка. Эзрин сильно обогащен микроворсинками [18] и подтвердил, что большие пальцеобразные структуры действительно являются микроворсинками (S4A Рис.). Поскольку микроворсинки не принимают активного участия в эндоцитозе [19,20], мы сосредоточились на популяции более мелких кластеров AF.

Количественный анализ нанодоменов SNA

Для количественной оценки латеральной организации AF по нашим данным локализации STORM мы использовали алгоритм, основанный на обнаружении локальных различий плотности.Чтобы облегчить анализ, мы разработали рабочий процесс (см. Методы), который позволил нам извлечь геометрические свойства кластеров, а также оценить количество молекул AF (рис. 2A – 2C). Чтобы идентифицировать и исключить большую популяцию кластеров микроворсинок, мы сначала выполнили идентификацию кластеров на картах локализации эзрина (S4B Рис). Мы обнаружили, что большие кластеры эзрина имели размеры 10-50 нм по короткой оси и 0,5-2 мкм по длинной оси (S4B, рис.). Эти параметры затем использовались для фильтрации большой кластерной популяции, соответствующей микроворсинкам, идентифицированным на картах локализации SNA (рис. 2C).После фильтрации мы идентифицировали гетерогенную популяцию небольших кластеров со средней площадью 0,016 мкм ² (рис. 2D). Поскольку площадь кластера была в том же масштабе, что и проецируемая двумерная область сферического IAV (0,0079 мкм ² для r = 50 нм), мы более внимательно изучили плотность молекул внутри каждого кластера. Чтобы определить локальную плотность, мы подсчитали количество локализаций ближайших соседей на расстоянии, в три раза превышающем точность локализации (3σ ~ 30 нм) (S5 Рис.).Интересно, что мы обнаружили, что кластеры AF имеют в среднем 10-кратное обогащение по сравнению с локальным фоном, в то время как некоторые достигают даже 20-кратного увеличения (рис. 2E и 2F). В качестве контроля мы использовали моделирование, чтобы проверить влияние точности локализации на локальную концентрацию; однако это объясняет не более чем 8-кратное обогащение (S6D, рис.).

Рис. 2. Анализ локализации на основе плотности выявляет небольшие скопления СА между микроворсинками.

( A ) Пространственное распределение локализаций STORM из SNA-A647 на клетках A549, демонстрирующее сосуществование двух структурных особенностей: (1) большие микроворсинки, а также (2) маленькие нанодомены.На вставке в A показана реконструкция пиксельного изображения (10 нм / пиксель) карты локализации в A . ( B) Распределение плотности локализаций показано в A в пределах радиуса поиска 50 нм. Цветовая гамма по количеству соседних локализаций. ( C ) Окончательный результат кластеризации с идентифицированными кластерами позволяет количественно оценить площадь кластера. После того, как все идентифицированные кластеры были отфильтрованы в соответствии с их размером для выборочного анализа немикровиллярных структур, мы обнаружили кластеры с площадью между 0.005–0,04 мкм ² ( D ). Большой кластер, помеченный красной пунктирной линией, был отфильтрован (см. Также S4 Рис.). Распределение количества молекул в кластере, оцененное по количеству локализаций ( D , вставка). Внутреннюю структуру кластеров немикроворсинок анализировали по плотности их локальной локализации ( B ). ( E ) Типичный пример двух идентифицированных кластеров, показывающий их внутренний градиент плотности. Цветовой код представляет собой количество локализаций ближайшего соседа в радиусе 30 нм (т.е.е. плотность локальной локализации). По вертикальной оси отложена плотность локализации. Распределение разности плотности между фоном и центром кластера по всему идентифицированному кластеру ( F ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.g002

После идентификации доменов AF мы хотели понять, повлияет ли их наблюдаемая организация на связывание вирусов по сравнению с однородным распределением. Мы построили симуляцию связывания вируса, в которой мы постепенно перераспределяем молекулы AF из случайной организации в кластерную, сохраняя общее количество молекул постоянным.Параллельно мы моделировали стабильную популяцию кластеров на фоне свободных отдельных молекул и варьировали количество молекул в кластере. В обоих случаях мы моделируем сферическую частицу вируса и проецируем ее размер как точку приземления на поверхность моделируемой молекулы. Связывание считается успешным, если вирус контактирует по крайней мере с 10 молекулами AF. Как показано на фиг. S7, мы находим положительную корреляцию между кластеризацией AF и связыванием вируса, что указывает на то, что нанокластеризация увеличивает вероятность эффективной адгезии вируса.

Отслеживание одиночного IAV указывает на исследовательское движение, на которое влияет локальная концентрация AF

Мы задались вопросом, как на движение IAV на клеточной мембране влияет кластеризация AF. Для разработки гипотезы и индивидуального анализа мы сначала создали простую модель диффузии, чтобы моделировать поведение отдельных вирусов на плоской части поверхности клетки. Модель предполагает двумерное случайное блуждание [21], при котором вирус проходит периоды свободной диффузии (с коэффициентом диффузии D _{свободно}) до тех пор, пока он не попадет в область высокой концентрации AF и не станет временно ограниченным (с коэффициентом диффузии D _conf).Время, в течение которого моделируемая частица остается удерживаемой, будет зависеть от D _conf и размера ограниченной области (т. Е. Размера AF-кластера, измеренного с помощью STORM). Для идентификации и количественной оценки замкнутых областей мы использовали ранее опубликованную вероятность удержания I _conf, обозначающую вероятность удержания частицы в момент времени t [22]. Хотя даже моделирование свободной диффузии показало периоды кажущегося ограничения, из-за стохастической природы теплового движения (S8A рис.), Моделирования выявили различные характерные сигнатуры I _conf бесплатно (рис. 3A и 3D) по сравнению с ограниченной диффузией. (Фиг.3B и 3E, S8 Fig и S1 Movie).Наконец, мы определили пороговый уровень локализации, I _thresh = 5 , чтобы исключить эти случайные колебания и определить замкнутые области и время пребывания в замкнутом пространстве (Рис. 3A и 3D; S8 Рис.).

Рис. 3. IAV выполняет произвольное блуждание по плазматической мембране, зависящее от концентрации рецепторов.

Основываясь на нашем количественном анализе распределения AF на клетках A549, мы выдвигаем гипотезу о поведении движения, которое обусловлено локальной концентрацией AF.Сначала мы моделируем это поведение как двумерное случайное блуждание с коэффициентом свободной диффузии D _free ( A ). ( B ) Затем мы моделируем кластеры AF (красные кружки, r = 100 нм), которые из-за повышенной концентрации SA приводили бы к временному ограничению (D _conf free ). Чтобы идентифицировать ограниченные области в моделируемых вирусных траекториях, мы устанавливаем вероятность ограничения I _conf. Соответственно, свободная диффундирующая частица показывает только колебания I _conf ( D ), в то время как добавление временного ограничения приводит к явному увеличению, которое перекрывается с неподвижными фазами частицы, как видно на графике смещения XY ( E ).Мы использовали вероятность ограничения для анализа экспериментальных вирусных траекторий, в частности смешанного типа траекторий ( C ) (см. Также S8 Fig) ( C ). I _conf показывает четкую сигнатуру временного ограничения ( F ), аналогичную предсказанию модели ( E ). В качестве дополнительной задачи для нашей модели мы выполнили субтраекторный анализ, таким образом извлекая время пребывания, D _conf, а также площадь соответствующего временного ограничения в наших вирусных траекториях.( G ) показывает наложение периметров извлеченных замкнутых областей, а также средний радиус (R). Из наших смоделированных данных корреляция D _conf со временем пребывания показывает, что локальное увеличение концентрации AF (то есть уменьшение диффузии) из-за встречи с нанодоменом SA приводит к увеличению локального времени пребывания ( H , красные маркеры ). Мы наблюдали аналогичное поведение, когда тестировали время удержания в экспериментальных вирусных траекториях ( H , черные маркеры).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.g003

Чтобы проверить, согласуется ли наша модель с движением IAV, мы выполнили отслеживание одного вируса на живых клетках A549. Мы рассмотрели физиологические условия (37 ° C), а также условия, которые подавляют эндоцитоз вируса (4 ° C, обработка dynasore), чтобы продлить время пребывания частиц на поверхности клетки. Анализ траектории выявил различные режимы движения, которые мы классифицировали на четыре типа: (1) ограниченный, (2) баллистический, (3) дрейфующий и (4) смешанный (S8, рис.).Баллистическое движение направленное, со скоростью до 1–2 мкм / сек; таким образом, мы отнесли его к транспорту, связанному с микротрубочками, как описано ранее [6,7]. Поскольку этот тип движения следует за успешной интернализацией вируса, мы ожидали увидеть уменьшение его частоты после блокирования эндоцитоза. Действительно, доля баллистических траекторий упала с 30% до менее 5%, когда мы получали изображения при низкой температуре или в присутствии диназора 40 мкМ [23]. Интересно, что мы наблюдали заметное увеличение трех других классов движений, предполагая, что они имеют место на плазматической мембране (S9, рис.).Когда мы затем более внимательно рассмотрели смешанный класс траекторий, мы обнаружили области с увеличенным временем пребывания ВГА, указывающие на пространственное ограничение, чередующееся со свободной диффузией (рис. 3C). Следовательно, мы применили наш анализ ограничения к классу смешанных траекторий IAV, который выявил области выраженного ограничения, которые действительно чередовались с областями свободной диффузии (рис. 3F).

Если домены AF с разными латеральными концентрациями сосуществуют в плазматической мембране, как наблюдалось с помощью STORM, эти области могут служить платформами связывания для диффундирующих вирусов.Согласно нашей простой модели диффузии, локальная концентрация AF доминирует D _conf (см. Методы), что, в свою очередь, определяет время пребывания частиц внутри ограниченных областей. Чтобы проверить в экспериментах, действительно ли D _conf отрицательно коррелирует со временем пребывания, мы выполнили субтраекторный анализ, где каждая траектория была проверена на ограничение в соответствии с I _conf. Затем для каждой ограниченной области мы извлекли время пребывания, а также D _conf (см. «Методы»), обнаружив, что они действительно обратно связаны, как предсказано нашей диффузионной моделью (рис. 3H).Кроме того, субтраекторный анализ позволил нам оценить пространственные размеры ограниченных областей (рис. 3G). Мы обнаружили средний радиус 104 нм, соответствующий средней площади 0,057 мкм ², что лишь немного больше, чем размер кластера SNA, найденный с помощью STORM (рис. 2D). Таким образом, латеральная организация AF, охарактеризованная с помощью STORM, имеет прогнозируемый эффект на мобильность вируса, что согласуется с данными отслеживания IAV живых клеток.

EGFR организован в нанокластеры, которые неслучайно перекрываются с доменами SNA

Как связывание IAV-гликана переводится в проникновение в клетку? Чтобы изучить наноразмерные пространственные отношения между AF и функциональными рецепторами, мы сосредоточились на ранее идентифицированном IAV рецепторе EGFR [9,24].Первоначально мы подтвердили, что наш штамм IAV (h4N2 / X31) связывается и зависит от EGFR для клеточной инфекции в нашей экспериментальной системе. Мы обнаружили, что около 20% IAV совместно локализовались с EGFR (S10 фиг.), И что эффективная инфекция зависела от доступного EGFR плазматической мембраны и могла ингибироваться EGFR-специфическими ингибиторами киназы (S1 фиг., S11 фиг.). Затем мы исследовали латеральную организацию EGFR в клетках A549 с использованием флуоресцентно меченных антител против EGFR. В наших экспериментах по заражению клетки предварительно инкубировали с бессывороточной инфекционной средой (30 мин) перед добавлением вирусов, что является обычной процедурой для инфицирования вирусом гриппа.Чтобы воспроизвести эти условия, мы также выполнили предварительную инкубацию без сыворотки перед тем, как клетки были зафиксированы и помечены иммуномечением для EGFR.

Используя визуализацию STORM, мы обнаружили, что EGFR присутствует в гораздо более низких концентрациях на поверхности клетки по сравнению с SA-конъюгированными AF, но, что интересно, также локализован в нанодоменах (Рис. 4A). Из-за редкости маркировки EGFR, которая может привести к ложному появлению кластеров белка из-за мигания флуорофора [25], мы создали адаптированную схему анализа, основанную на фотофизических характеристиках флуоресцентного зонда, использованного в наших экспериментах (S12 Рис.).

Рис. 4. EGFR организован в нанодомены, которые перекрываются с доменами SNA.

( A ) Клетки A549 метили антителами против EGFR. Визуализация STORM показала кластерную организацию EGFR. Кластеры имеют средний диаметр 60 нм и содержат около 5–10 молекул ( B ). Масштабная линейка 1 мкм. Врезка: 100 нм. ( C ) Двухцветная визуализация STORM клеток A549, меченных SNA и антителами против EGFR. Две панели справа показывают большее увеличение областей в рамке на левой панели.Масштабные полосы: 500 нм (левая панель), 200 нм (правая панель). Степень колокализации оценивалась количественно с использованием основанной на координатах колокализации, где каждая локализация связана со значением колокализации C _A. ( D ) Коробчатые диаграммы распределения локализаций SNA C _A при совместной локализации с (1) SNA, (2) случайным распределением локализаций с одинаковой плотностью, как EGFR, так и (3) EGFR. После стимуляции IAV (MOI ~ 100) мы обнаружили, что фосфорилированный EGFR (Y1068) также локализуется в нанодоменах.Хотя небольшая популяция кластеров, по-видимому, фосфорилируется без стимула, мы наблюдали увеличение популяции активированных кластеров после стимуляции IAV (MOI ~ 100) или EGF (100 нг / мл) ( E , нижняя панель). Чтобы проверить возможное перераспределение EGFR, мы изучили всю популяцию после стимуляции. Хотя после стимуляции EGF мы могли наблюдать уменьшение фракции кластеризованного белка, а также плотности кластера на площадь, мы не могли обнаружить такое перераспределение белка после стимуляции IAV ( F ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.g004

После коррекции мигания и идентификации кластеров мы обнаружили, что в отсутствие стимуляции EGF 30–60% молекул EGFR находятся в кластерах, которые были чувствительны к препараты, дестабилизирующие актин- и липидный рафт (S11E фиг.). Кластеры EGFR имели средний диаметр 29 нм и состояли из 6 молекул (рис. 4B), что согласуется с предыдущими оценками с использованием электронной микроскопии [26] и FRET [27]. Поскольку IAVs связываются с AF на поверхности клетки, мы предположили, что SNA и EGFR должны занимать одни и те же области на плазматической мембране, чтобы обеспечить взаимодействия IAV-EGFR.Чтобы проверить эту гипотезу, мы выполнили двухцветную визуализацию STORM (рис. 4C) с использованием клеток A549, совместно меченных SNA и антителами против EGFR. В самом деле, мы обнаружили, что кластеры EGFR перекрываются с меченными SNA мембранными доменами. Однако, поскольку сиалированные AF гораздо более распространены, чем EGFR, их совместная локализация может происходить просто случайно. Чтобы изучить эту возможность, мы проанализировали наши данные, используя основанную на координатах колокализацию (CBC) [28], которая оценивает пространственную корреляцию двух наборов данных локализации ( и . и . сокластеризация), что отражается в параметре колокализации C _A. Чтобы контекстуализировать степень совместной локализации в нашем наборе данных SNA / EGFR, мы выполнили эксперимент с положительным контролем, используя SNA, конъюгированную с двумя разными флуорофорами (обозначенные SNA / SNA). В качестве отрицательного контроля и для учета различий в плотности молекул для каждого двухцветного поля зрения в SNA / EGFR мы моделировали случайный набор данных с той же плотностью (обозначен как SNA / random).Наконец, мы определяем локализации с C _A> 0,3 как колокализованные (обозначенные ниже C _{A> 0,3}) (S13, рис.). Как показано на рис. 4D, отрицательный контроль SNA / случайный достигает C _{A> 0,3} = 0,035, базовый уровень учитывает только случайную совместную локализацию, в то время как экспериментальный положительный контроль SNA / SNA достигает гораздо более высокого значения, C _{A> 0,3} = 0,27. CBC-анализ совместной локализации SNA / EGFR достиг промежуточного значения, C _{A> 0,3} = 0,17. Эти анализы показывают, что пространственное перекрытие между EGFR и SNA не является полным и, тем не менее, также не случайным, указывая на то, что обе молекулы имеют общую популяцию мембранных компартментов.

Когда заражающий IAV встречает кластер EGFR, можно ожидать, что EGFR будет активирован. Таким образом, мы хотели измерить ответ клетки EGFR на стимуляцию IAV. Примечательно, что для того, чтобы сохранить сигнал на плазматической мембране, эндоцитоз замедлился за счет стимуляции клеток на льду. Мы использовали антитело, которое распознает фосфорилированный тирозин (Y1068, pEGFR), как ранее было показано, что он участвует в IAV-индуцированной активации EGFR [9]. Интересно, что мы обнаружили часть pEGFR в нанодоменах даже в нестимулированных условиях, что указывает на пре- и / или самоактивацию.После стимуляции EGF или IAV мы наблюдали увеличение количества кластеров pEGFR на область плазматической мембраны (рис. 5E). Подобно IAV-индуцированной стимуляции EGFR, увеличение плотности локальных кластеров было чувствительным к ингибированию киназы EGFR (S14A и S14B фиг.).

Рис. 5. Визуализация живых клеток в сверхвысоком разрешении выявляет долгоживущие кластеры EGFR в клетках A549.

EGFR, связанный с фотоконвертируемым белком mEos3, экспрессировался в клетках A549. Последующая визуализация PALM позволяет изучить распределение EGFR в живых клетках на уровне одного белка.В отсутствие каких-либо стимулов мы могли обнаруживать нанодомены EGFR в дорсальной, а также вентральной плазматической мембране ( A ). Шкала: левая панель, 1 мкм. Изображение в A показывает максимальную проецируемую карту локализаций одиночных молекул, записанную за период 10 минут. B показывает два примера кластеров в виде совокупного распределения плотности (верхняя панель), а также разброса по XY со шкалой цветов в зависимости от времени, в которое была обнаружена локализация (нижняя панель).Хотя проекция всей локализации позволяет идентифицировать кластеры белка, мы можем использовать информацию о времени для дальнейшей оценки времени жизни кластера. Как показано в C , совокупный подсчет отдельных локализаций в кластерной области дает прямую информацию о минимальном времени жизни кластера. D показывает соответствующее распределение продолжительности жизни кластеров EGFR, зарегистрированных как на дорсальной, так и на вентральной стороне клетки в отсутствие какого-либо стимула.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.ppat.1008656.g005

Чтобы лучше понять, как связывание IAV приводит к активации EGFR, мы исследовали свойства отдельных кластеров EGFR. Ранее предполагалось, что связывание IAV ведет к локальному увеличению концентрации белков EGFR в кластерах плазматической мембраны, что в конечном итоге приводит к активации сигнала [9], эффект, который также наблюдался ранее в клетках BHK при стимуляции EGF [29]. Чтобы проверить эту гипотезу, мы пометили нестимулированные, стимулированные EGF или IAV клетки, используя антитела против EGFR.После стимуляции EGF мы наблюдали уменьшение популяции сгруппированных молекул, а также количества кластеров на площадь (в среднем на 20%) (рис. 4F). Удивительно, но мы не нашли доказательств значительного перераспределения EGFR после стимуляции IAV (рис. 4F). Кроме того, хотя мы наблюдали IAV, совместно локализованный с EGFR и pEGFR (фиг. S10), мы не смогли обнаружить влияние на размер кластера или количество молекул на кластер EGFR (фиг. S14C).

EGFR образует долгоживущие нанодомены в живых клетках

Поскольку стимуляция IAV не влияет на организацию EGFR, мы предположили, что предварительно сформированные нанокластеры могут участвовать в индуцированной IAV активации EGFR.Хотя вовлечение IAV предварительно сформированных кластеров EGFR было предположено ранее [30], оставалось неясным, будет ли время жизни кластеров EGFR в плазматической мембране достаточно большим, чтобы позволить этот тип взаимодействия. Чтобы оценить время жизни кластеров EGFR, мы обратились к экспериментам по микроскопии живых клеток с использованием клеток A549, экспрессирующих EGFR, меченных фотоконвертируемым белком mEos3.2 [31]. Мы использовали вариант EGFR, который, как ранее было показано, полностью функционирует в системе экспрессии клеток млекопитающих [32].Фотоактивация только небольшого подмножества молекул EGFR-mEos3.2 позволила нам локализовать отдельные молекулы, которые затем можно отслеживать в последовательных кадрах и обновлять с помощью дальнейшей фотоактивации (отслеживание одиночных частиц, sptPALM) [33]. Мы выполнили sptPALM на дорсальной, а также на вентральной плазматической мембране живых клеток A549 в отсутствие EGF, что привело к картированию диффузии белка с высокой плотностью (рис. 5). Расчет среднеквадратичного смещения (СКО) как функции времени запаздывания 𝚫 t позволил определить мгновенный коэффициент диффузии D вдоль траектории.Мы обнаружили широкий диапазон коэффициентов диффузии в диапазоне от 1 до 10 ^-3 мкм ² / сек (S15 фиг.), Что указывает на то, что мобильные и неподвижные белковые фракции сосуществуют в плазматической мембране. Действительно, после классификации траекторий на основе их коэффициента диффузии D графики зависимости MSD от 𝚫 t показали довольно линейную зависимость для траекторий с D > 0,05 мкм ² / с, а для траекторий с D < 0,05 мкм ² / сек кривая приближалась к максимуму при больших значениях 𝚫t (S15 Рис.).Эта характерная временная зависимость кривой MSD от t также указывает на то, что мобильные свободно диффундирующие белки сосуществуют с ограниченными или неподвижными белками EGFR в плазматической мембране.

Те же самые данные затем были использованы для построения карты всех обнаруженных локализаций, которая выявила неоднородное распределение с белками, сгруппированными в нанодомены (рис. 5A). Используя наш индивидуальный анализ идентификации кластеров (как показано на рис. 2A – 2C), мы обнаружили кластеры EGFR с диаметрами в диапазоне от 30 до 300 нм, подтверждая организацию EGFR, наблюдаемую в фиксированных клетках (рис. 4A).Кроме того, поскольку клетки были живыми, мы могли использовать обнаружение одиночных молекул с временным разрешением для количественной оценки временной стабильности кластеров EGFR (рис. 5B). Такой подход использовался ранее для количественной оценки кластеризации полимеразы 2 в живых клетках и называется коррелированным во времени PALM (tcPALM) [34]. Мы выбрали регионы, идентифицированные кластеризацией на основе плотности для выполнения tcPALM (рис. 5B и 5C), и получили распределение времени жизни кластера EGFR со средним значением 140 секунд (рис. 5D, дорсальный).Примечательно, что это время жизни дает только более низкую оценку, поскольку кластер мог существовать до начала сбора данных, а также мог присутствовать после фотообесцвечивания последней кластерной молекулы.

Обсуждение

Понимание начальной фазы вирусной инфекции имеет решающее значение для разработки эффективных контрмер, таких как ингибиторы адгезии, которые улавливают вирусные частицы, прежде чем они смогут вступить в первый контакт вирус-клетка [35,36]. После связывания сиалилированных AF на поверхности клетки IAV должен найти и активировать функциональный рецептор, чтобы проникнуть в свою клетку-мишень и заразить ее.Хотя эти два шага имеют решающее значение для инфекции IAV, остается в значительной степени спекулятивным, как вирусу удается формировать поливалентный контакт с клеткой, сохраняя при этом гибкость для исследования плазматической мембраны и взаимодействия с функциональным рецептором. Здесь мы использовали микроскопию сверхвысокого разрешения для изучения организации взаимодействующих с вирусом молекул в масштабе интерфейса вирус-клетка. Мы обнаружили, что гликановые AF и рецепторы организованы в наноразмерные домены и обеспечивают модель того, как связывание клеток может трансформироваться в взаимодействие и активацию рецептора.Наши результаты схематически представлены на рис. 6.

Рис. 6. Модель IAV-опосредованного связывания клеток, поиска и активации рецепторов.

Используя количественную визуализацию STORM, мы могли показать, что SA-конъюгированные IAV AF, а также один функциональный рецептор, EGFR, образуют нанодомены в плазматической мембране клеток A549. Хотя плотные нанодомены AF представляют собой привлекательную платформу для мультивалентного связывания, их разнообразие в локальной концентрации AF предполагает разнообразие различных времен пребывания, в течение которых IAV будет оставаться связанным в этих доменах.Используя отслеживание одного вируса, мы наблюдали смешанное диффузно-ограниченное движение, которое можно было смоделировать с использованием нашей количественной информации о кластерах SA. Эти данные указывают на управляемый концентрацией рецептора механизм бокового поиска между нанодоменами, обогащенными SA. В конце концов, поскольку домены AF частично перекрываются с EGFR, IAV встречает функциональный рецептор, который может быть активирован, чтобы сигнализировать о входе в клетку. Наши данные также предполагают, что стабильная предварительно сформированная популяция кластеров EGFR активируется во время стимуляции IAV, что, возможно, способствует эффективной передаче сигнала.Кластеры EGFR стабилизируются липидными рафтами, а также кортикальным актином.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.g006

Из иллюстрации становится ясно, что микроворсинки являются доминирующим топографическим признаком дорсальной стороны клетки. Однако из-за своего диаметра они не участвуют в вирусном эндоцитозе. Таким образом, мы сконцентрировали наши усилия на анализе области между микроворсинками и смогли идентифицировать популяцию AF нанодоменов разного размера.Наше моделирование связывания вируса показало, что такая кластерная организация AF является выгодной и положительно коррелирует с эффективностью связывания вируса (S7 фиг.). Гетерогенная кластерная организация может, таким образом, расширить связывающую способность клеточной поверхности и эффективно предоставить вирусной частице диапазон времени связывания для исследования клеточной поверхности, как это было предложено ранее для молекулы межклеточной адгезии, специфичной для дендритных клеток-3-захватывающая не- интегрин (DC-SIGN) [37].Такой способ связывания может быть особенно актуален для вирусов гриппа, которые имеют большую морфологическую изменчивость и спайковый белок с зависящим от штамма сродством и специфичностью.

Одновирусное отслеживание флуоресцентно меченых IAV на и внутри клеток-мишеней [5-7] показало, что после образования начального контакта с клеткой, частицы IAV исследуют плазматическую мембрану в среднем в течение 6 минут до эндоцитоза [6]. Совсем недавно многоцветная визуализация IAV вместе с клатрином показала, что этот период важен для индукции клатрин-зависимого эндоцитоза [7].Мы выполнили отслеживание одного вируса в условиях ограниченного эндоцитоза, чтобы ограничить движение вируса к плазматической мембране. В основном мы находили траектории, где случайная диффузия чередуется с периодами пространственного ограничения. Расчетные размеры ограниченных областей соответствовали площади, найденной для нанодоменов AF с помощью STORM. Этот результат согласуется с нашей основной гипотезой о том, что движение плазматической мембраны вируса в значительной степени зависит от локальной организации и плотности доступных AFs.Хотя мы не можем исключить, что ограничение IAV вызывается другими факторами, такими как механическое улавливание, наши результаты позволяют сформулировать модель того, как кластерная организация AFs контролирует связывание вируса с клеткой на ранней стадии заражения.

Образовав устойчивое взаимодействие со своей клеткой-хозяином, IAV проникают в клетку путем эндоцитоза. Было показано, что EGFR активируется во время и способствует входу IAV-клеток [9], но как IAV взаимодействует с EGFR, остается неясным. Мы обнаружили, что EGFR локализуется в кластерах, которые совместно с AF нанодоменами.Что касается наших результатов и результатов других (недавно рассмотренные в [38]), современный взгляд на плазматическую мембрану предполагает компартментализацию на очень гетерогенные нанодомены с различным происхождением и функцией. Колокализация на наномасштабе, таким образом, измеряется как пространственная близость или совместная кластеризация. Наблюдаемое перекрытие между IAV AF и рецепторными кластерами, таким образом, предполагает, что латеральная организация AF и EGFR лежит в основе сходных, но не идентичных принципов. Важно отметить, что наблюдаемая организация действительно позволяет IAV связывать EGFR при перемещении внутри и между доменами AFs (Рис. 6).

В канонической модели активации EGFR связывает свой субстрат EGF, подвергается димеризации и последующему аутофосфорилированию, тем самым индуцируя множество сигнальных каскадов [39]. Однако, как показано здесь на клетках A549, дополнительный уровень более высоких олигомерных кластеров EGFR был показан в разных типах клеток. Их зарегистрированный диаметр колеблется от 50 нм [29] до 100–300 нм [26,30,40] до размеров, близких к микрометрам [41], с числом молекул от <10 [42] до тысяч [41].Было высказано предположение, что кластеризация способствует активации рецепторов, которые могут играть роль в развитии опухоли [30]. Кроме того, было показано, что размер кластера EGFR реагирует на активацию [29], что указывает на латеральное перераспределение молекул. Что касается кластерной организации EGFR, мы выдвинули гипотезу о двух сценариях, в которых во время активации EGFR либо (1) собирается в активированные кластеры, либо (2) активируются ранее существовавшие кластеры. Следовательно, мы проверили организацию EGFR в (не) стимулированных условиях.В то время как мы наблюдали уменьшение доли кластеризованных молекул, а также количества кластеров на область при стимуляции EGF, эффект, который наблюдался ранее для Erb2 [43], мы не обнаружили серьезного перераспределения в ответ на прикрепление IAV. Этот результат говорит об активации ранее существовавших кластеров, а также может указывать на другой механизм активации. EGFR связывает EGF с высоким сродством (нМ), что приводит к быстрой активации EGFR (в течение 10 мин [44]) и интернализации. IAV связывает EGFR с помощью сиалированных гликанов, процесс с низким сродством, который требует некоторой степени поливалентности.Наши эксперименты по совместной локализации показали, что IAV также связывают несколько кластеров EGFR (S10 фиг.), Указывая на другой механизм рекрутирования / активации. Каким образом IAV в конечном итоге активирует EGFR, пока неясно, и это станет целью будущих исследований. Ранее было показано, что IAV-индуцированный эндоцитоз EGFR действительно медленнее по сравнению с индуцированной EGF активацией, предположительно из-за другого механизма связывания и активации [9]. Используя STORM, мы не смогли обнаружить изменение размера кластера и состава молекул после любой стимуляции.Таким образом, мы заключаем, что пространственные перестройки между кластерами ниже нашего предела разрешения могут в конечном итоге привести к активации кластеров. Для проверки этой гипотезы можно использовать методы, которые более чувствительны к расстояниям белок-белок ниже 20 нм, такие как FRET.

Следуя нашей гипотезе об активации предварительно сформированных кластеров EGFR, мы стремились проверить, существуют ли кластеры EGFR достаточно долго, чтобы позволить их активацию. Таким образом, мы продолжили исследование стабильности нанокластеров EGFR, проводя эксперименты с sptPALM на живых клетках.Мы обнаружили, что время жизни нанодоменов EGFR как в дорсальной, так и в вентральной сторонах клетки увеличилось до 2–4 минут. Это время напоминает продолжительность, в течение которой ВМА остаются на плазматической мембране до начала эндоцитоза (2–3 мин [7]). Хотя длительное время жизни кластера позволило бы активировать уже существующие кластеры, это наблюдение поднимает вопрос о стабилизации кластеров EGFR. Следовательно, мы протестировали стабильность кластеров EGFR при обработке классическими условиями дестабилизации мембранных доменов, такими как деполимеризация актина (латрункулин A) и экстракция холестерина (метил-β-циклодекстрин).Как также наблюдалось ранее [29,30], наши результаты предполагают дестабилизацию кластера после обоих возмущений, на что указывает увеличенная доля некластеризованных молекул EGFR. Интересно, что мы обнаружили более сильный эффект после истощения холестерина, состояния, которое, как ранее было показано, ослабляет репликацию IAV [9]. Очень долгие времена жизни рецепторных кластеров наблюдались ранее для молекул класса I главного комплекса гистосовместимости (MHC), которые образуют актин-стабилизированные домены [45,46]. На данный момент мы можем только предполагать функцию кластеров мембранных рецепторов [38,47].Он может быть возбуждающим, как показано для Т-клеточного рецептора [48] и линкера для активации Т-клеток (Lat) [49,50], а также LFA-1 [51] или CD36 [52]. Эти нанодомены делают клетку очень чувствительной к небольшому количеству сигнальных молекул и из-за высокой концентрации локальных рецепторов обеспечивают быстрый сигнальный ответ [39]. Такая функция кажется вероятной для кластеров EGFR, участвующих во входе клеток IAV, наблюдаемых в нашем исследовании. Но их функция также может быть ингибирующей, как показано для В-клеточного рецептора [53] или его отрицательного корецептора CD22 [54].Рецепторные нанодомены могут даже участвовать в модуляции сигнального выхода. Поскольку EGFR находится на вершине широкого набора сигнальных каскадов, асимметричное распределение рецепторов может позволить клеткам быстро реагировать и обрабатывать различные стимулы [39].

Таким образом, мы идентифицировали сложную компартментализацию клеточной плазматической мембраны в клетках A549 с обоими первичными IAV-связывающими молекулами, сиалилированными AFs и функциональными рецепторами, организованными в нанодомены. Такая организация наблюдалась для др. Мембранных белков и может указывать на общий принцип организации плазматической мембраны (rev. [38]).Мы разработали функциональную модель, чтобы связать организацию латеральной мембраны с ее ролью в вирусной инфекции (рис. 6). Количественная микроскопия сверхвысокого разрешения предоставила универсальный набор инструментов для изучения взаимосвязи между структурой и функцией плазматической мембраны. Наше исследование является первым шагом к пониманию нанофизиологии вирусной инфекции. Связывая организацию с функцией в интерфейсе вирус-клетка, наша цель — лучше понять, как вирусы используют клеточные структуры. Как мембранная компартментализация может модулировать связывание IAV-клеток и рецепторов, как показано здесь, будет дополнено функциональными исследованиями, изучающими активацию задействованного сигнала в будущем.

Материалы и методы

Заявление об этике

Работа с куриными яйцами с эмбрионами проводилась в лаборатории профессора Андреаса Херрманна (Институт биологии, Humbold-Universität zu Berlin, Германия) в соответствии с европейскими правилами и утверждена государственным органом Берлина, Landesamt für Gesundheit und Soziales. Грипп A (h4N2) X-31 размножался в аллантоисных полостях куриных яиц с 10-дневными эмбрионами (Lohmann Tierzucht GmbH, Германия), как описано ранее [55].

Клетки и вирусы

клеток A549 (ATCC CCL-185) любезно предоставлены доктором Торстеном Вольфом (Институт Роберта-Коха в Берлине, Германия). Клетки A549 культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Клетки пассировали каждые 3–4 дня. Клетки не были поляризованы. Мы называем дорсальную и вентральную мембраны верхней поверхностью клетки, а также частью клетки, прикрепленной к субстрату. За день до эксперимента клетки отделяли от колбы для культивирования клеток с использованием 0.5% трипсин / ЭДТА около 10 мин. Клетки разводили в свежей среде DMEM и 3 × 10 ⁵ клеток высевали на 25-миллиметровые круглые стеклянные предметные стекла, покрытые фибронектином (Menzel, # 1.5). Грипп A (h4N2) X-31 размножался в аллантоисных полостях 10-дневных куриных яиц (Lohmann Tierzucht GmbH, Германия), как описано ранее [55]. Очищенные вирусы хранили при -80 ° C. Аликвоты вируса оттаивали в день эксперимента и хранили на льду до дальнейшего использования. Все химические вещества, если не указано иное, были приобретены у Sigma-Aldrich.Среды для культивирования клеток были приобретены у Life Technologies. Для лечения NA мы используем нейраминидазу из Clostridium Perfringens (Sigma), которая расщепляет α2,6- и α2,3-связанные SA.

Инфекция клеток A549

За день до эксперимента 3 * 10 ⁵ клеток высевали на 25-миллиметровые круглые предметные стекла, покрытые фибронектином. Для экспериментов по заражению (S1 фиг.) Клетки либо инкубировали в бессывороточной среде в течение 30 минут (контроль), либо в DMEM с добавлением 100 нг / мл человеческого EGF (R&D Systems) в течение 90 минут для удаления EGFR с поверхности клетки.Клетки инфицировали IAV X-31 (MOI ~ 1) в среде для инфицирования (DMEM, 0,2% альбумин бычьей сыворотки (BSA)) в течение 30 минут перед заменой среды, а затем клетки инкубировали в течение 8 часов в среде для инфицирования. Клетки промывали предварительно нагретым PBS и фиксировали в свежеприготовленном 4% PFA (Alpha Aesar) в течение 10 мин при комнатной температуре. Мы контролировали, что наш протокол фиксации может успешно иммобилизовать молекулы плазматической мембраны в клетках A549 (S2 Рис, S16 Рис). После 25-минутного этапа фиксации / блокирования в PBS с добавлением 0.2% Triton X-100 и 0,2% BSA, клетки инкубировали с первичным антителом (антигриппозный нуклеопротеин (NP), Millipore) в течение 1 часа. Клетки промывали трижды по 10 мин в PBS перед дальнейшей инкубацией со вторичными антителами (козьи антимышиные, конъюгат Alexa 555, Life Technologies) в течение 1 часа. Наконец, клетки промывали PBS, окрашивали DAPI (0,2 мкг / мл в PBS в течение 10 мин) и помещали на стандартные предметные стекла микроскопа с Mowiol (Carl Roth). Слайды были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan.Десять обзорных изображений (20-кратное увеличение) были получены для каждого состояния, и сигнал ядерных NP был количественно определен с помощью Cellprofiler [56]. Для экспериментов по совместной локализации (фиг. S10) и стимуляции клеток (фиг. 4, фиг. S1A, фиг. S14) клетки были инфицированы при MOI = 100. Подробнее о создании экспериментальной системы см. В тексте S1.

Трансфекция клеток A549

За день до трансфекции 2 * 10 ⁵ клеток высевали на 25-миллиметровые круглые предметные стекла, покрытые фибронектином.Клетки трансфицировали плазмидами, кодирующими EGFR-mEos3.2, с использованием Lipofectamine 2000 (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. EGFR-mEos3.2 был клонирован из EGFR-GFP, подаренного Александром Соркиным (плазмида Addgene № 32751). Используя наш протокол трансфекции, мы протестировали кластеризацию EGFR на разных уровнях экспрессии. Мы заметили, что плотность кластеров на площадь, но не размер кластера, зависит от уровня экспрессии (S16, фиг.).

Отслеживание одного вируса

IAV h4N2 / X-31 инкубировали с 50 мкМ липидного красителя DiD (Life Technologies) в течение 2 часов при комнатной температуре.Для удаления свободного красителя вирусы либо осаждали (50 000 г в течение 5 мин), либо очищали с использованием колонки для исключения размера NAP5 (GE Healthcare). Меченные DiD вирусы разводили в инфекционной среде (DMEM, 0,2% BSA) до конечной концентрации 20 мкг / мл (содержание белка) и вирусные агрегаты удаляли с использованием стерильного фильтра 0,2 мкм. Меченые вирусы добавляли к клеткам A549, выращенным в чашках Петри со стеклянным дном, покрытых поли-L-лизином, диаметром 35 мм (MatTek Corp.) и оставляли для прикрепления на льду в течение 10 мин. Клетки промывали PBS и покрывали 2 мл предварительно нагретой DMEM, не содержащей сыворотки и фенолового красного, с добавлением 100 мМ Hepes.Если не указано иное, клетки выдерживали при 4 или 37 градусах на протяжении всего эксперимента. Для экспериментов по возмущению клетки предварительно инкубировали в среде DMEM с добавлением 50 мкМ нокодазола (Sigma) или 40 мкМ dynasore (Sigma) в течение 30 мин. Лекарства присутствовали на протяжении всего эксперимента. Инкубация при низкой температуре была достигнута с использованием специальной температурной камеры микроскопа. DiD возбуждали лазерным светом с длиной волны 633 нм, который отражался от образца дихроичным зеркалом 488/633 нм.Эмиссионный свет собирали с помощью масляно-иммерсионного объектива PlanApo VC 60x (Nikon) и отображали на камере EMCCD (Andor iXon, Andor Technology). Изображения записывались со скоростью 2 кадра в секунду в течение 10 мин. Стеки изображений обрабатывались и траектории строились с помощью ParticleTracker для ImageJ [57]. Далее траектории анализировались с использованием пользовательских скриптов MatLab (Mathworks). Чтобы идентифицировать и охарактеризовать временное удержание частиц, мы использовали метод, разработанный Simson и др. .[22] реализовано в нашем конвейере пользовательского анализа. Вкратце, алгоритм берет сегмент траектории и определяет, двигалась ли частица в соответствии с заданным коэффициентом свободной диффузии ( D _{свободно}) внутри сегмента, то есть остаются ли частицы в предсказанной области. Это переводится в вероятность заключения I _conf. Поскольку идентификация зависит от длины сегмента S [22], мы оптимизировали S, используя смоделированные траектории, что привело к S = 5 с для нашего анализа.

Анализ траектории и моделирование слежения за отдельными частицами

Случайные траектории броуновских частиц были сгенерированы с использованием пакета сценариев msdanalzer [58], включенного в специальную процедуру MatLab. Траектории отдельных вирусов анализировали, как описано выше. Анализ траектории и суб-траектории был выполнен с использованием msdanalzer для извлечения коэффициентов диффузии из графиков среднеквадратичного смещения (MSD, 2 >) в зависимости от времени запаздывания (Δt).Графики зависимости MSD от времени задержки были подогнаны в соответствии с типом двигательного поведения, которое было либо свободной диффузией ( 2 > = 4D _free Δt), либо, для анализа субтраекторий, ограниченной (суб) диффузией ( 2 > = 2 > (1-A ₁ exp (−4A ₂ D _conf Δt / )). Мы нашли для IAV средний коэффициент свободной диффузии D _{свободный} = 0,041 мкм ² / с.

Использование D _{бесплатно}, а также временного шага (Δt = 0.5 с), смещение свободно диффундирующей частицы следует распределению Гаусса со стандартным отклонением, определяемым как σ = sqrt (4D _free Δt). Временное ограничение было введено путем создания суб-траектории с использованием D _conf. Для моделирования времени пребывания мы сгенерировали случайные траектории, которые попадают в область ограничения, характеризуемую D _conf с диаметром 50–300 нм в соответствии с размером кластеров SNA из измерений STORM (S1 Movie). Ограниченные области были идентифицированы с использованием вероятности удержания I _conf, и время пребывания частицы в ограничении с I _conf> пороговым значением было принято как время пребывания.D _conf изменяли, как показано на рис. 2.

Получение меченых лектинов и антител

Неконъюгированный агглютинин Sambuccus nigra (SNA, VectorLabs) или антитела против EGFR (Sigma) разбавляли до 0,6 мг / мл в 100 мкл PBS (с добавлением 50 мМ NaHCO ₃). Добавляли эфир AlexaFluor 647 NHS (Life Technologies) или сложный эфир Star Red NHS (Abberior) до конечной концентрации (150 мкМ) и раствор инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.Добавляли 100 мкл PBS и раствор наносили на колонку для исключения размера NAP5 (GE Healthcare), предварительно уравновешенную PBS. Фракции по 300 мкл собирали в 96-луночный планшет и анализировали с помощью ультрафиолетовой и видимой спектроскопии (Nanodrop2000, ThermoFisher). Собирали пиковые белковые фракции и рассчитывали степень мечения. Меченые фракции лектина и антител хранили при 4 ° C до дальнейшего использования.

Пробоподготовка SMLM

За день до эксперимента 3 * 10 ⁵ клеток A549 высевали на 25-миллиметровые круглые предметные стекла, покрытые фибронектином.Для визуализации SNA клетки промывали предварительно нагретым PBS и фиксировали в течение 10 мин в свежеприготовленном 4% параформальдегиде (Alpha Aesar). Клетки блокировали в блокирующем растворе (5% BSA в PBS) и инкубировали в 50 мкг / мл SNA, разведенной в блокирующем буфере, в течение 30 мин. Клетки промывали 3 раза в PBS и затем фиксировали в свежеприготовленном 4% параформальдегиде в течение 10 мин при комнатной температуре. Для мечения EGFR клетки промывали, фиксировали и блокировали, как описано выше, затем инкубировали с первичными антителами против EGFR, конъюгированными с Alexa 647.Для двухцветной визуализации клетки инкубировали с неконъюгированными первичными антителами против EGFR в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки трижды промывали PBS и дополнительно инкубировали с раствором 5 мкг / мл вторичных антител, конъюгированных с Alexa 750 (козьи антимышиные, Life Technologies), и 5 мкг / мл SNA, конъюгированных с Alexa 647. Клетки промывали 3 раза в PBS и затем фиксировали в свежеприготовленном 4% параформальдегиде в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки A549 на фиг. 1B были помечены 10 нг / мл SNA-Alexa647 и 1 мкг / мл Hoechst33342 (Life Technologies) в DMEM.

SMLM микроскопия

Одно- и двухцветные изображения STORM

EGFR были выполнены с использованием недавно разработанного микроскопа с плоским полем для эпи-освещения [59]. Вкратце, для выключения флуорофоров использовались два лазера с длинами волн 642 нм (2RU-VFL-P-2000-642-B1R, MPB Communications) и 750 нм (2RU-VFL-P-500-750-B1R, MPB Communications). на образце, в то время как лазер 405 нм (OBIS, Coherent) контролировал скорость возврата флуорофоров в состояние, излучающее флуоресценцию. Пользовательский дихроик (ZT405 / 561/642/750 / 850rpc, Chroma) отражал лазерный свет и проходило флуоресцентное излучение до и после прохождения через объектив (CFI60 PlanApo Lambda Å ~ 60 / NA 1.4, Nikon). После прохождения соответствующего фильтра (ET700 / 75M, Chroma или ET810 / 90m, Chroma) излучаемый от образца свет отображался на sCMOS-камеру (Zyla 4.2, Andor). Осевое положение образца контролировалось с помощью открытого аппаратного модуля автофокусировки pgFocus (http://big.umassmed.edu/wiki/index.php/PgFocus). Обычно с помощью Micromanager [60] записывалось 20 000 кадров при времени экспозиции 10 мс. Визуализация выполнялась с использованием оптимизированного буфера STORM, как описано ранее [61]. Стеки изображений были проанализированы с использованием специальной программы анализа, адаптированной к CMOS [62].Боковое смещение образца было исправлено с использованием корреляции изображений (Thunderstorm [63]) или золотых реперных маркеров (B-Store, https://github.com/kmdouglass/bstore). Двухцветные наборы данных анализировали с помощью LAMA [64]. Случайные наборы данных для анализа CBC были созданы в MatLab.

Одноцветное изображение

SNA было выполнено на модифицированном инвертированном микроскопе Olympus IX71. Лазер с длиной волны 641 нм (Coherent, CUBE 640-100C) и лазер с длиной волны 405 нм (Coherent, CUBE 405-100C) отражался многополосным дихроиком (89100 bs, Chroma) на задней апертуре 100×1.Масляный объектив 3 NA (Olympus, UplanFL), установленный на пьезообъективе сканера (P-725 PIFOC, Physik Instrumente). Собранную флуоресценцию фильтровали с использованием полосового эмиссионного фильтра (ET700 / 75, Chroma) и отображали на камеру EMCCD (IxonEM +, Andor) с размером пикселя 100 нм и с использованием обычного усилителя CCD с частотой кадров 25 кадров в секунду. Интенсивность лазера на образце, измеренная после объектива, составляла 2–4 кВт / см ². 20 000 кадров при времени экспозиции 30 мс были записаны с помощью Micromanager [60].Стеки изображений были проанализированы с помощью ThunderStorm [63]. Боковой дрейф образца был скорректирован с использованием корреляции изображений (Thunderstorm [63]) или золотых реперных маркеров (PeakSelektor, IDL, любезно предоставлено Харальдом Гессом).

Визуализацию

PALM выполняли на инвертированном микроскопе Zeiss Axio Observer D1, оборудованном объективом 100x, 1,49 NA (Zeiss). Активационные и возбуждающие лазеры с длинами волн 405 нм (когерентный куб) и 561 нм (кристаллический лазер) освещали образец в режиме полной внутренней флуоресценции (TIRF).Мы использовали четырехцветный дихроичный 89100bs (Chroma), флуоресцентное излучение фильтровали с помощью эмиссионного фильтра ET605 / 70 (Chroma) и детектировали с помощью умножающей на электроны ПЗС-камеры (iXon +, Andor Technology) с результирующим размером пикселя 160 нм. Для каждой интересующей области обычно было собрано 10000 изображений площадью 41×41 мкм2 с временем экспозиции 30 мс. Фотоактивируемые белки были активированы лазерной интенсивностью 405 нм <0,5 Вт / см ², выбранной для поддержания разреженной популяции активированных молекул для локализации, и возбуждены лазерной интенсивностью 561 нм ~ 1 кВт / см ².Стеки изображений были проанализированы с помощью ThunderStorm [63].

СТЭД микроскопия

Измерения STED живых клеток проводили с помощью микроскопа Abberior STED (Abberior Instruments, Германия), как описано ранее в [65,66]. Микроскоп оснащен титан-сапфировым STED-лазером (MaiTai HP, Spectra-Newport). Меченый Abberior Star Red SNA возбуждали с помощью импульсного диодного лазера 640 нм (Picoquant, Германия) со средней мощностью возбуждения 5–10 мкВт на объективе (UPlanSApo 100x / 1.4 масло, Олимп). Истощение было достигнуто с помощью перестраиваемого импульсного лазера на 780 нм. Микроскоп работал с использованием программного обеспечения Abberior Imspector. Измерения STED с фиксированными ячейками (S3 рис.) Проводили на микроскопе Leica SP8 STED. Микроскоп был оснащен объективом HC PL APO 100x, лазером белого света для возбуждения и лазером истощения с длиной волны 592 нм.

Кластерный анализ

Для кластерного анализа мы использовали алгоритм приложений пространственной кластеризации с шумом на основе плотности (DBSCAN) [67], который был встроен в нашу процедуру пользовательского анализа MatLab.DBSCAN требует только два входных параметра: Eps и k . Затем он подсчитывает для каждой локализации, сколько соседей локализации находится в пределах круга радиусом Eps . Если локализация имеет k соседей в пределах Eps , она классифицируется как часть кластера. Если у него недостаточно соседей в пределах Eps , но он сам является соседом локализации кластера, он классифицируется как граничная точка. Все остальные локализации классифицируются как некластеризованные.Чтобы проанализировать очень плотные и неоднородные карты локализации, полученные нами при визуализации SNA, мы выполнили два последовательных прогона DBSCAN с разными параметрами для Eps и k . Только это позволило нам учесть все визуально видимые кластеры. Затем кластерные и граничные точки объединяются и передаются в единую часть процедуры анализа кластерного анализа. Для каждого кластера мы исследовали набор параметров, таких как площадь и средний диаметр, а также количество локализаций в кластере.Далее мы проанализировали распределение плотности локализации на кластер, выполнив поиск ближайшего соседа с радиусом поиска 20 нм. Вся локализация выполнялась с использованием специально написанных скриптов MatLab (MathWorks).

Калибровка одной молекулы

Чтобы измерить точность локализации нашей системы и откалибровать параметры группирования, мы выполнили визуализацию STORM на изолированных молекулах красителя. Круглые стеклянные предметные стекла 25 мм (Menzel, # 1.5) очищали плазмой в течение 10 минут и покрывали раствором поли-L-лизина (100 мкг / мл в ddH ₂ O) в течение 1 часа при комнатной температуре.После промывки в ddH ₂ O слайды сушили и инкубировали с 10–50 пМ конъюгированной с красителем SNA или антителами против EGFR соответственно. Через 15 мин слайды были промыты один раз, а затем отображены в экспериментальных условиях. Карты локализации были отфильтрованы и скорректированы с использованием золотых реперных знаков. Индивидуальные локализации сначала были сгруппированы с промежутком = 0 и радиусом поиска 30 нм, чтобы объединить отдельные события мигания, затем снова сгруппированы с промежутком времени, равным общему времени сбора данных (15 тыс. Кадров).Это позволяет количественно оценить разброс локализаций по x и y 𝜟 (x , y) (т.е. точность локализации σ), а также время между отдельными событиями мигания (то есть время темноты t _D). Вся локализация выполнялась с использованием специально написанных скриптов MatLab (MathWorks).

Моделирование связывания вирусов

Мы моделировали плоский участок поверхности клетки (1×1 мкм ²), включающий n молекул фактора прикрепления в случайных положениях.Для анализа степени кластеризации (S7B Рис.) Моделируемые молекулы постепенно смещались в кластеры, в то время как n оставались постоянными. Чтобы проанализировать влияние размера кластера (то есть количества рецепторов на кластер), мы смоделировали постоянную концентрацию молекул фактора прикрепления и добавили кластеры рецепторов указанного размера (S7A, рис.). Вирус, пытающийся прикрепиться, был смоделирован как двумерная проекция сферической вирусной частицы размером 100 нм. Вирусный центр случайным образом помещали на имитируемую поверхность и подсчитывали количество молекул фактора прикрепления в радиусе 50 нм.Успешным связыванием считалось более 10 молекул. Скрипты Matlab для запуска моделирования доступны на GitHub (https://github.com/christian-7/Virus_Binding_Simulation).

Вспомогательная информация

S1 Рис. Создание экспериментальной системы.

Сначала мы проверили, подходит ли наша экспериментальная система (вирус и клетки) для предполагаемых экспериментов. Связывание вируса тестировали при высоком MOI после низкотемпературной адсорбции с последующим иммуноокрашиванием с использованием антисыворотки против h4N2.Мы обнаружили, что наш штамм IAV может эффективно связываться с клетками A549 при высоком MOI (~ 100) ( A ). Отдельные ячейки выделены пунктирными линиями. Инфекция IAV проводилась при более низком значении MOI (~ 1), чтобы достичь высокой контрастности инфекции и избежать чрезмерного заражения. После инфицирования клетки инкубировали в течение 8 часов, затем фиксировали и иммуноокрашивали с использованием антител против NP. Инфекция была определена количественно как накопление ядерных NP и проанализирована с помощью CellProfiler [56] (соотношение NP / DAPI) ( B ). Мы обнаружили, что наш вирус гриппа A h4N2 / X31 может эффективно инфицировать клетки A549 с титром 8.3 * 10 ⁵ фокусообразующих единиц (ФФЕ) на мл. Клетки A549 обрабатывали либо 100 нг / мл EGF в течение 30 минут для снижения концентрации доступных рецепторов EGF на клеточной поверхности, либо 0,01 Ед / мл нейраминидазы в течение 3 часов при 37 ° C. Клетки инфицировали вирусом гриппа A / X31 (MOI ~ 1) в течение 8 часов, затем фиксировали и иммуно метили на вновь продуцированный вирусный нуклеопротеин (NP) ( D ). Ядра клеток контрастировали с DAPI. Сигнал ядерных NP был количественно определен с использованием автоматического анализа изображений с помощью CellProfiler ( E, F ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s002

(PDF)

S2 Рис. EGFR иммобилизован после химической фиксации.

Клетки A549 трансфицировали плазмидами, кодирующими EGFR-mEos3.2, за 24 часа до визуализации. В день эксперимента среду роста DMEM заменяли на среду Лейбовица, и клетки переносили в держатель образцов микроскопа и отображали с использованием освещения TIRF в течение 10 мин на поле зрения. Индивидуальные белки EGFR можно было локализовать и отслеживать в нескольких кадрах. показывает рендеринг всех локализаций из одного поля зрения. B показывает траектории трех молекул EGFR вокруг нанокластера (заштрихованная область в A ). Мы обнаружили неподвижную белковую фракцию около 45%. После фиксации PFA подвижность EGFR была сильно снижена, что привело к более мелким кластерам ( C, визуализированное изображение; D , траектории в прямоугольной области) и фракции неподвижного белка> 95% ( E ). Чтобы связать степень иммобилизации, мы также отслеживали локализации, происходящие от реперных точек золота, иммобилизованных на предметном стекле (Bkgd в E ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s003

(PDF)

S3 Рис. Наноразмерная организация гликанов в клетках A549.

Клетки A549 фиксировали, метили с помощью SNA и отображали с помощью STED. Мы обнаружили аналогичную гликановую организацию небольших кластеров, а также выступающих микроворсинок, как это было визуализировано с помощью STORM ( A ). Подобная организация гликанов наблюдалась при использовании SNA на клетках MDCK ( B ). Мы также пометили клетки A549 агглютинином зародышей пшеницы (WGA), который, в отличие от SNA, менее специфично метит все сиалированные гликаны ( C ).Используя WGA, мы могли воспроизвести компартментализацию нанокластеров на поверхности клетки, а также выступающие полые микроворсинки (стрелки в C , правая панель).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s004

(PDF)

S4 Рис. Наноразмерная организация эзрина в клетках A549.

( A ) Клетки A549 были помечены иммуномечением на актин-связывающий белок эзрин, который, как было показано, обогащен микроворсинками [18]. Клетки были визуализированы с помощью STORM.Микроворсинки четко различимы и напоминают большую кластерную популяцию, наблюдаемую на SNA-меченых клетках и при сканирующей электронной микроскопии (SEM, вставка). Масштабные линейки: левая панель: 2 мкм, правая панель: 500 нм, вставка: 200 нм. ( B ) Карты локализации Ezrin могут затем использоваться для установки порогового значения для размера кластеров, полученного из кластеризации DBSCAN, для специального анализа популяции кластеров немикроворсинок на картах локализации SNA (рис. 2).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s005

(PDF)

S5 Рис. Экспериментально полученная точность локализации σ для Alexa 647 и Alexa 750.

Стеклянные слайды были промыты, обработаны плазмой и покрыты поли-L-лизином (0,01% в воде) в течение 1 часа. Конъюгированные антитела разводили в PBS до конечной концентрации ~ 10 нМ и адсорбировали на предметных стеклах с покрытием. Отдельные молекулы были визуализированы в экспериментальных условиях. Локализации, происходящие от одиночных молекул Alexa 647 ( A ) и Alexa 750 ( B ), были выровнены для оценки средней точности локализации: σ _{x, y} A647 = 12 нм и σ _{x, y} A750 = 21 нм.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s006

(PDF)

S6 Рис. Точность локализации частично имитирует локальный градиент концентрации.

Чтобы проверить, учитывает ли точность локализации градиент плотности локализации, который мы наблюдали в AF-кластерах (рис. 3), мы смоделировали кластеры случайных локализаций ( A ), используя данные о размере кластера, взятые из наших экспериментальных измерений STORM (т.е. радиус r , количество локализаций n , точность локализации σ ).Затем определялась локальная плотность с использованием поиска ближайшего соседа в радиусе 3 σ . Мы действительно наблюдали, что смоделированные кластеры демонстрируют примерно 8-кратное локальное обогащение (см. Один пример в A — C ). Затем мы смоделировали кластеры, следуя полному распределению экспериментальных данных (т.е. радиус r , количество локализаций n ). Сравнивая с градиентом плотности, наблюдаемым в наших экспериментальных данных (D, и рис. 3), мы обнаруживаем, что оба распределения хорошо разделены, и что описанный эффект учитывает только изменения плотности <8-кратные.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s007

(PDF)

S7 Рис. Кластерная организация AF увеличивает вероятность связывания IAV.

Чтобы оценить влияние кластеризации AF на эффективность связывания вируса с клеткой-мишенью, мы смоделировали два сценария в области мембраны 1×1 мкм, ( A ) с изменяющимся размером кластера и ( B ) с различной степенью кластеризации. Для A мы смоделировали постоянную боковую концентрацию AF (черный) и добавили кластеры AF (синий) при увеличении размера.В B мы сохраняем общее количество AF постоянным и постепенно сдвигаем молекулы в кластеры. В обоих случаях приближающийся вирус был смоделирован как 2D-проекция небольшой сферической частицы IAV (область контакта в виде красных кружков в A и B ). Попытка связывания считалась успешной, если внутри области контакта было обнаружено не менее 10 молекул AF. C и D показывают результат моделирования, нанесенный на график как вероятность привязки из 1000 имитаций по отношению к соответствующему параметру тестируемого кластера.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s008

(PDF)

S8 Рис. Вероятность удержания может надежно идентифицировать переходную иммобилизацию на траекториях IAV.

Чтобы проверить точность вероятности ограничения, мы смоделировали случайные траектории, которые не содержали или не содержали ограниченную область, и рассчитали вероятность ограничения I _conf для каждой траектории. Ограниченная область была выбрана согласно экспериментальным данным для радиуса (r = 50–300 нм), а также D _conf (рис. 2 и 3).Чтобы идентифицировать ограниченную область, мы должны были установить порог I _conf, который мы установили на 5, чтобы обеспечить высокую чувствительность. Наше моделирование (100 траекторий) показывает, что на этом пороге вероятность ложной идентификации (ложные срабатывания) составляет ~ 10%, которая падает до 0% при I _conf> 8 ( A ). Для моделирования, которое действительно содержало ограничение (пример в B ), мы обнаружили среднюю эффективность обнаружения (истинные положительные результаты) 90% по всему пространству моделирования (900 траекторий, цветовой код в C ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s009

(PDF)

S9 Рис. Отслеживание одного вируса IAV на клетках A549.

Отслеживание одного вируса на живых клетках A549 выявило четыре основных типа движения вируса: ( A ) трехступенчатое движение, ( B ) ограниченное, ( C ) смешанное, ( D ) дрейф. Доля всех режимов движения была проанализирована при указанных условиях ( E ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s010

(PDF)

S10 Фиг. IAV совместно локализуются с EGFR и pEGFR на клетках A549.

Клетки A549 инфицировали IAV X31 (MOI = 100) при низкой температуре в течение 15 мин, затем фиксировали и иммуноокрашивали с использованием антисыворотки против h4N2 вместе с антителами против EGFR или pEGFR (Y1068). Мы проанализировали снимки в широкоугольном эпи освещении ( A ), а также в двухцветном STORM ( B ). Используя широкопольное эпи-освещение, мы наблюдали яркие пятна IAV, которые совместно локализуются с кластерами EGFR и сигналом pEGFR (стрелки).Масштабная линейка = 2 мкм. Мы количественно оценили эту совместную локализацию и обнаружили, что в обоих случаях около 20% IAV совместно локализуются с EGFR и pEGFR соответственно. В двухцветных реконструкциях STORM мы также могли наблюдать IAV, которые колокализуются с EGFR или pEGFR. В частности, из-за повышенного разрешения мы могли различать полностью перекрывающуюся колокализацию ( B , стрелки), а также IAV, которые связаны с более чем одним (p) кластером EGFR ( B , звездочка). Показаны обзорные изображения (слева), а также четыре увеличенных области (справа) для каждого обзора.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s011

(PDF)

S11 Фиг. Активность EGFR-киназы необходима для IAV-опосредованной активации и инфицирования EGFR.

Клетки A549 были инфицированы IAV X31 (MOI = 100) при 4 ° C в течение 15 минут после предварительной обработки 10 мкМ гефитиниба в течение 1 часа при 37 ° C. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали с использованием антител pEGFR (Y1068) для мечения активированного EGFR ( A ), а ядерную ДНК метили DAPI. Цитозольный сигнал pEGFR анализировали с помощью ImageJ ( B ).Для проверки эффективности заражения клетки A549 инфицировали IAV X31 (MOI = 1) в течение 8 часов после предварительной обработки 10 мкМ гефитинибом в течение 1 часа при 37 ° C. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали с использованием антител против NP ( A ), а ядерную ДНК метили DAPI ( C ). Инфицированных количественно определяли как ядерный сигнал NP / DAPI, как анализировали с помощью CellProfiler ( D ). Нанокластеры EGFR чувствительны к дестабилизации актиновых или липидных доменов ( E ). Клетки A549 инкубировали с латрункулином A (1 мкМ) или метил-b-циклодекстрином (MCD) (40 мкг / мл) в течение 1 ч при 37 ° C, затем фиксировали и окрашивали с использованием антител против EGFR.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s012

(TIF)

S12 Рис. Коррекция мигания молекул для данных EGFR.

Чтобы оценить количество излучающих молекул из набора данных STORM и избежать ложной кластеризации отдельных молекул, мы объединили несколько локализаций, происходящих от одной и той же молекулы, в одну локализацию. Процедура слияния требует промежутка, а также промежутка времени, в пределах которого локализации будут считаться происходящими из одной и той же молекулы.Чтобы откалибровать эти значения, мы визуализировали изолированные меченые антитела против EGFR в экспериментальных условиях. Локализации, происходящие от одной молекулы, могут быть сгруппированы для определения их латерального распространения ( A ), а также темнового времени между отдельными вспышками ( B ). Чтобы гарантировать высокую достоверность слияния, граница темнового времени определялась квантилем 99% до 18 с. Используя экспериментально определенный разброс локализации ( A , 35 нм) и отсечку темнового времени, локализационные всплески от одной и той же молекулы теперь могут быть объединены в одну позицию.Хотя каждая молекула подсчитывается несколько раз из-за мигания молекулы (нескорректированное, C ), слияние позволяет более точно оценить количество молекул, избегая ложной кластеризации (скорректировано, D ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s013

(PDF)

S13 Рис. Экспериментальный положительный контроль для двухцветного анализа колокализации STORM.

Мы использовали две разные версии SNA в качестве экспериментального положительного контроля колокализации.Это послужило нам также в качестве номинатора, чтобы лучше оценить степень совместной локализации нашей пары тестовых молекул SNA / EGFR. Клетки A549 были помечены двумя вариантами SNA, конъюгированными с Alexa 647, а также с Alexa 555 ( A ). Оба набора данных локализации были проанализированы с использованием CBC, в результате чего было получено значение совместной локализации C _A, связанное с каждой отдельной локализацией. Гистограмма C _A для одного канала показана в B . Мы установили порог 0,3, выше которого локализации считались колокализованными. C показывает один набор данных SNA с цветовой кодировкой в соответствии с C _A. D показывает все локализации из одного набора данных с C _A> 0,3.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s014

(PNG)

S14 Рис. Размер кластера EGFR и количество молекул не изменяются после стимуляции IAV или EGF.

Активация кластера

EGFR может подавляться ингибитором киназы EGFR гефитинибом ( A, B ). Клетки A549 инфицировали IAV X31 (MOI = 100) при 4 ° C в течение 15 минут после предварительной обработки 10 мкМ гефитинибом в течение 1 часа при 37 ° C.Клетки фиксировали и иммуноокрашивали с использованием антител pEGFR (Y1068) для мечения активированного EGFR. Клетки получали с помощью STORM, а кластер pEGFR идентифицировали с помощью DBSCAN. После стимуляции EGF или IAV мы обнаружили увеличение количества кластеров pEGFR на область (как также показано на фиг. 5). Этот эффект может быть подавлен лечением гефитинибом ( A, B ). A549 обрабатывали инфекционной средой (контроль) или инфекционной средой, содержащей IAV (MOI = 100) или 100 нг / мл EGF, в течение 15 минут при 4 ° C.Клетки фиксировали и иммуноокрашивали с использованием антител против EGFR. При любой стимуляции мы не могли обнаружить изменение размера кластеров EGFR или количества молекул на кластер ( C ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s015

(PDF)

S15 Рис. Коэффициенты диффузии одиночных молекул из sptPALM EGFR-mEos3 в клетках A549.

Клетки A549 временно трансфицировали EGFR-mEos3. Получение изображений sptPALM и анализ траекторий одиночных молекул выявили широкий диапазон коэффициентов диффузии.На левой панели в A и B показано распределение коэффициентов диффузии sptPALM, полученных на дорсальной ( A ) и вентральной плазматической мембране ( B ). Молекулы были классифицированы как подвижные (D> 0,5 мкм2 / с) и неподвижные (D <0,5 мкм2 / с) соответственно. Расчетные графики MDS ( A и B , правые панели) для обоих классов демонстрируют довольно линейную зависимость для подвижной фракции, в то время как кривая насыщается с увеличением времени запаздывания для неподвижной фракции, последнее указывает на пространственное ограничение.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s016

(PDF)

S16 Рис. Уровень экспрессии EGFR коррелирует не с размером кластера EGFR, а с количеством кластеров на область.

Клетки A549 трансфицировали плазмидами для EGFR-mEos3.2 за 24 часа до экспериментов по визуализации. В день эксперимента клетки фиксировали и визуализировали. Чтобы оценить уровень экспрессии, мы сделали снимок предварительно преобразованной зеленой версии mEos перед фотопреобразованием и получением PALM.Мы провели кластерный анализ DBSCAN для разных клеток на разных уровнях экспрессии ( A ). Мы наблюдали, что количество кластеров на область увеличивается при более высоком уровне экспрессии, в то время как радиус кластера не изменяется ( B ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s017

(PDF)

S1 Фильм. Эволюция вероятности удержания I

_conf, а также расстояние частиц от источника для моделируемой траектории вируса.

Частица движется согласно D _free, пока не встретит AF-кластер (верхняя панель, красные кружки). Из-за более высокой концентрации AF диффузия частиц замедляется до D _conf, и частица удерживается. Удержание частиц обнаруживается по увеличению вероятности удержания (средняя панель), а также по плато на графике расстояния от исходной точки (нижняя панель).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s018

(AVI)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Катарину Хорст за поддержку и Андреаса Херрманна за полезные обсуждения рукописи.

Список литературы

1. Neumann G, Noda T, Kawaoka Y. Возникновение и пандемический потенциал вируса гриппа h2N1 свиного происхождения. Природа. Издательская группа «Природа»; 2009; 459: 931–939. pmid: 19525932
2. Харрис А., Кардон Г., Винклер Д. К., Хейманн Дж. Б., Брехер М., Уайт Дж. М. и др. Плейоморфия вируса гриппа, охарактеризованная криоэлектронной томографией. Proc Natl Acad Sci U S. A. Национальная академия наук; 2006; 103: 19123–7. pmid: 17146053
3.Маир С.М., Людвиг К., Херрманн А., Зибен С. Связывание рецепторов и стабильность pH — как гемагглютинин вируса гриппа А влияет на вирусную инфекцию, специфичную для хозяина. Biochim Biophys Acta — Biomembr. 2014; 1838: 1153–1168. pmid: 24161712
4. Заутер Н.К., Беднарски М.Д., Вюрцбург Б.А., Хэнсон Дж. Э., Уайтсайдс Г. М., Скехель Дж. Дж. И др. Гемагглютинины из двух вариантов вируса гриппа связываются с производными сиаловой кислоты с миллимолярными константами диссоциации: исследование протонного ядерного магнитного резонанса 500 МГц.Биохимия. 1989; 28: 8388–96. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2605190 pmid: 2605190
5. Лю С.-Л, Чжан З-Л, Тиан З-К, Чжао Х-С, Лю Х, Сунь Е-З и др. Эффективное и действенное противодействие заражению вирусом гриппа с помощью отслеживания отдельных частиц на основе квантовых точек. САУ Нано. 2012; 6: 141–150. pmid: 22117089
6. Lakadamyali M, Rust MJ, Babcock HP, Zhuang X. Визуализация инфекции отдельных вирусов гриппа. Proc Natl Acad Sci U S A.2003. 100: 9280–5. pmid: 12883000
7. Руст MJ, Lakadamyali M, Zhang F, Zhuang X. Сборка эндоцитарного аппарата вокруг отдельных вирусов гриппа во время проникновения вируса. Nat Struct Mol Biol. 2004. 11: 567–573. Доступен: pmid: 15122347
8. де Врис Э., Черне Д.М., Винхольтс М.Дж., Кобос-Хименес В., Схолте Ф., Гарсия-Састре А. и др. Рассечение эндоцитарных путей вируса гриппа А выявляет макропиноцитоз как альтернативный путь проникновения. Пекош А., редактор.PLoS Pathog. Публичная научная библиотека; 2011; 7: e1001329. pmid: 21483486
9. Eierhoff T, Hrincius ER, Rescher U, Ludwig S, Ehrhardt C. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) способствует проникновению вирусов гриппа A (IAV) в клетки-хозяева. PLoS Pathog. 2010; 6: e1001099. pmid: 20844577
10. Шлессингер Дж. Лиганд-индуцированная, рецепторно-опосредованная димеризация и активация рецептора EGF. Клетка. 2002. 110: 669–672. pmid: 12297041
11. Бёттхер К., Людвиг К., Херрманн А., ван Хеель М., Старк Х.Структура гемагглютинина гриппа при нейтральном и фузогенном pH с помощью электронной криомикроскопии. FEBS Lett. 1999; 463: 255–259. pmid: 10606732
12. Schermelleh L, Heintzmann R, Leonhardt H. Руководство по флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. J Cell Biol. 2010; 190: 165–75. pmid: 20643879
13. Лю З., Лавис Л.Д., Бетциг Э. Визуализация динамики и структуры живых клеток на уровне одной молекулы. Mol Cell. Elsevier Inc .; 2015; 58: 644–659. pmid: 26000849
14.Hell SW, Wichmann J. Нарушение предела дифракционного разрешения с помощью стимулированного излучения: флуоресцентная микроскопия с истощением стимулированного излучения. Opt Lett. Оптическое общество Америки; 1994; 19: 780. pmid: 19844443
15. Руст MJ, Bates M, Zhuang X. Получение изображений с субдифракционным пределом с помощью микроскопии стохастической оптической реконструкции (STORM). Нат методы. 2006; 3: 793–5. pmid: 16896339
16. Бетциг Э., Паттерсон Г. Х., Суграт Р., Линдвассер О. В., Оленич С., Бонифачино Дж. С. и др.Визуализация внутриклеточных флуоресцентных белков с нанометровым разрешением. Наука (80-). 2006; 313.
17. Гесс СТ, Гирираджан ТПК, Мейсон MD. Получение изображений сверхвысокого разрешения с помощью микроскопии локализации флуоресцентной фотоактивации. Биофиз Дж. Биофизическое общество; 2006. 91: 4258–72. pmid: 16980368
18. Берриман М., Франк З., Бретчер А. Эзрин концентрируется в апикальных микроворсинках самых разных эпителиальных клеток, тогда как моэзин обнаруживается в основном в эндотелиальных клетках.J Cell Sci. 1993; 1043: 1025–1043. Доступно: http://jcs.biologies.org/content/105/4/1025.short
19. Helenius A, Kartenbeck J, Simons K, Fries E. О проникновении вируса леса семлики в клетки BHK-21. J Cell Biol. 1980; 84.
20. Sauvanet C, Wayt J, Pelaseyed T, Bretscher A. Структура, регуляция и функциональное разнообразие микроворсинок в апикальном домене эпителиальных клеток. Annu Rev Cell Dev Biol. Ежегодные обзоры; 2015; 31: 593–621. pmid: 26566117
21.Сакстон М.Дж., Якобсон К. ОТСЛЕЖИВАНИЕ ОДИНОЧНЫХ ЧАСТИЦ: приложения к мембранной динамике. Annu Rev Biophys Biomol Struct. Ежегодные обзоры 4139 El Camino Way, P.O. Box 10139, Palo Alto, CA 94303–0139, США; 1997; 26: 373–399. pmid:
24
22. Simson R, Sheets ED, Jacobson K. Обнаружение временного латерального ограничения мембранных белков с использованием анализа отслеживания одиночных частиц. Биофиз Дж. 1995; 69: 989–993. pmid: 8519998
23. Macia E, Ehrlich M, Massol R, Boucrot E, Brunner C, Kirchhausen T.Dynasore, проницаемый для клеток ингибитор динамина. Dev Cell. 2006; 10: 839–50. pmid: 16740485
24. Zhu L, Ly H, Liang Y. Передача сигналов PLC-γ1 играет специфичную для подтипа роль в постсвязывании клеточного проникновения вируса гриппа А. J Virol. 2014; 88: 417–24. pmid: 24155396
25. Демпси Г.Т., Воан Дж. К., Чен К. Х., Бейтс М., Чжуанг X. Оценка флуорофоров для оптимальной производительности при визуализации с супер-разрешением на основе локализации. Природные методы. 2011. С. 1027–1036. pmid: 22056676
26.Ян С., Раймонд-Стинц М.А., Ин В., Чжан Дж., Лидке Д.С., Стейнберг С.Л. и др. Картирование рецепторов ErbB на клеточных мембранах рака молочной железы во время передачи сигнала. J Cell Sci. 2007; 120: 2763–2773. pmid: 17652160
27. Сабо Б., Сёллоши Дж., Надь П. Кокластеризация ErbB1 и ErbB2, выявленная с помощью FRET-сенсибилизированного отбеливания акцепторов. Биофиз Дж. 2010; 99: 105–114. pmid: 20655838
28. Malkusch S, Endesfelder U, Mondry J, Gelléri M, Verveer PJ, Heilemann M.Координационный анализ колокализации данных микроскопии локализации одиночных молекул. Histochem Cell Biol. 2012; 137: 1–10. pmid: 22086768
29. Ариотти Н, Лян Х, Сюй И, Чжан И, Йонекубо И, Индер К. и др. Активация рецептора эпидермального фактора роста ремоделирует липидную среду плазматической мембраны, вызывая образование нанокластеров. Mol Cell Biol. 2010; 30: 3795–804. pmid: 20516214
30. Ван И, Гао Дж, Гуо Х, Тонг Т, Ши Икс, Ли Л. и др. Регуляция образования нанокластеров EGFR за счет ионного белок-липидного взаимодействия.Cell Res. Шанхайский институт биологических наук Китайской академии наук; 2014; pmid: 25001389
31. Zhang M, Chang H, Zhang Y, Yu J, Wu L, Ji W и др. Рациональный дизайн истинно мономерных и ярких фотоактивируемых флуоресцентных белков. Нат методы. 2012; 9: 727–729. pmid: 22581370
32. Картер Р. Э., Соркин А. Эндоцитоз химеры функционального эпидермального фактора роста рецептора зеленого флуоресцентного белка. J Biol Chem. Американское общество биохимии и молекулярной биологии; 1998. 273: 35000–7.pmid: 9857032
33. Manley S, Gillette JM, Patterson GH, Shroff H, Hess HF, Betzig E, et al. Картирование траекторий одиночных молекул с высокой плотностью при помощи фотоактивированной локализационной микроскопии. Нат методы. 2008. 5: 155–157. pmid: 18193054
34. Cisse II, Izeddin I, Causse SZ, Boudarene L, Senecal A, Muresan L и др. Кластеризация полимеразы II в науке (80-). 2013; 245: 664–667.
35. Папп I, Зибен С., Сиссон А.Л., Костка Дж., Бёттчер С., Людвиг К. и др.Ингибирование активности вируса гриппа с помощью поливалентных гликоархитектур с подобранными размерами. ChemBioChem. WILEY ‐ VCH Verlag; 2011; 12: 887–895. pmid: 21384484
36. Папп I, Зибен С., Людвиг К., Роскамп М., Бёттхер С., Шлехт С. и др. Ингибирование инфекции вируса гриппа поливалентными наночастицами золота, функционализированными сиаловой кислотой. Небольшой. WILEY ‐ VCH Verlag; 2010. 6: 2900–2906. pmid: 21104827
37. Манзо К., Торрено-Пина Дж., Йостен Б., Рейниерен-Берен И., Гуальда Е. Дж., Лоза-Альварес П. и др.Область шеи лектина C-типа DC-SIGN регулирует его пространственно-временную организацию поверхности и способность связывания вируса с антигенпрезентирующими клетками. J Biol Chem. 2012; 287: 38946–38955. pmid: 23019323
38. Якобсон К., Лю П., Лагерхольм BC. Боковая организация и подвижность компонентов плазменной мембраны. Клетка. Elsevier Inc .; 2019; 177: 806–819. pmid: 31051105
39. Casaletto JB, McClatchey AI. Пространственная регуляция рецепторных тирозинкиназ в развитии и раке.Нат Рев Рак. Nature Publishing Group, подразделение Macmillan Publishers Limited. Все права защищены.; 2012; 12: 387–400. pmid: 22622641
40. Абулроб А., Лу З., Бауманн Э., Воборник Д., Тейлор Р., Станимирович Д. и др. Наноразмерная визуализация кластеризации рецепторов эпидермального фактора роста: эффекты ингибиторов. J Biol Chem. 2010. 285: 3145–3156. pmid: 19959837
41. Надь П., Дженей А., Кирш А. К., Сёллози Дж., Дамьянович С., Йовин TM. Зависимая от активации кластеризация тирозинкиназы рецептора erbB2, обнаруженная с помощью сканирующей оптической микроскопии в ближнем поле.J Cell Sci. 1999; 112 (Pt 1: 1733–41. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10318765
42. Сабо Б., Хорват Г., Сёллоши Дж., Надь П. Количественная характеристика крупномасштабной ассоциации ErbB1 и ErbB2 с помощью проточных цитометрических измерений гомо-FRET. Биофиз Дж. 2008; 95: 2086–2096. pmid: 18487307
43. Надь П., Клаус Дж., Джовин ТМ, Арнд-Джовин Дж. Распределение покоящихся и связанных с лигандом тирозинкиназ рецепторов ErbB1 и ErbB2 в живых клетках с использованием анализа количества и яркости.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2010; 107: 16524–16529. pmid: 20813958
44. Фей Д, Аксамитене Э, Кияткин А, Холоденко Б.Н. Моделирование передачи сигналов рецепторной тирозинкиназы: вычислительные и экспериментальные протоколы. Методы молекулярной биологии. Humana Press Inc .; 2017. С. 417–453. pmid: 28730495
45. Лави Ю., Губернатор Н., Эдидин М., Гебер Л.А. Продолжительность жизни мембранных кластеров класса I главного комплекса гистосовместимости контролируется актиновым цитоскелетом. Биофиз Дж.Биофизическое общество; 2012; 102: 1543–1550. pmid: 22500754
46. Лави Й., Эдидин М.А., Гебер Л.А. Динамические участки мембранных белков. Biophys J. Elsevier; 2007; 93: L35–7. pmid: 17631538
47. Гарсия-Параджо М.Ф., Камби А., Торрено-Пина Дж., Томпсон Н., Якобсон К. Нанокластеризация как доминирующий признак организации плазматической мембраны. J Cell Sci. 2014; 127: 4995–5005. pmid: 25453114
48. Schamel WWA, Arechaga I, Risueño RM, van Santen HM, Cabezas P, Risco C и др.Сосуществование поливалентных и моновалентных TCR объясняет высокую чувствительность и широкий диапазон ответа. J Exp Med. 2005; 202.
49. Lillemeier BF, Mörtelmaier MA, Forstner MB, Huppa JB, Groves JT, Davis MM. TCR и Lat экспрессируются на отдельных белковых островках на мембранах Т-клеток и сцепляются во время активации. Nat Immunol. Исследования природы; 2010; 11: 90–96. pmid: 20010844
50. Уильямсон Д. Д., Оуэн Д. М., Росси Дж., Магенау А., Верманн М., Гудинг Дж. Дж. И др.Ранее существовавшие кластеры адаптера Lat не участвуют в ранних сигнальных событиях Т-клеток. Nat Immunol. Издательская группа «Природа»; 2011; 12: 655–662. pmid: 21642986
51. Камби А., Йустен Б., Купман М., де Ланге Ф., Берен И., Торенсма Р. и др. Организация интегрина LFA-1 в нанокластеры регулирует его активность. Mol Biol Cell. Американское общество клеточной биологии; 2006; 17: 4270–81. pmid: 16855029
52. Jaqaman K, Kuwata H, Touret N, Collins R, Trimble WS, Danuser G и др.Цитоскелетный контроль диффузии CD36 способствует его рецепторной и сигнальной функции. Клетка. 2011; 146: 593–606. pmid: 21854984
53. Ян Дж., Рет М. Олигомерная организация рецептора B-клеточного антигена на покоящихся клетках. Природа. Исследования природы; 2010; 467: 465–469. pmid: 20818374
54. Гаспаррини Ф., Фест С., Брукбауэр А., Маттила П.К., Мюллер Дж., Ничке Л. и др. Наноразмерная организация и динамика сиглека CD 22 кооперируются с цитоскелетом в ограничении передачи сигналов BCR.EMBO J. 2015; 1–23.
55. Эйсфельд А.Дж., Нойманн Г., Каваока Ю. Выделение, культура и идентификация вируса гриппа А. Nat Protoc. Издательская группа «Природа»; 2014; 9: 2663–2681. pmid: 25321410
56. Карпентер А.Е., Джонс Т.Р., Лампрехт М.Р., Кларк С., Канг И., Фриман О. и др. CellProfiler: программное обеспечение для анализа изображений для определения и количественной оценки фенотипов клеток. Genome Biol. BioMed Central; 2006; 7: R100. pmid: 17076895
57. Сбальзарини И.Ф., Кумутсакос П.Отслеживание характерных точек и анализ траектории для видеоизображения в клеточной биологии. J. Struct Biol. 2005; 151: 182–195. pmid: 16043363
58. Тарантино Н., Тиневез Дж. Й., Кроуэлл Э. Ф., Буассон Б., Энрикес Р., Мхланга М. и др. TNF и IL-1 проявляют различные потребности в убиквитине для индукции супрамолекулярных структур NEMO-IKK. J Cell Biol. 2014; 204.
59. Дуглас К.М., Сибен С., Аркетти А., Ламберт А., Мэнли С. Получение изображений нескольких клеток со сверхвысоким разрешением с помощью оптимизированного эпи-освещения с плоским полем.Nat Photonics. Исследования природы; 2016; 10: 705–708. pmid: 27818707
60. Эдельштейн А., Амодай Н., Гувер К., Вейл Р., Стурман Н., Эдельштейн А. и др. Компьютерное управление микроскопами с помощью μManager. Текущие протоколы в молекулярной биологии. Хобокен, штат Нью-Джерси, США: John Wiley & Sons, Inc.; 2010. С. 14.20.1–14.20.17. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1420s92 pmid: 208
61. Olivier N, Keller D, Gönczy P, Manley S. Удвоение разрешения при визуализации 3D-STORM за счет улучшенных буферов.PLoS One. Публичная научная библиотека; 2013; 8: e69004. pmid: 23874848
62. Хуанг Ф., Хартвич Т.М., Ривера-Молина Ф.Е., Лин И, Дуим В.С., Лонг Дж. Дж. И др. Видеонаблюдение с использованием алгоритмов локализации одиночных молекул, специфичных для sCMOS-камер. Нат методы. Исследования природы; 2013; 10: 653–658. pmid: 23708387
63. Овесны М., Кржижек П., Борковец Я., Свиндрих З., Хаген Г.М. ThunderSTORM: комплексный плагин ImageJ для анализа данных PALM и STORM и создания изображений в сверхвысоком разрешении.Биоинформатика. 2014; 30: 2389–2390. pmid: 24771516
64. Малкуш С., Хейлеманн М., Хенсель М., Клингауф Дж., Пилер Дж., Мюллер Б. и др. Извлечение количественной информации из данных визуализации одиночных молекул в сверхвысоком разрешении с помощью LAMA – LocAlization Microscopy Analyzer. Издательская группа «Научная публика»; 2016; 6: 34486. pmid: 27703238
65. Галиани С., Вайтхе Д., Реглински К., Крус-Сарагоса Л.Д., Гарсия Э., Клаузен М.П. и др. Микроскопия сверхвысокого разрешения выявляет компартментализацию пероксисомальных мембранных белков.J Biol Chem. Американское общество биохимии и молекулярной биологии; 2016; 291: 16948–62. pmid: 27311714
66. Clausen MP, Galiani S, Serna JB de la, Fritzsche M, Chojnacki J, Gehmlich K, et al. Пути к оптической STED-микроскопии. NanoBioImaging. De Gruyter Open; 2014; 1.
67. Эстер М., Эстер М., Кригель Х. П., Сандер Дж., Сюй X. Основанный на плотности алгоритм для обнаружения кластеров в больших пространственных базах данных с шумом. Proc 2nd Internat Conf Knowl Discov Data Min.1996; 226–231. Доступно: http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.121.9220

Многовалентная функция — Математическая энциклопедия

Понятие, которое является естественным обобщением понятия однолистной функции. Регулярная или мероморфная функция $ f (z) $ в домене $ D $ комплекса $ z $ — самолет называется $ p $ — валент в $ D $ ( $ p = 1, 2, \ точки $) если в этом домене каждое из своих значений принимает не более $ p $ раз, то есть если количество корней уравнения $ f (z) = w $ в $ D $, для любого $ w $, не превышает $ p $.Геометрически это означает, что над каждой точкой $ w $ — самолет лежит не более $ p $ точки римановой поверхности, в которые $ w = f (z) $ отображает $ D $. Для $ p = 1 $, $ f (z) $ однолистна в $ D $.

Наряду с этим самым простым классом $ p $ — валентные функции, большую роль в теории многовалентных функций играют функции, которые являются $ p $ — валент в определенном обобщенном смысле: «р-валент в среднем». Пусть $ f (z) $ — регулярная или мероморфная функция в области $ D $ $ z $ — плоскости, пусть $ n (w) $ — количество корней в $ D $ уравнения $ f (z) = w $ и пусть $ p $ быть положительным числом.{2} $$

для всех $ R> 0 $. Геометрически это означает, что площадь части римановой поверхности, до которой $ w = f (z) $ отображает $ D $ и проецирование на диск $ | w |

Многовалентные функции, как и однолистные, изучались различными способами: с точки зрения искажающих характеристик области при отображениях этими функциями, по оценкам коэффициентов рядов, представляющих эти функции, и т. Д. множество экстремальных свойств, аналогичных экстремальным свойствам однолистных функций. Например, есть следующие обобщения на случай $ p $ — Валентные функции двух классических результатов в теории однолистных функций: принципа площади и оценки второго коэффициента (см. гипотезу Бибербаха).{p +} 1 + \ точки $$

является обычным и $ p $ — валент в диске $ | z | <1 $, тогда

$$ \ tag {4} | a _ {p +} 1 | \ leq 2 п. $$

Неравенства (2) и (4) являются наилучшими из возможных. Эти два результата связаны с самыми ранними фундаментальными результатами теории $ p $ — Валентные функции. Неравенство (2) доказано также для функций вида (1), которые являются $ p $ — валентность в среднем по областям в $ | \ zeta | > 1 $, и (4) доказано для функций вида (3), которые $ p $ — валентность в среднем по областям в $ | z | <1 $. {p} $ ровно $ p $ раз (прямой аналог теоремы Кёбе о покрытии, ср.{-} 2p $ ( $ \ theta $ настоящий). Кроме того, для функций вида (3), которые являются $ p $ - валентный в среднем по кругам в $ | z | <1 $, есть точная оценка

$$ | a _ {p +} 2 | \ leq p (2 p + 1), $$

, а для подкласса $ p $ — Для валентных функций такого вида есть точная оценка для следующего коэффициента:

$$ | a _ {p +} 3 | \ leq \ \ frac {2} {3} п (п + 1) (2 п + 1). $$

Два последних неравенства являются для поливалентных функций аналогами оценок $ | a _ {3} | \ leq 3 $ и $ | a _ {4} | \ leq 4 $, известен для однолистных функций (см. гипотезу Бибербаха).{2}} \Правильно ) . $$

Помимо перечисленных выше фундаментальных классов поливалентных функций, значительное место в исследованиях занимают специальные классы поливалентных функций, например, функции, которые обычно являются вещественными порядка $ p $, $ p $ — валентный звездный, $ p $ — валентно выпуклый, $ p $ — валентная, близкая к выпуклой, $ p $ — valent bounded и другие, которые являются обобщениями, соответственно, типично вещественных, звездообразных, выпуклых, почти выпуклых, ограниченных однолистных и других функций (см. {2}) (р — к)! (п + к)! (п — р — 1 )! } | a _ {k} | , \ $$

$$ п> р.$$

Один из аналогов гипотезы Бибербаха для функций вида (11), регулярных и $ p $ — валентинка в $ | z | <1 $ является гипотезой Гудмана о справедливости (12) для коэффициентов $ a _ {n} $. В частности, гипотеза Гудмана верна для $ p $ - Валентные типично-вещественные функции порядка $ p $ в $ | z | <1 $. Это также было доказано для класса $ p $ - Валентные функции, являющиеся обобщением класса однолистных функций, выпуклых в направлении мнимой оси.{n}, \ | z | <1. $$

Для типично реальных функций порядка $ p $ в $ | z | <1 $ это неравенство доказано.

Классы $ p $ — валентный звездообразный и $ p $ — валентные выпуклые функции, $ S (p) $ и $ C (p) $ соответственно, определяются следующим образом. Функция $ f (z) $ принадлежит $ S (p) $, $ p = 1, 2 \ точки $ если регулярно в $ | z | <1 $, если $ f (0) = 0 $ и если есть число $ \ rho $, $ 0 <\ rho <1 $, такой, что

$$ \ mathop {\ rm Re} \левый \{ \ frac {z f ^ {\ prime} (z)} {f (z)} \Правильно \} > 0, $$

$$ \ int \ limits _ {0} ^ {{2} \ pi} \ mathop {\ rm Re} \ left \ { \ frac {z е ^ {\ prime} (z)} {е (z)} \ right \} d \ theta = 2 p \ pi, \ \ theta = \ mathop {\ rm arg} z, $$

за $ \ rho <| z | <1 $. {k} f (z)] \Правильно \} > 0, \ \ z \ в D, $$

, затем $ f (z) $ $ p $ — валент в $ D $.

Многовалентные функции изучались также в многосвязных областях. В этом случае многие оценки могут быть выражены в терминах функций, отображающих данную многосвязную область в каноническую риманову поверхность, и в терминах функции ядра Бергмана. Первым основным результатом, связанным с вопросом о существовании конформных отображений многосвязной области на многолистную каноническую поверхность, является следующая теорема Грунского: Пусть $ D $ — конечносвязная область в $ z $ — самолет с $ z = \ infty $ как внутреннюю точку и с граничными компонентами, которые не являются точками, и пусть $ Q _ {p} (z) $ — заданный многочлен степени $ p \ geq 1 $; тогда для любого заданного $ \ theta $ $ 0 \ leq \ theta <\ pi $, существует единственная функция $ \ Phi _ \ theta (z) $, обычный в $ D $ кроме полюса в $ z = \ infty $, главная часть которого в точке $ z = \ infty $ ( включая свободный член) совпадает с $ Q _ {p} (z) $ и который ассоциируется с каждой граничной компонентой $ D $ прямолинейный отрезок уклона $ \ theta $ с действительной осью.Другими словами, функция $ w = \ Phi _ \ theta (z) $ отображает $ D $ в целом $ p $ - листовой $ w $ - плоскость с параллельными щелями наклона $ \ theta $. Доказано также существование конформных отображений данной конечносвязной области на другие канонические многолистные поверхности; Экстремальные свойства, аналогичные некоторым экстремальным свойствам однолистных функций, установлены для многовалентных функций. Было показано, что наиболее общий класс многовалентных функций, мероморфных в конечносвязной области, для которых справедлива теорема площади, имеет простую геометрическую характеристику.

Основными методами исследования многовалентных функций являются метод граничного интегрирования, метод симметризации и метод квадратичных дифференциалов (ср. Квадратичный дифференциал).

Вариационные методы в теории многовалентных функций менее эффективны, чем в теории однолистных функций.

Список литературы

[1]	G.M. Голузин, «О -валентные функции» Матем. Сб. , 8 : 2 (1940) стр.277–283 (на русском языке) (аннотация на немецком языке)
[2]	W.K. Хейман, «Многовалентные функции», Cambridge Univ. Press (1958)
[3]	J.A. Дженкинс, «Однолистные функции и конформное отображение», Springer (1958)
[4]	К. Пете, «Оценка коэффициента валентности функции в единичном церкуле» Бюлл. Акад. Полон. Sci. , 20 : 3 (1972) с. 219–220 (аннотации на русском и английском языках)
[5]	A.Э. Ливингстон, «-валентные функции, близкие к выпуклым» Пер. Амер. Математика. Soc. , 115 : 3 (1965) стр. 161–179
[6]	R.J. Лич, «Оценки коэффициентов для некоторых многовалентных функций» Pacific J. Math. , 74 : 1 (1978) pp. 133–142
[7a]	J. Krzyz, «О производной ограниченно -валентных функций» Ann. Univ. Мария Кюри-Склодовская, секта. А , 12 : 2 (1958) с.23–28 (рефераты на русском и польском языках)
[7b]	J. Krzyz, «Теоремы искажения для ограниченно -валентных функций» Ann. Univ. Мария Кюри-Склодовская, секта. A , 12 : 3 (1958) pp. 29–38 (аннотации на английском и польском языках)
[8]	S. Ozaki, Sci. Rep. Tokyo Bunrika Daigaku A , 2 : 40 (1935) стр. 167–188
[9]	Ю.Е. Аленицын, «Теоремы площади для функций, аналитических в конечносвязной области» Матем.СССР Изв. , 7 : 5 (1973) с. 1129–1151 Изв. Акад. АН СССР сер. Мат. , 37 : 5 (1973) стр. 1132–1154
[10]	S.K. Сингх, Math. Студент , 30 : 1-2 (1973) стр. 79–90
[11]	A.W. Гудман, «Открытые задачи об однолистных и многовалентных функциях» Бюлл. Амер. Математика. Soc. , 74 : 6 (1968) стр. 1035–1050

Как цитировать эту запись:
Многовалентная функция. Математическая энциклопедия. URL: http://encyclopediaofmath.org/index.php?title=Multivalent_function&oldid=47942

Вычислительные данные о поливалентно связывающих полимерах

Мультивалентное связывание обычно используется в биологии для создания прочных конформных связей с одновременным использованием нескольких слабых связывающих взаимодействий. Связи считаются поливалентными, когда несколько лигандов одного вида одновременно связываются с множеством рецепторов другого вида. Вместе эта связь может быть намного сильнее, чем сумма ее частей.В этой диссертации мы используем теорию и моделирование крупнозернистой броуновской динамики со специфическим реактивным связыванием для изучения общих характеристик взаимодействий поливалентных полимеров. Наше моделирование объединяет длину и временные рамки и позволяет анализировать большие полимерные системы, которые связывают мишени на субнанометровом масштабе длины. Хотя представленное моделирование и теория являются очень общими и могут быть применены ко многим различным системам поливалентных полимеров, этот тезис конкретно исследует последствия для двух приложений: поливалентные полимеры как ловушки для подавления инфекции и полимеры как каркасы для биоконденсатов.

Многие патогены используют многовалентные связи для прикрепления к поверхности наших клеток, прежде чем проникнуть внутрь и вызвать инфекцию. Таким образом, существует значительный интерес к предотвращению заражения вирусами, бактериями и токсичными белками путем ингибирования этого этапа прикрепления с помощью мультивалентных ловушек. Было проведено множество экспериментов, показывающих успешное связывание длинных полимеров или других больших поливалентных структур с коллоидами или небольшими белками, которые патогены используют для связывания с нашими клетками. Хотя эти эксперименты показали, насколько перспективны поливалентные ингибиторы для предотвращения инфекции, теоретическое понимание того, почему конструктивные параметры поливалентных полимеров приводят к определенной аффинности связывания, все еще отсутствует.Моделирование может легко выделить один параметр проекта, чтобы обеспечить прямую связь между структурой и функцией, когда эксперименты не всегда могут этого сделать. Это исследование предназначено для систематического изучения взаимосвязи структуры поливалентных полимеров с их поведением при связывании.

В первой половине этой диссертации мы исследуем конструктивные свойства полимерных связующих и то, как степень полимеризации, качество растворителя, характер аффинности сайта связывания, жесткость основной цепи и концентрация мишени изменяют аффинность мультивалентного связывания.Мы предлагаем простую теорию, чтобы показать, что многовалентные полимеры ограничены своей способностью и энергетическими затратами на формирование полимерных петель. Далее мы покажем, как эти результаты и теория влияют на сродство связывания полимеров с гетерогенными сайтами связывания и определяют влияние гибкости основной цепи полимера и качества растворителя на сродство связывания. Поливалентные полимеры также являются важным компонентом биоконденсатов. Жидкоподобные капли, состоящие из белков и нуклеиновых кислот, встречаются повсюду в клетках.Хотя функция этих биоконденсатов все еще активно изучается, ясно, что поливалентные полимеры важны для их образования посредством разделения фаз жидкость-жидкость (LLPS).

Существует мало теоретических исследований биоконденсатов, которые содержат связывание между частицами асимметричного размера и валентности, а влияние поливалентных полимеров на динамику этих жидких капель не совсем понятно. Изучение того, как поливалентные полимеры модулируют динамику капель, важно, потому что кристаллизация или затвердевание капель часто связано с нейродегенеративными расстройствами, такими как деменция и боковой амиотрофический склероз (БАС).Таким образом, во второй половине этой диссертации мы представляем исследование роли многовалентных полимеров в каплях LLPS и их результирующей динамики. Мы рассматриваем, как множество параметров дизайна может изменить фазовую границу систем с поливалентными полимерами, связывающимися с меньшими мишенями, включая качество растворителя, валентность, сродство связывания, специфические и неспецифические сайты связывания и жесткость скелета.

Мы обнаружили, что в соответствии с предыдущими исследованиями других систем, системы с асимметричной валентностью также показали повышенное разделение фаз с повышенным сродством связывания и валентностями.Мы показываем, что разделение фаз из-за неспецифических связей очень чувствительно к изменениям притяжения, но это разделение фаз за счет специфических связей гораздо более устойчиво. Комбинируя специфическую и неспецифическую многовалентность, системы могут точно настроить границу разделения фаз. Жесткость полимера также может модулировать границу раздела фаз, где жесткие стержневидные полимеры менее способны вызывать разделение фаз, чем их гибкие аналоги. Мы также выясняем, как сродство связывания полимера с мишенью может быть использовано для образования капель, разделенных микро фазой.Наконец, мы показываем, что усиление притяжения к полимерам может замедлить диффузию мишени внутри капель при одновременном уменьшении плотности капель, что может сказаться на затвердевании капель.

Мы надеемся, что эта работа предоставит направление для рационального дизайна синтетических поливалентных полимерных систем, таких как ингибиторы патогенов, а также улучшит понимание природных биологических систем, таких как биоконденсаты.