Трехмостовый гелик: купить Mercedes-Benz G 63 AMG в Украине

Основные моменты

•

Спираль моста и области переключения образуют сложную сеть в RNAP.

•

Системы транскрипции σ ⁷⁰ и σ ⁵⁴ по-разному используют эту сеть взаимодействия.

•

Фактор транскрипции DksA и σ ⁵⁴ Область I также вносит свой вклад в эту сеть.

•

Нарушение этой сети усиливает обратное прослеживание и внутренний гидролиз РНК.

Abstract

В бактериальной РНК-полимеразе (РНКП) мостиковая спираль и переключающие области образуют сложную сеть с каталитическим активным центром и основным каналом. Эти взаимодействия важны для катализа, гидролиза и движения зажимных доменов.Путем нацеливания на консервативные остатки в Escherichia coli RNAP, мы можем показать, что функции этих областей по-разному требуются во время σ ⁷⁰ -зависимой и контрастной σ ⁵⁴ -зависимой активации транскрипции и, таким образом, потенциально лежат в основе ключевых механистических различий. между двумя парадигмами транскрипции. Мы также демонстрируем, что фактор транскрипции DksA напрямую регулирует σ ⁵⁴ -зависимую активацию как положительно, так и отрицательно.Этот результат согласуется с наблюдаемым воздействием DksA на σ ⁷⁰ -зависимые промоторы. DksA, по-видимому, не оказывает значительного влияния на связывание РНКП с предварительно расплавленной промоторной ДНК, но сильно влияет на активность на стадии начального синтеза РНК на промоторах, регулируемых σ ⁵⁴ . Поразительно, что удаления области I σ ⁵⁴ достаточно, чтобы инвертировать действие DksA (от стимуляции к ингибированию или наоборот, ) на двух тестовых промоторах. Созданные нами мутанты RNAP также демонстрируют сильную склонность к возврату.Эти мутанты увеличивают скорость гидролизного расщепления транскрипта до уровня, сопоставимого с уровнем, наблюдаемым в RNAP Thermus aquaticus , даже в отсутствие некомплементарного нуклеотида. Эти новые фенотипы предполагают важную функцию мостиковой спирали и переключающих областей в качестве храповика против обратного трекинга и регулятора гидролиза РНК.

Ключевые слова

РНК-полимераза

мостик-спираль

переключающие области

DksA

Гидролиз РНК

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

Copyright © 2015 Авторы.Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Разделение мостиковой спирали Cas12a приводит к снижению активности обрезки, повышенной чувствительности к несоответствию и нарушению конформационных переходов | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Широко распространенные и универсальные прокариотические системы CRISPR – Cas (сгруппированные с регулярными интервалами, короткие палиндромные повторы и связанные белки Cas) представляют собой мощное оружие против чужеродных нуклеиновых кислот.Недавно в репертуар ферментов Cas, используемых для редактирования генов, была добавлена ​​одноэффекторная нуклеаза Cas12a, принадлежащая системе CRISPR-Cas типа V. Cas12a — это двояковыпуклый фермент, состоящий из доли REC и Nuc, соединенных клином, доменом REC1 и мостовой спиралью (BH). Мы создали варианты BH и интегрировали биохимические и одномолекулярные FRET (smFRET) исследования, чтобы выяснить роль BH для ферментативной активности и конформационной гибкости Francisella novicida Cas12a.Мы демонстрируем, что BH влияет на активность обрезки и чувствительность к рассогласованию Cas12a, что приводит к вариантам Cas12a с улучшенной точностью расщепления. Измерения smFRET показывают неизвестное до сих пор открытое и закрытое состояние апо Cas12a. Варианты BH предпочтительно принимают открытое состояние. Переход в закрытое состояние комплекса Cas12a-crRNA неэффективен в вариантах BH, но полузакрытое состояние тройного комплекса может быть принято, даже если BH полностью удалена. Взятые вместе, эти идеи показывают, что BH является структурным элементом, который влияет на каталитическую активность и влияет на конформационные переходы FnCas12a.

ВВЕДЕНИЕ

Многие бактерии и почти все археи обладают адаптивной иммунной системой, называемой CRISPR-Cas (регулярно сгруппированные короткие палиндромные повторы — ассоциированные с CRISPR белки) как часть своего защитного репертуара против вирусов и мобильных генетических элементов (1–3). Иммунный ответ CRISPR-Cas делится на три стадии: (i) чужеродные нуклеиновые кислоты (протоспейсеры) интегрируются в качестве спейсеров между повторяющимися последовательностями в локус CRISPR во время начальной фазы адаптации (4–6).(ii) На стадии экспрессии и созревания локус CRISPR транскрибируется, и полученная предшественница CRISPR РНК (пре-crRNA) подвергается дальнейшей обработке с получением зрелой CRISPR-РНК (crRNA) (7). (iii) На заключительной стадии интерференции бинарный комплекс, состоящий из белка (ов) Cas и крРНК, связывает вторгающуюся ДНК или РНК с последовательностью, комплементарной к крРНК. В конечном итоге это приводит к инактивации целевой нуклеиновой кислоты, чаще всего в результате эндонуклеолитического расщепления целевой ДНК или РНК (1,8).

Одиночные эффекторные нуклеазы Cas9 и Cas12a привлекли широкое внимание как инструменты редактирования генома (9-13), потому что (i) Cas9, так же как и Cas12a, можно легко запрограммировать для нацеливания на конкретную последовательность ДНК с помощью дополнительных crRNA и (ii) одиночных эффекторных нуклеаз. действовать самостоятельно на этапе вмешательства. Cas12a (ранее Cpf1) — это РНК-управляемая ДНК-эндонуклеаза, классифицируемая как Cas-белок V-A класса 2 (3,14,15). Cas12a, в отличие от других Cas-систем, способен самостоятельно обрабатывать пре-crРНК (16).Запрограммированный с помощью crRNA, Cas12a распознает и связывает соседний мотив протоспейсера (PAM) в целевой ДНК с последовательностью 5′-TTTV-3 ‘(V = G / C / A) (17,18). Единственный активный сайт для расщепления ДНК находится в домене RuvC, который расщепляет нецелевую цепь (NTS) быстрее, чем цепь-мишень (TS), что приводит к последовательному разрезанию, тем самым создавая двухцепочечный разрыв со смещенными концами (8,19– 22). NTS дополнительно укорачивается из-за обрезки Cas12a. После расщепления Cas12a высвобождает PAM-дистальную часть целевой ДНК, но остается связанным с PAM-проксимальным продуктом (23,24).Это событие расщепления называется «цис-расщеплением» двухцепочечной ДНК (дцДНК). Однако Cas12a обладает также активностью транс-расщепления, которая активируется при расщеплении дцДНК. Здесь комплекс Cas12a-crRNA неспецифически связывается с одноцепочечной ДНК (оцДНК) и разрушает ее (25). Активность транс-расщепления Cas12a была перепрофилирована для создания количественных платформ для обнаружения нуклеиновых кислот (26–29).

Cas12a состоит из двухлепестковой структуры, образованной долей нуклеазы (Nuc) (несущей домены RuvC I, RuvC II, RuvC III, BH и Nuc) и долей узнавания (REC) (состоящей из доменов REC1 и REC2).Домен клина (WED I, WED II, WED III, PI (взаимодействие PAM)) действует как шарнир между двумя лепестками (рис. 1A) (2,17,30,31). На 5′-конце crRNA формирует структуру псевдоузла, которая закрепляется в домене WED и дополнительно формирует обширную сеть взаимодействий с доменами RuvC и REC2 (2,30–32). 3′-конец крРНК кодирует последовательность, комплементарную цепи-мишени, и взаимодействует с ДНК-мишенью, образуя таким образом R-петлю. Структурные исследования показали, что доли Nuc и REC претерпевают переход от закрытого к открытому при загрузке ДНК-мишени в комплексе crRNA-Cas12a (2,17).Мостовая спираль (BH) — это центральная спираль в белке, которая структурно связывает REC и долю Nuc. Для Cas12a из Acidaminococcus sp. (AsCas12a) было показано, что аминокислоты в BH взаимодействуют с сахарно-фосфатным остовом цепи ДНК-мишени и играют роль в гетеродуплексном распознавании crRNA и ДНК-мишени (31). Остаток триптофана на конце BH (W958 в AsCas12a, W971 в Cas12a из Francisella novicida (FnCas12a)) закреплен в гидрофобном кармане, образованном доменом REC2 (рис. 1B / C).Это взаимодействие стабилизирует закрытую и активную конформацию Cas12a (31,32). CrRNA имеет параллельную ориентацию с BH, а также соединяет Nuc и долю REC (Figure 1A). В этом контексте остается вопрос, влияет ли и как BH на каталитическую активность Cas12a и требуется ли целостность BH, а также закрепление в доле REC для обеспечения эффективной активности расщепления Cas12a. Более того, учитывая центральное положение BH, возникает вопрос, влияет ли BH на конформационные переходы фермента.

Рисунок 1.

Структурная организация Francisella novicida Cas12a (FnCas12a) и влияние мутаций мостиковой спирали на активность расщепления Cas12a. ( A ) Доменная организация и структура FnCas12a в комплексе с crRNA (оранжевый) и двухцепочечной целевой ДНК (черный) (PDB: 6I1K). Спираль моста (BH) выделена зеленым цветом. ( B ) Структура Cas12a с остатками I960 и W971, выделенными красным, и BH, показанными зеленым.( C ) Крупным планом — закрепление W971 на конце спирали мостика в гидрофобном кармане в домене REC2. ( D ) Анализ плазмидного расщепления с использованием вариантов BH Cas12a и Cas12a дикого типа с увеличивающимися концентрациями Cas12a (5 и 37,5 нМ), crРНК (5 и 37,5 нМ) и целевой ДНК при 5 нМ. Реакцию инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч. Линеаризованная плазмида целевой ДНК (7300 п.н.) расщепляется на два продукта (4400 и 2900 п.н.). M, 1 т.п.н. плюс лестница ДНК; — линеаризованная целевая ДНК без белка и crRNA.( E ) Количественная оценка эффективности расщепления для вариантов WT и Cas12a для реакций, содержащих 37,5 нМ белка и крРНК. Показано среднее значение, полосы ошибок показывают стандартное отклонение трех независимых анализов.

Рисунок 1.

Структурная организация Francisella novicida Cas12a (FnCas12a) и влияние мутаций мостиковой спирали на активность расщепления Cas12a. ( A ) Доменная организация и структура FnCas12a в комплексе с crRNA (оранжевый) и двухцепочечной целевой ДНК (черный) (PDB: 6I1K).Спираль моста (BH) выделена зеленым цветом. ( B ) Структура Cas12a с остатками I960 и W971, выделенными красным, и BH, показанными зеленым. ( C ) Крупным планом — закрепление W971 на конце спирали мостика в гидрофобном кармане в домене REC2. ( D ) Анализ плазмидного расщепления с использованием вариантов BH Cas12a и Cas12a дикого типа с увеличивающимися концентрациями Cas12a (5 и 37,5 нМ), crРНК (5 и 37,5 нМ) и целевой ДНК при 5 нМ. Реакцию инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч.Линеаризованная плазмида целевой ДНК (7300 п.н.) расщепляется на два продукта (4400 и 2900 п.н.). M, 1 т.п.н. плюс лестница ДНК; — линеаризованная целевая ДНК без белка и crRNA. ( E ) Количественная оценка эффективности расщепления для вариантов WT и Cas12a для реакций, содержащих 37,5 нМ белка и крРНК. Показано среднее значение, полосы ошибок показывают стандартное отклонение трех независимых анализов.

Здесь мы выполнили мутационный анализ BH и оценили активность расщепления и точность расщепления различных вариантов BH.Cas12a все еще каталитически активен, когда альфа-спиральная природа ЧД нарушена или предотвращено закрепление ЧД в доле REC. Однако мутации в BH влияют на активность обрезки и снижают толерантность к несоответствию Cas12a. Мы использовали измерения одномолекулярного резонансного переноса энергии Ферстера (smFRET) на диффундирующих молекулах, чтобы проследить конформационные переходы FnCas12a и вариантов BH во время их каталитического цикла с использованием сайт-специфически меченного Cas12a.Мы показываем, что Cas12a в апо-состоянии существует как в открытой, так и в закрытой конформации. Открытая конформация предпочтительна, если BH неточно закреплен в области REC. Тем не менее crRNA индуцирует закрытие фермента, даже если закрепление BH предотвращается или BH удаляется из фермента, скорее всего, потому что соседняя спираль 1 домена RuvC действует согласованно с BH и может гарантировать структурную целостность. Кроме того, мы демонстрируем, что crRNA (независимая от BH) играет важную роль в управлении конформационными переходами для достижения компетентного для расщепления состояния.Третья, полузакрытая конформация должна быть принята, чтобы позволить связывание целевой ДНК. Однако стабилизирующий эффект crRNA достаточен для перехода в полузакрытое состояние во всех вариантах BH. Взятые вместе, эти данные показывают, что BH является структурным элементом, который влияет на точность расщепления и активность обрезки, увеличивает специфичность Cas12a и позволяет ферменту апо принимать закрытое состояние, тем самым способствуя эффективной загрузке crRNA.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспрессия и очистка белка

Ген Cas12a из Francisella novicida был амплифицирован из плазмиды pFnCpf1_min (Addgene # 69975) (1) и клонирован в pGEX-2TK через сайты рестрикции BamHI и EcoRI.В результате была получена экспрессионная плазмида, которая кодировала последовательность Cas12a дикого типа с N-концевой GST-меткой и сайтом расщепления тромбином. Варианты Cas12a (E1006A (dCas12a), I960P, W971A, W971D, W971K, W971F, ΔY953-K969 (ΔBH), ΔY953-W971 (ΔΔBH)) были получены посредством сайт-направленного мутагенеза (дополнительная таблица S1). Экспрессию белка проводили в клетках Escherichia coli BL21 (DE3). Клетки выращивали при 37 ° C. При оптической плотности (600 нм) 0,4 клетки переносили на 18 ° C.Экспрессию белка индуцировали IPTG (1 мг / л) при OD ₆₀₀ = 0,6. Клетки дополнительно инкубировали при 18 ° C в течение ночи. После сбора клеток (10 мин, 6000 г, 4 ° C) их ресуспендировали в 20 мл буфера Tris-Cas-A (20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ , 5% (об. / об.) глицерин). Добавляли 3 мкл универсальной смеси нуклеаз (Pierce ™) и 1 таблетку коктейля ингибиторов протеазы cOmplete ™ (Roche), и клетки лизировали с помощью обработки ультразвуком. Лизат центрифугировали (1 час, 30 000 g, 4 ° C) и супернатант наносили на колонку для аффинной очистки GSTrap 5 мл FF (GE Healthcare) при 4 ° C, уравновешенную буфером Tris-Cas-A.После связывания белка колонку промывали промывочным буфером с высоким содержанием соли (буфер Tris-Cas-A, содержащий 1 M NaCl) и элюировали 100% буфером Tris-Cas-B (20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ , 5% (об. / Об.) Глицерина, 10 мМ глутатиона). Элюированный белок инкубировали в течение ночи с протеазой тромбина (100 Ед / мл, 50: 1 (об: об)) при 4 ° C, чтобы обеспечить расщепление GST-метки. GST-метку и протеазу тромбина удаляли с помощью аффинной хроматографии на гепарине (HiTrap Heparin 5 мл FF, GE Healthcare).Cas12a элюировали в градиенте элюирования 1 М NaCl (20 мМ Трис-HCl pH 7,5, 1 М NaCl, 5 мМ MgCl ₂ , 5% (об. / Об.) Глицерин). Cas12a обычно элюируется при концентрации NaCl 760 мМ. Концентрации белка рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции при 280 нм, равного 143 830 M ^-1 см ^-1 (инструмент ProtParam с сайта www.expasy.org). Аликвоты белка мгновенно замораживали и белок хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Сайт-специфическое включение неприродной аминокислоты

Для получения флуоресцентно меченых вариантов белка Cas12a для измерения FRET одной молекулы была использована стратегия Amber-супрессора для сайт-специфического включения неприродной аминокислоты para -азидо-1-фенилаланин (AzF) (33,34).Стоп-кодон Amber (TAG) вводили либо в плазмиду pGEX-2TK-Cas12a дикого типа, либо в плазмиды Cas12a, уже несущие мутации в BH, посредством сайт-направленного мутагенеза в положениях D470, K647 и / или T1222 (дополнительная таблица S1). . Плазмиды с янтарными кодонами в требуемых положениях экспрессировались в BL21 (DE3), который дополнительно содержал плазмиду pEVOL-pAzF (Addgene # 31186, (35)). Эта плазмида кодирует дополнительный индуцируемый арабинозой промотор, который регулирует экспрессию янтарной супрессорной тРНК (тРНК _CUA ) и биортогональной тРНК-синтетазы.Экспрессию и очистку белка проводили, как описано выше, со следующей модификацией: дополнительно к экспрессионной культуре добавляли 200 мг / л AzF при OD ₆₀₀ = 0,3 и l-арабинозу в конечной концентрации 20 мг / л при OD. ₆₀₀ = 0,4. Аликвоты очищенного белка быстро замораживали и хранили при -80 ° C.

Мечение белков с помощью неприродных аминокислот, включенных в Cas12a

Cas12a с AzF в положениях D470, K647 и / или T1222 были стохастически помечены с помощью лигирования Штаудингера-Бертоцци между трифенилфосфином (во флуорофорах DyLight) и азидным фрагментом в AzF (36).Очищенный белок инкубировали с конечной концентрацией 50 мкМ DyLight550 и DyLight650 в течение 90 мин при комнатной температуре в темноте. Реакцию мечения центрифугировали 10 мин при 21 000 g. Супернатант очищали с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Sephadex G-50 illustra NICK и периодического буфера Cas (50 мМ Tris – HCl pH 7,5, 200 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ , 2% (об. / Об.) Глицерин, 0,1% (об. / Об.) Tween20) для удаления избытка красителя. Меченый белок непосредственно использовали для измерения одиночных молекул.

Синтетические олигонуклеотиды

Олигодезоксирибонуклеотиды были приобретены у Eurofins-MWG (Ebersberg, Germany). Последовательность ДНК-мишени была получена из Swarts et al. (TS 5′-ACTCAATTTGACAGCCCACATGGCATTCCAC TTATCACTAAAGGCATCCTTCCACGT-3 ′, NTS 5′-ACGTGGAAGGATGCCTTTAGTGATAAGTGGAATGCCATGTG GGCTGTCAAAAT ′GAGT) (21). Для анализов расщепления целевая цепь несла метку Cy5, а нецелевая цепь — метку Cy3 либо на 5′-конце, либо на 3′-конце.Целевую и нецелевую нити отжигали инкубацией в буфере для отжига (конечная концентрация: 3 мМ HEPES pH 7,4, 10 мМ ацетат калия, 0,2 мМ ацетат магния) при 95 ° C в течение 3 минут и пассивном охлаждении до комнатной температуры.

crRNA (crRNA 5′-UAAUUUCUACUGUUGUAGAUGUGAUAAGUGGAAUGCCAUGUGGG-3 ‘, пре-crRNA 5’- GCUGAUUUAGGCAAAAACGGGUCUAAGAACUUUAUGACUGAUCCAUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUG (37)) были получены и очищены с использованием системы для крупномасштабной продукции РНК T7 RiboMAX ™ Express (Promega). Шаблоны ДНК (T7crRNA 5′-CCCACATGGCATTCCACTTATCACATCTACAACAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTATCGATC-3 ‘, T7pre-crRNA 5′-CCCACATGGCATTCCACTTATCACATCTACAACAGTAGAAATTATTTAAAGTTCTTAGACCCGT TTTTGCCTAAATCAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTATCGATC-3’) были приобретены у Eurofins-MWG (Эберсберг, Германия). Концентрацию определяли фотометрически, и РНК хранили при -20 ° C.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Бинарный комплекс, состоящий из 200 нМ белка Cas12a и 200 нМ крРНК, был предварительно сформирован в 1x Cas буфере (20 мМ Трис-HCl pH 7.5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl ₂ , 2% (об. / Об.) Глицерина, 1 мМ DTT, 0,05% (об. / Об.) Tween20) в течение 10 мин при комнатной температуре. 75 нМ бинарного комплекса добавляли к 10 нМ флуоресцентно меченой короткой целевой ДНК в общем объеме 10 мкл и инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Чтобы избежать неспецифического взаимодействия Cas12a с нуклеиновыми кислотами, добавляли гепарин с конечной концентрацией 32 мкг / мл и реакционную смесь инкубировали еще 10 мин при комнатной температуре. Краска для загрузки геля (конечная концентрация: 62.Добавляли 5 мМ Tris-HCl pH 6,8, 2,5% (мас. / Об.) Ficoll400) и образцы разделяли неденатурирующим электрофорезом в трис-глициновом геле (6% PAA, 230 В, 30 мин). Гель визуализировали с помощью системы визуализации ChemiDoc (Bio-Rad).

Анализ плазмидного расщепления

Для проведения анализов плазмидного расщепления бинарный комплекс, состоящий из Cas12a и crRNA, был предварительно сформирован путем инкубации 100 нМ белка и 100 нМ crRNA в течение 10 мин при комнатной температуре в буфере 1 × Cas (20 мМ Tris – HCl pH 7.5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl ₂ , 2% (об. / Об.) Глицерина, 1 мМ DTT, 0,05% (об. / Об.) Tween20). 5 или 37,5 нМ предварительно инкубированных бинарных комплексов добавляли к 5 нМ целевой ДНК (плазмида eGFP-hAgo2 (Addgene # 21981), линеаризованная с помощью SmaI). Реакцию инкубировали в буфере 1 × Cas в общем объеме 15 мкл в течение 1 ч при 37 ° C. Реакцию останавливали 0,36 ед. Протеиназы К. После инкубации в течение 30 мин при 55 ° C реакционную смесь смешивали с загрузочным красителем и наносили на 0,8% агарозный гель 1 × TAE (100 В, 30 мин).

Чтобы проследить кинетику расщепления, 25 нМ бинарного комплекса добавляли к 5 нМ целевой ДНК и инкубировали при 28 ° C. Через 15 с, 30 с, 1 мин, 2 мин, 3 мин, 4 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час и 2 часа реакцию останавливали с помощью ЭДТА (конечная концентрация 83,3 мМ). и 0,36 ед. протеиназы К. После инкубации в течение 30 мин при 55 ° C реакционную смесь смешивали с загрузочным красителем и наносили на 0,8% агарозный гель 1 × TAE (100 В, 30 мин).

Анализ расщепления короткой ДНК-мишени

Бинарный комплекс из 200 нМ белка Cas12a и 200 нМ крРНК был предварительно сформирован в буфере 1 × Cas в течение 10 мин при комнатной температуре.В конечной концентрации 75 нМ бинарный комплекс добавляли к 10 нМ флуоресцентно меченой двухцепочечной короткой целевой ДНК в общем объеме 10 мкл и инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Реакцию останавливали добавлением 0,36 ед. Протеиназы К и инкубировали при 55 ° C в течение 30 мин. Добавляли загрузочный краситель (конечная концентрация: 47,5% (об. / Об.) Формамида, 0,01% (мас. / Об.) SDS, 0,01% (мас. / Об.) Бромфенолового синего, 0,005% (мас. / Об.) Ксиленцианола, 0,5 мМ ЭДТА). и образцы разделяли на предварительно нагретом геле 15% PAA, 6 M мочевины, 1 × TBE (300 В, 30 мин).Флуоресцентные сигналы визуализировали с помощью системы визуализации ChemiDoc (Bio-Rad).

Чтобы проследить кинетику расщепления, реакции останавливали через 1 с, 30 с, 1 мин, 3 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин, 45 мин и 60 мин с EDTA (конечная концентрация 125 мМ) и 0,36 ед. протеиназы К. Дальнейшие шаги проводили в соответствии с анализом расщепления, как описано выше.

Реакции расщепления для геля для секвенирования высокого разрешения (15% PAA, 6 M мочевина, 1 × TBE) проводили с 375 нМ бинарного комплекса и 50 нМ флуоресцентно меченой ДНК-мишени.Через 1 ч при 37 ° C реакцию останавливали добавлением 0,36 ед. Протеиназы K и инкубировали при 55 ° C в течение 30 мин. Добавляли загрузочный краситель (конечная концентрация: 47,5% (об. / Об.) Формамида, 0,01% (мас. / Об.) SDS, 0,01% (мас. / Об.) Бромфенолового синего, 0,005% (мас. / Об.) Ксиленцианола, 0,5 мМ ЭДТА). и образцы разделяли на предварительно нагретом геле для секвенирования (45 ° C, 65 Вт, 1 час). Сигналы флуоресценции визуализировали с помощью системы визуализации ChemiDoc (Bio-Rad).

Кривые плавления Protein Thermal Shift ™

Кривые плавления вариантов Cas12a были построены с использованием набора Protein Thermal Shift ™ (ThermoFisher) с использованием циклера для qPCR Rotor-Gene Q от Qiagen и программного обеспечения HRM (High Resolution Melt).Белки разбавляли водой и измерения проводили в четырех повторностях. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Origin (ADDITIVE Friedrichsdorf, Германия).

Конфокальные измерения FRET одиночных молекул

Камеры для образцов для конфокальных измерений (CELLview Slide, Greiner Bio-One) были пассивированы пассивирующим раствором (2 мг / мл BSA в PBS) в течение 10 минут, а затем промыты буфером 1 × Cas (20 мМ Tris – HCl pH 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl ₂ , 2% (об. / Об.) Глицерин, 1 мМ DTT, 0.05% (об. / Об.) Твин 20). Меченый апо-белок Cas12a разбавляли до пикомолярных концентраций в буфере 1 × Cas и переносили в камеру для образцов. Бинарный комплекс, состоящий из белка Cas12a с crРНК (конечная концентрация 0,5 нМ, 1 нМ, 2 нМ или 4 нМ), предварительно инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в небольшом объеме 20 мкл и перед измерением разбавляли фактор 10 с буфером Cas, чтобы получить конечный объем 200 мкл. Для тройных комплексов бинарный комплекс, состоящий из Cas12a с crRNA (конечная концентрация 1 нМ), предварительно инкубировали в течение 10 минут перед добавлением двухцепочечной или одноцепочечной целевой ДНК (конечная концентрация 1, 2 или 4 нМ) и инкубируют в объеме 20 мкл в течение 20 мин.Образец разбавляли в 10 раз буфером 1 × Cas, чтобы получить конечный объем 200 мкл. Одномолекулярные FRET-измерения свободно диффундирующих молекул проводили в течение 30 мин.

Измерения одиночных молекул проводились на конфокальном микроскопе MicroTime 200 (PicoQuant) с импульсными лазерными диодами (532 нм: LDH-P-FA-530B; 636 нм: LDH-DC-640; PicoQuant / clean-up filter: ZET 635; Цветность). Возбуждение флуорофоров осуществлялось с помощью импульсного перемежающегося возбуждения (PIE) с интенсивностью лазера 20 мкВт.Для сбора испускаемой флуоресценции использовали объектив микроскопа 1,2 NA, x60 (UplanSApo × 60 / 1,2 Вт; Olympus) и конфокальное отверстие 50 мкм. Донорную и акцепторную флуоресценцию разделяли дихроичным зеркалом (T635lpxr; Chroma) и полосовыми фильтрами (донор: ff01-582 / 64; Chroma; акцептор: H690 / 70; Chroma). Отдельный APD (SPCM-AQRH-14-TR, Excelitas Technologies) для каждого потока фотонов обнаруживал отдельные потоки фотонов, которые впоследствии анализировались модулем PicoQuant HydraHarp 400 с поддержкой TCSPC.

Анализ данных

Конфокальные данные smFRET диффундирующих молекул анализировали с помощью пакета программ PAM (38). Фотонные всплески извлекались с помощью поиска по всем фотонным всплескам (APBS, параметры: L = 100, M = 15, T = 500 мкс) и двухканального поиска всплесков (DCBS, параметры: L ). = 100, M _{GG + GR} = 15, M _RR = 15, T = 500 мкс) (39). Полученные пакетные данные были скорректированы на утечку донора и прямое возбуждение акцептора, определенные из данных APBS (40).Коэффициенты β и γ определялись путем внутренней подгонки различных популяций FRET в ES-гистограммах, полученных с помощью алгоритма DCBS. Скорректированные данные DCBS были разделены на интервалы (размер интервала = 0,032), и среднее значение трех измерений нанесено на график в виде E-гистограммы. Гистограммы были подогнаны к одному, двум или трем гауссовским аппроксимациям с использованием программного обеспечения Origin. Гистограммы эффективности FRET со стандартными отклонениями трех повторов показаны на дополнительном рисунке S18.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мутации в мостиковой спирали Cas12a изменяют активность обрезки и скорость расщепления

Чтобы пролить свет на функцию и важность мостовой спирали (BH), серия мутаций была введена в FnCas12a (Figure 1B).Вариант I960P был создан с целью нарушить α-спиральную природу ЧД. Триптофан в положении 971 размещается в гидрофобном кармане домена REC2 (31,32) (рис. 1C). Этот остаток был мутирован в ряд аминокислот с различными химическими свойствами (W971A, W971D, W971K, W971F), например аминокислот, которые различаются по размеру и заряду, чтобы исследовать, важно ли закрепление мостиковой спирали для структурной целостности и каталитической функции Cas12a.Кроме того, мы создали вариант, в котором BH удалена (ΔBH, ΔY953-K969, делеция 17 аминокислот). Все варианты могут быть очищены до гомогенности (дополнительная фигура S1) и показали сопоставимую стабильность, как было оценено с помощью анализа теплового сдвига (дополнительная фигура S2).

Активность Cas12a дикого типа (WT) и вариантов BH анализировали в анализах плазмидного расщепления с использованием линеаризованной плазмидной ДНК в качестве мишени (фигура 1D, дополнительная фигура S3). Добавление Cas12a дикого типа привело к ожидаемому образованию двух продуктов расщепления (рис. 1D).Все варианты BH были каталитически активными, но демонстрировали четкие различия в эффективности расщепления. Вариант ΔBH был наименее активным мутантом: только 15% целевой ДНК было расщеплено по сравнению с 91%, расщепленным ферментом WT через 60 минут (рис. 1E). EMSA выявило, что у варианта ΔBH не нарушено связывание ДНК (дополнительный рисунок S4), что позволяет предположить, что снижение активности расщепления вызвано исключительно каталитическим дефектом вариантов. Варианты W971A и W971F не нарушают свою активность.Вариант I960P был лишь незначительно менее активен, чем WT. Варианты W971D и W971K оставались активными и показали ~ 77% активности дикого типа. Подробное исследование кинетики реакции было выполнено при 28 ° C, чтобы можно было проследить реакцию с хорошим временным разрешением (дополнительный рисунок S3). Здесь продукты расщепления для фермента WT появлялись уже через 2 мин. Варианты W971K, W971D, а также I960P расщепляли ДНК значительно медленнее, чем WT. Интересно, что вариант W971F расщепляет мишень немного быстрее, чем дикий тип, при этом 80% субстрата расщепляется (WT: 45%) через 2 часа инкубации.ΔBH не был каталитически активен в этих условиях.

Чтобы оценить паттерн расщепления, созданный вариантами BH, мы использовали анализ расщепления, разработанный Swarts et al. на основе коротких цепей-мишеней, меченных флуоресцентной меткой (58 нуклеотидов, рис. 2А) (21). Чтобы отслеживать реакцию расщепления на обеих цепях одновременно, метка Cy3 и Cy5 была прикреплена к 5′-концу нецелевой цепи (NTS) и целевой цепи (TS), соответственно. Продукты расщепления разделяли на денатурирующем геле для секвенирования для анализа продуктов расщепления с разрешением в один нуклеотид (Рисунок 2B, дополнительные рисунки S5 и S6).В случае фермента WT виден преобладающий продукт расщепления и обнаруживаются два второстепенных продукта с одним и двумя дополнительными нуклеотидами. Напротив, варианты показывают в основном более длинные продукты расщепления (до 5 нуклеотидов дольше, чем основной продукт, продуцируемый WT). Только варианты W971A и W971F давали такие короткие изделия, как WT. Примечательно, что это не основной продукт из этих вариантов. Кинетические исследования с использованием фермента WT (дополнительный рисунок S5C, E) показали, что WT также продуцирует более длинные продукты расщепления NTS в начале реакции.Со временем длинные продукты расщепления укорачиваются, давая основной продукт. Это результат деятельности по обрезке, которая укорачивает NTS до 4 н. (19). После расщепления целевой ДНК дистальная часть PAM ДНК высвобождается, но Cas12a остается связанным с проксимальной частью PAM (24) (здесь помечен Cy3 на NTS). Пока все еще привязан, Cas12a еще больше укорачивает NTS с помощью операции обрезки. Обрезка NTS также наблюдалась для вариантов W971A и W971F, давая два или три основных продукта расщепления, включая конечный продукт расщепления, наблюдаемый для WT (дополнительная фигура S6).Однако обрезка NTS мутировавшими ферментами менее эффективна, поскольку конечный продукт не является доминирующим продуктом даже после продолжительного времени реакции. Напротив, все другие варианты никогда не давали конечного продукта расщепления фермента WT. Это говорит о том, что варианты I960P, W971D, W971K и ΔBH полностью лишены тримминга. Картина расщепления для TS одинакова для всех вариантов Cas12a и показывает один основной продукт расщепления и два дополнительных продукта на 1 нуклеотид длиннее и на 1 нуклеотид короче, чем основной продукт.Наши данные согласуются с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось о неточном расщеплении TS с помощью AsCas12a и FnCas12a (19,20).

Рисунок 2. Анализ расщепления ДНК

сообщает о точности расщепления и активности обрезки вариантов Cas12a. Анализ расщепления вариантов мостиковой спирали Cas12a и Cas12a WT с использованием 7,5-кратного избытка белка и крРНК (375 нМ) относительно целевой ДНК (50 нМ). Реакцию инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч. Короткая целевая ДНК (58 нуклеотидов) дважды помечена меткой Cy3 (зеленая) на нецелевой цепи (NTS) и меткой Cy5 (красная) на целевой цепи (TS).( A ) Метки Cy3 (зеленая сфера) и Cy5 (красная сфера) прикреплены к 5′-концу цепей ДНК. ( B ) Расщепленный NTS показывает различную картину расщепления для различных вариантов Cas12a. Картина расщепления TS одинакова для всех вариантов Cas12a. ( C ) Метки Cy3 (зеленая сфера) и Cy5 (красная сфера) расположены на 3′-конце цепей ДНК. ( D ) Паттерны расщепления целевой и нецелевой цепей одинаковы для всех вариантов Cas12a. Образцы анализировали на денатурирующем 15% геле PAA высокого разрешения.

Рисунок 2. Анализ расщепления ДНК

сообщает о точности расщепления и активности обрезки вариантов Cas12a. Анализ расщепления вариантов мостиковой спирали Cas12a и Cas12a WT с использованием 7,5-кратного избытка белка и крРНК (375 нМ) относительно целевой ДНК (50 нМ). Реакцию инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч. Короткая целевая ДНК (58 нуклеотидов) дважды помечена меткой Cy3 (зеленая) на нецелевой цепи (NTS) и меткой Cy5 (красная) на целевой цепи (TS). ( A ) Метки Cy3 (зеленая сфера) и Cy5 (красная сфера) прикреплены к 5′-концу цепей ДНК.( B ) Расщепленный NTS показывает различную картину расщепления для различных вариантов Cas12a. Картина расщепления TS одинакова для всех вариантов Cas12a. ( C ) Метки Cy3 (зеленая сфера) и Cy5 (красная сфера) расположены на 3′-конце цепей ДНК. ( D ) Паттерны расщепления целевой и нецелевой цепей одинаковы для всех вариантов Cas12a. Образцы анализировали на денатурирующем 15% геле PAA высокого разрешения.

Та же самая конструкция ДНК-мишени, несущая флуоресцентные метки на 3′-концах, была использована для анализа картины расщепления на PAM-проксимальной части (рис. 2C, D).Мы обнаружили сопоставимую картину расщепления для всех вариантов Cas12a (рис. 2В). 3′-меченый TS обрабатывается, давая три продукта, как уже наблюдалось для 5′-меченного варианта ДНК. Кинетический анализ показывает, что обрезка не происходит в PAM-дистальной части TS (дополнительный рисунок S5D, F). В соответствии с данными Swarts et al. , мы обнаружили два продукта расщепления для NTS, которые одновременно появляются после очень короткого времени расщепления (2). Это указывает на начальное неточное расщепление в двух разных положениях до того, как происходит обрезка проксимальной части PAM (19).Эти два начальных сайта расщепления были обнаружены для всех вариантов мостиковой спирали Cas12a (рис. 2D).

Взятые вместе, мутации BH сдвигают положение конечного расщепления Cas12a на NTS в сторону 3′-конца цепи ДНК, и BH критически участвует в тримминговой активности Cas12a.

Варианты спирали моста Cas12a с повышенной чувствительностью к несовпадениям

вариантов BH SpyCas9 более или менее чувствительны к несоответствию между crRNA и целевой ДНК (41,42).Мы проверили, влияют ли несовпадения на специфичность расщепления WT FnCas12a и вариантов BH в дополнительном наборе анализов расщепления. С этой целью мы использовали субстраты, которые несли одно несоответствие в позиции 2 (MM 2, несоответствие в затравочной области), 10 (MM 10) или 20 (MM 20) R-петли (рис. 3A). WT FnCas12a показал умеренную чувствительность к субстратам, которые несли несовпадение в положении 2 или 10, но субстрат MM 20 расщеплялся так же хорошо, как и полностью комплементарный субстрат (MM 0). Несоответствие в положении 2 привело к снижению эффективности расщепления для дикого типа и в аналогичной степени для всех вариантов BH FnCas12a (фиг. 3 B, C).Исключением является вариант W971F, который был значительно менее активен при использовании субстрата MM 2 по сравнению с диким типом, тогда как этот мутант был столь же активен, как WT при использовании субстрата MM 0. Все варианты BH были очень чувствительны к несовпадению в положении 10. Кроме того, варианты BH W971D и W971K действительно дискриминировали субстрат с несовпадением в положении 20. Примечательно, что в случае вариантов FnCas12a относительное снижение эффективности расщепления было более выраженным, когда использование несовпадающих субстратов по сравнению с полностью комплементарными субстратами (например,грамм. Снижение W971D до 50% от уровня WT в случае MM 0 по сравнению с 3,6% в случае MM 10). Взятые вместе, эти данные показывают, что целевая избирательность FnCas12a модулируется ЧД.

Рисунок 3.

Специфичность расщепления ДНК вариантов Cas12a на несовпадающих субстратах. ( A ) Короткая целевая ДНК (58 нуклеотидов) дважды помечена меткой Cy3 (зеленая) на нецелевой цепи (NTS) и меткой Cy5 (красная) на целевой цепи (TS). В дополнение к полностью комплементарному субстрату (MM 0) использовали субстраты, которые несут одно несовпадение в положении 2 (MM 2), 10 (MM 10) или 20 (MM 20).( B ) Анализ расщепления вариантов мостиковой спирали Cas12a и Cas12a дикого типа с использованием 7,5-кратного избытка белка и крРНК (75 нМ) относительно целевой ДНК (10 нМ). Реакцию инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч. ( C ) Количественная оценка эффективности расщепления NTS для вариантов WT и Cas12a с использованием полностью комплементарных и несовпадающих субстратов. Показано среднее значение, полосы ошибок показывают стандартное отклонение трех независимых анализов. В то время как субстрат, несовпадающий в положении 10, все еще расщепляется WT Cas12a, варианты BH не расщепляют этот субстрат.Варианты BH W971D / K дополнительно не расщепляют субстрат с несовпадением в положении 20.

Рисунок 3.

Специфичность расщепления ДНК вариантов Cas12a на несовпадающих субстратах. ( A ) Короткая целевая ДНК (58 нуклеотидов) дважды помечена меткой Cy3 (зеленая) на нецелевой цепи (NTS) и меткой Cy5 (красная) на целевой цепи (TS). В дополнение к полностью комплементарному субстрату (MM 0) использовали субстраты, которые несут одно несовпадение в положении 2 (MM 2), 10 (MM 10) или 20 (MM 20).( B ) Анализ расщепления вариантов мостиковой спирали Cas12a и Cas12a дикого типа с использованием 7,5-кратного избытка белка и крРНК (75 нМ) относительно целевой ДНК (10 нМ). Реакцию инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч. ( C ) Количественная оценка эффективности расщепления NTS для вариантов WT и Cas12a с использованием полностью комплементарных и несовпадающих субстратов. Показано среднее значение, полосы ошибок показывают стандартное отклонение трех независимых анализов. В то время как субстрат, несовпадающий в положении 10, все еще расщепляется WT Cas12a, варианты BH не расщепляют этот субстрат.Варианты BH W971D / K дополнительно не расщепляют субстрат с несовпадением в положении 20.

Cas12a принимает три конформационных состояния в течение своего цикла активности

Для Cas12a доступен ряд рентгеновских и крио-ЭМ структур, которые демонстрируют архитектуру бинарных и тройных комплексов Cas12a (2,17,20,21,30–32,43–48) и выясняют, что переход от бинарный комплекс в тройной сопровождается структурной перестройкой фермента из закрытого в более открытое состояние (дополнительный рисунок S7).Однако структурная информация не доступна для фермента апо Cas12a и для комплекса pre-crRNA-Cas12a в отсутствие ДНК-мишени. Чтобы проследить конформационные переходы Cas12a и оценить, влияют ли мутации BH на конформацию Cas12a, мы выполнили измерения smFRET на диффундирующих молекулах. Чтобы определить относительные внутримолекулярные расстояния в WT Cas12a, мы сайт-специфически включили неприродную аминокислоту пара- -азидо-1-фенилаланин (AzF) с помощью стратегии янтарного супрессора (33,34).Мы поместили метку в домен WED (K647AzF), Nuc (T1222AzF) или долю REC (D470AzF), получив следующие варианты: Cas12a ^{K647AzF / T1222AzF} (обозначенный Cas12a ^WED-Nuc ), Cas412AzF (упоминается Cas12a ^WED-REC ) и Cas12a ^{D470AzF / T1222AzF} (упоминается Cas12a ^REC-Nuc ) (дополнительный рисунок S7). Связывание флуоресцентных красителей DyLight550 и DyLight650 с азидной группой AzF осуществляли с помощью лигирования Штаудингера-Бертоцци (36) (дополнительный рисунок S8).Мы использовали подход стохастической маркировки, который дает белки, которые несут пару донорных и акцепторных красителей, или белки, которые несут только донор или акцептор. Молекулы Cas12a, несущие донорно-акцепторную пару, можно спектроскопически отсортировать на основе схемы возбуждения (PIE) (49) с отдельными каналами детектирования для излучения донора и акцептора. Кристаллические структуры показывают следующие расстояния между выбранными остатками в бинарном и тройном комплексе, соответственно: положения K647 и T1222: 78,1 и 79.8 Å, D470 и K647: 98,0 и 104,4 Å, а D470 и T1222 30,8 и 36,0 Å (2,21) (дополнительный рисунок S7). EMSA и анализы активности продемонстрировали, что все варианты были способны связывать нуклеиновые кислоты и расщеплять целевую ДНК (дополнительные рисунки S4 и S9).

Во-первых, мы использовали варианты Cas12a ^WED-Nuc и Cas12a ^WED-REC , чтобы проследить конформационные изменения Cas12a вдоль оси долей WED-Nuc и оси долей WED-REC, соответственно. С этой целью мы провели измерения smFRET с использованием (i) фермента апо, (ii) бинарного комплекса, состоящего из Cas12a плюс пре-crРНК, (iii) бинарного комплекса, состоящего из Cas12a плюс зрелая crРНК, (iv) тройного комплекса ( Cas12a + зрелая крРНК + дцДНК-мишень) и (v) тройной комплекс, нагруженный одноцепочечной мишенью.Варианты Cas12a ^WED-REC и Cas12a ^WED-Nuc показали единственную популяцию с низким FRET для фермента апо, бинарного и обоих вариантов тройного комплекса, соответственно (фиг. 4B). Это указывает на то, что расстояние между доменом WED и Nuc и доменом WED и долей REC существенно не изменяется, когда Cas12a прогрессирует в течение своего цикла активности. Это согласуется со структурными исследованиями (2,21) и моделированием молекулярной динамики (50), в которых могут быть обнаружены только незначительные изменения расстояний между этими положениями (дополнительный рисунок S7).Используя вариант Cas12a ^Nuc-REC , для Cas12a, не содержащего нуклеиновых кислот, можно определить низкую популяцию FRET с эффективностью FRET 0,12 (± 0,04) и высокую популяцию FRET ( E = 0,97 ± 0,01). Это указывает на то, что апо-форма может принимать закрытую и открытую конформацию, при этом большинство молекул (68 ± 7%) находятся в закрытом состоянии. Добавление крРНК к белку сдвигает молекулы к популяции с высоким FRET (84 ± 2%). Этот эффект заметен после добавления зрелой crRNA, но также и при добавлении pre-crRNA (дополнительная фигура S10A).Анализы расщепления с использованием образцов, которые содержали пре-crRNA или зрелую crRNA (дополнительная фигура S10C, D), дали сравнимые эффективности расщепления. Это демонстрирует, что пре-crRNA процессируется Cas12a, поскольку только зрелая crRNA допускает загрузку и расщепление дцДНК (16). Несмотря на то, что мы не можем исключить, что пре-crRNA частично обрабатывается во время инкубации и измерения одной молекулы, данные тем не менее показывают, что комплекс pre-crRNA / Cas12a не вызывает дополнительной популяции FRET и, следовательно, может Можно предположить, что комплекс pre-crRNA / Cas12a не принимает отчетливую конформацию.Это согласуется со структурными данными (2,21). Примечательно, что образование бинарного комплекса зависит от концентрации crRNA, добавленной к Cas12a, что подчеркивает наблюдение, что высокая популяция FRET отражает бинарный комплекс (дополнительный рисунок S11A). Таким образом, связывание crРНК вызывает закрытие белка, отражающее закрытое состояние Cas12a (2) (дополнительный рисунок S7). После загрузки ДНК появляется третья популяция с эффективностью FRET 0,82 (± 0,02). Это указывает на то, что белок повторно открывается, тем самым обеспечивая достаточно места для связывания целевой ДНК.Относительное количество молекул в средней популяции FRET увеличивалось, в то время как количество молекул, которые принимают состояние высокого FRET, уменьшалось с увеличением концентрации целевой ДНК, указывая на то, что загрузка ДНК запускает появление средней популяции FRET (дополнительный рисунок S11B). Измерения также проводились с каталитически неактивным вариантом Cas12a (dCas12a, дополнительный рисунок S12). Здесь были получены очень сопоставимые данные. Это демонстрирует, что средняя популяция FRET соответствует тройному комплексу со связанной целевой ДНК и что конформации тройного комплекса до расщепления (dCas12a) и после расщепления (WT Cas12a) целевой ДНК существенно не различаются.Интересно, что загрузка является только умеренно эффективной, и ~ 30-50% белков, загруженных crRNA, остаются в закрытом состоянии FRET (дополнительный рисунок S11B). Кроме того, мы исследовали тройной комплекс, в котором отсутствует NTS. Cas12a может обрабатывать TS даже в отсутствие NTS (рисунок 4, дополнительный рисунок S13) (20). Если исключить NTS, популяция с высоким FRET снижается до 9% (в присутствии NTS: 40%), а средняя популяция FRET увеличивается до 60%, что указывает на то, что загрузка стерически менее требовательного одноцепочечного TS очень эффективна, обеспечивая успешный переход. от двоичного до тройного комплекса.Эффективность FRET средней популяции FRET, однако, существенно не меняется, что позволяет предположить, что нагрузки TS достаточно, чтобы вызвать раскрытие расщелины ДНК. Взятые вместе, мы показываем, что измерения smFRET повторно капитулируют структурные данные бинарного комплекса (закрытое состояние) и открывающее движение Cas12a при загрузке целевой ДНК (полузакрытое состояние). Одноцепочечный TS достаточен и более эффективен, чтобы вызвать переход в полузамкнутое состояние. Более того, мы можем оценить структурное состояние фермента апо и показать, что апо Cas12a может принимать открытую и закрытую конформацию.

Рис. 4.

Измерения Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) выявляют конформационные состояния Cas12a. Измерения FRET одной молекулы с использованием дважды меченых вариантов Cas12a проводили на свободно диффундирующих молекулах. ( A ) Схематическая модель Cas12a, показывающая положения метки в D470 (домен REC), K647 (домен WED) и T1222 (домен Nuc). ( B ) Распределение эффективности FRET для апо-фермента Cas12a, Cas12a с пре-crРНК (1 нМ), бинарного комплекса (1 нМ crRNA), тройного комплекса (1 нМ crRNA, 1 нМ целевой ДНК) и тройной комплекс без NTS (1 нМ крРНК, 1 нМ TS ДНК).Cas12a ^{WED-Nuc * DL550 / DL650} и Cas12a ^{WED-REC * DL550 / DL650} отображают одну единственную популяцию FRET для состояния, связанного с апо, РНК и РНК и ДНК, с эффективностью FRET 0,15 ± 0,01 и 0,13 ± 0,02 соответственно. Cas12a ^{REC-Nuc * DL550 / DL650} показывает две популяции FRET для апо-комплекса и связанного с РНК состояния на E ₁ = 0,12 ± 0,04 и 0,09 ± 0,01 и E ₂ = 0,97 ± 0,01 или 0,96 ± 0,01. с высокой популяцией FRET, увеличивающейся с добавлением РНК.В тройном комплексе Cas12a ^{REC-Nuc * DL550 / DL650} показывает три популяции FRET с дополнительной популяцией с эффективностью FRET 0,82 ± 0,02. Гистограммы показывают данные трех независимых измерений. Гистограммы были подогнаны к простой, двойной или тройной функции Гаусса, а средняя эффективность FRET (E) и процентное распределение популяций (A) даны со стандартными ошибками в гистограммах. Измерения были выполнены в трех экземплярах (см. Также дополнительный рисунок S18A).

Рис. 4.

Измерения Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) выявляют конформационные состояния Cas12a. Измерения FRET одной молекулы с использованием дважды меченых вариантов Cas12a проводили на свободно диффундирующих молекулах. ( A ) Схематическая модель Cas12a, показывающая положения метки в D470 (домен REC), K647 (домен WED) и T1222 (домен Nuc). ( B ) Распределение эффективности FRET для апо-фермента Cas12a, Cas12a с пре-crРНК (1 нМ), бинарного комплекса (1 нМ crRNA), тройного комплекса (1 нМ crRNA, 1 нМ целевой ДНК) и тройной комплекс без NTS (1 нМ крРНК, 1 нМ TS ДНК).Cas12a ^{WED-Nuc * DL550 / DL650} и Cas12a ^{WED-REC * DL550 / DL650} отображают одну единственную популяцию FRET для состояния, связанного с апо, РНК и РНК и ДНК, с эффективностью FRET 0,15 ± 0,01 и 0,13 ± 0,02 соответственно. Cas12a ^{REC-Nuc * DL550 / DL650} показывает две популяции FRET для апо-комплекса и связанного с РНК состояния на E ₁ = 0,12 ± 0,04 и 0,09 ± 0,01 и E ₂ = 0,97 ± 0,01 или 0,96 ± 0,01. с высокой популяцией FRET, увеличивающейся с добавлением РНК.В тройном комплексе Cas12a ^{REC-Nuc * DL550 / DL650} показывает три популяции FRET с дополнительной популяцией с эффективностью FRET 0,82 ± 0,02. Гистограммы показывают данные трех независимых измерений. Гистограммы были подогнаны к простой, двойной или тройной функции Гаусса, а средняя эффективность FRET (E) и процентное распределение популяций (A) даны со стандартными ошибками в гистограммах. Измерения были выполнены в трех экземплярах (см. Также дополнительный рисунок S18A).

Неповрежденная ЧД необходима для эффективного образования бинарных комплексов

Имея возможность проследить открытие и закрытие белка с помощью варианта Cas12a ^Nuc-REC , мы дополнительно опросили все варианты BH, чтобы понять, участвует ли BH в стабилизации конформационных состояний Cas12a (Рисунок 5 и дополнительный рисунок). S18B). Для всех вариантов BH были обнаружены популяции с низким, средним и высоким FRET. Однако наблюдались различия в относительном распределении этих состояний.В состоянии апо все варианты W971 демонстрировали сдвиг в сторону популяции с низким FRET, предполагая, что дестабилизация или модуляция закрепления BH в доле REC увеличивает вероятность перехода в открытое состояние. Интересно, что в случае варианта ΔBH эффективность FRET соответствующих популяций не изменилась, и состояния с высоким и низким FRET были заселены почти одинаково. Поскольку остаток W971 все еще присутствует в этом варианте, мы предположили, что этого может быть достаточно для поддержания открытого и закрытого состояния.Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали так называемую ΔΔBH, в которой не только остатки 953–969 BH, но, кроме того, были удалены остатки 970/971, что привело к варианту Cas12a, полностью лишенному BH. Здесь относительное распределение состояний FRET и эффективности FRET существенно не изменились (дополнительный рисунок S14). Для всех вариантов Cas12a не наблюдалось динамического переключения между открытым и закрытым состояниями в миллисекундной шкале времени, которую мы фиксируем с помощью наших измерений.В то время как сдвиг в сторону популяции с низким FRET наблюдался для вариантов W971, определенные структурные состояния, представленные популяцией с низким и высоким FRET, все еще могут быть приняты вариантами с делецией BH. Поэтому мы предполагаем, что ЧД не является основным структурным элементом, определяющим открытое и закрытое состояние Cas12a.

Рис. 5.

Измерения Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) выявляют конформационные состояния вариантов мостиковой спирали Cas12a.Измерения FRET одной молекулы на свободно диффундирующих молекулах были выполнены с использованием дважды меченого варианта Cas12a ^{REC-Nuc * DL550 / DL650} , который несет дополнительные мутации в мостиковой спирали. Показаны распределения эффективности FRET для фермента апо, бинарного комплекса (1 нМ крРНК) и тройного комплекса (1 нМ крРНК, 1 нМ целевой ДНК). Гистограммы апо демонстрируют две популяции FRET, соответствующие открытому и закрытому состоянию Cas12a, соответственно. Добавление crRNA приводит к увеличению популяции с высоким FRET в бинарном комплексе.Добавление крРНК и целевой ДНК дает третью популяцию (полузакрытая конформация). Гистограммы были аппроксимированы двойной или тройной функцией Гаусса, а усредненные средние значения эффективности FRET (E) и процентное распределение популяций (A) даны с помощью SE на гистограммах. Измерения были выполнены в трех экземплярах (см. Также дополнительный рисунок S18B). Эффективности FRET для отдельных вариантов белка перечислены в дополнительной таблице S2.

Рис. 5.

Измерения Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) выявляют конформационные состояния вариантов мостиковой спирали Cas12a.Измерения FRET одной молекулы на свободно диффундирующих молекулах были выполнены с использованием дважды меченого варианта Cas12a ^{REC-Nuc * DL550 / DL650} , который несет дополнительные мутации в мостиковой спирали. Показаны распределения эффективности FRET для фермента апо, бинарного комплекса (1 нМ крРНК) и тройного комплекса (1 нМ крРНК, 1 нМ целевой ДНК). Гистограммы апо демонстрируют две популяции FRET, соответствующие открытому и закрытому состоянию Cas12a, соответственно. Добавление crRNA приводит к увеличению популяции с высоким FRET в бинарном комплексе.Добавление крРНК и целевой ДНК дает третью популяцию (полузакрытая конформация). Гистограммы были аппроксимированы двойной или тройной функцией Гаусса, а усредненные средние значения эффективности FRET (E) и процентное распределение популяций (A) даны с помощью SE на гистограммах. Измерения были выполнены в трех экземплярах (см. Также дополнительный рисунок S18B). Эффективности FRET для отдельных вариантов белка перечислены в дополнительной таблице S2.

Все варианты принимают закрытую конформацию после загрузки крРНК в фермент.Однако эксперименты по титрованию crRNA показали, что формирование популяции с высоким FRET менее эффективно для вариантов I960P, W971A / D / K (дополнительный рисунок S11A). Напротив, вариант W971F и вариант ΔBH легко образовывали закрытое состояние при добавлении крРНК даже при низких концентрациях крРНК (дополнительный рисунок S11A). Если вариант предпочтительно принял открытое состояние в форме апо, загрузка crRNA была неэффективной. Это предполагает, что для подмножества вариантов BH связывание crRNA или конформационный переход из открытого в закрытое состояние нарушается, что приводит к уменьшению количества бинарного комплекса (дополнительный рисунок S15).Напротив, образование тройного комплекса эффективно индуцируется при добавлении целевой ДНК во всех вариантах BH (фиг. 5 и дополнительный рисунок S11B), что подразумевает, что мутации в BH не влияют на загрузку целевой ДНК. Обратите внимание, что во всех вариантах Cas12a средняя популяция FRET показывает относительно широкое распределение, предполагая, что это состояние более гибкое по сравнению с состоянием с высоким FRET (дополнительный рисунок S16).

Взятые вместе, данные smFRET указывают, что субнабор вариантов BH не только нарушен в их активности расщепления, но что изменения в BH также нарушают эффективное образование бинарных комплексов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Одиночные эффекторные нуклеазы Cas9 и Cas12a системы CRISPR – Cas типа II образуют характерную двулопастную структуру, состоящую из долей REC и Nuc, соединенных мостиковой спиралью. В Cas9 BH проникает глубоко в долю REC и контактирует прямо или косвенно с ДНК-мишенью, crRNA и tracrRNA (51-56). Богатый аргинином пластырь в BH ориентирует зародышевые нуклеотиды crRNA, чтобы они подвергались воздействию растворителя. Таким образом, crRNA может легко образовывать пару оснований с целевой цепью ДНК.Следовательно, мутации в BH Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpyCas9) влияют на связывание РНК и целевой ДНК, определение несоответствия и стабильность петли РНК (41,42,56,57). Несколько вариантов BH SpyCas9 показали повышенную специфичность, что сделало их более подходящими для целей генной инженерии (41). ЧД FnCas12a также соединяет доли REC и Nuc, но не входит так глубоко в долю REC, как это наблюдается для SpyCas9 (2,21). BH FnCas12a не находится в тесном контакте с целевой ДНК или crRNA, а контактирует только с сахарно-фосфатным остовом crRNA (31).Затравочная область crRNA вместо этого организована доменом REC1. Тем не менее, наш мутационный анализ показывает, что BH Cas12a вносит вклад в каталитическую активность и специфичность фермента. Удаление всей BH сильно снижает каталитическую активность. Точно так же вариант SpyCas9 с делецией BH был неактивным (58). Это показывает, что BH является важным сегментом для обоих ферментов. Кроме того, мы оценили, является ли спиральная природа BH или закрепление BH в домене REC предпосылкой для полной каталитической активности.Введение остатка пролина в положение 960 в BH привело к снижению активности обрезки NTS, показывая, что спиральная природа необходима для достижения полного спектра активности Cas12a. Нарушение закрепления BH в домене REC влияет на скорость реакции расщепления и / или активность обрезки. Заряженные аминокислоты приводили к снижению скорости расщепления ДНК. Кроме того, активность обрезки Cas12a была потеряна. Напротив, замена аланина не влияла на расщепление и немного снижала активность обрезки.Замена W971 остатком фенилаланина лишь незначительно влияла на активность расщепления. Обрезка НТС пострадала незначительно. Различный эффект мутаций может быть объяснен с биохимической точки зрения: заряженные остатки вызывают отталкивание BH от гидрофобного кармана в домене REC2, тогда как небольшая незаряженная замена аланина все еще может уместиться в кармане. Фенилаланин также является гидрофобным остатком и, скорее всего, может функционально заменить триптофан.Следовательно, этот вариант затронут незначительно. Подобно некоторым вариантам, оцениваемым в этой работе, Swarts et al. идентифицировал мутанты Cas12a, которые проявляли пониженную активность обрезки (например, R918, D920, S1083, R1218, D1255, D1227). Однако эти варианты составляют активный центр или находятся в тесном контакте с каталитическими остатками. Это не относится к вариантам, протестированным в этом исследовании. Примечательно, что все варианты BH показали более высокую селективность в отношении нацеливания на ДНК. В отличие от дикого типа, все варианты BH не переносили субстраты с несовпадением в положении 10 R-петли.Кроме того, варианты BH W971K и W971D действительно различали субстраты с несоответствием в положении 20. Swarts et al. протестировал эффективность расщепления FnCas12a с использованием линеаризованных вариантов субстрата плазмиды с несовпадениями с crРНК (2). Эти эксперименты показали, что несовпадение в положении 2 предотвращает расщепление ДНК, в то время как несовпадение в положениях 10 и 20 приводит к примерно 50% и 100% расщеплению соответственно. Результаты для позиций несовпадения 10 и 20 согласуются с нашими данными.Однако мы все еще наблюдаем расщепление ДНК-мишени субстратом MM 2 (65% относительно субстрата MM 0). Возможно, эти различия обусловлены природой субстрата (линеаризованная плазмида или короткая дцДНК). Strohkendl et al. показал, что несовпадения по R-петле замедляют связывание AsCas12a с ДНК (19). Поскольку образование R-петли является этапом, ограничивающим скорость расщепления, пониженная скорость образования R-петли влияет на скорость расщепления субстрата. В случае AsCas12a скорость расщепления наиболее резко снижалась, когда использовался субстрат с несовпадениями в положениях 2, 4 или 16, в то время как несовпадения в положениях 10, 18 и 21 приводили только к небольшому снижению скорости расщепления.Таким образом, наши данные показывают различия в относительной толерантности AsCas12a и FnCas12a к несовпадениям по всей R-петле (например, несоответствие в положении 2 хорошо переносится FnCas12a, но приводит к почти 100-кратному снижению скорости расщепления в случае AsCas12a). В случае SpyCas9 введение двойной замены пролина в BH приводило к увеличению специфичности. Однако эти эффекты могут быть объяснены стабилизирующей ролью BH в образовании R-петли в SpyCas9 (41,42). BH FnCas12a контактирует только с фосфатным остовом crRNA, особенно в области псевдоузла (2).Поэтому мы предполагаем, что ЧД стабилизирует R-петлю косвенным образом. Более того, дестабилизация закрепления ЧД, по-видимому, увеличивает чувствительность к рассогласованию. Учитывая, что варианты W971K / D также демонстрируют пониженную активность расщепления и обрезки, кажется правдоподобным, что закрепление BH является важным для стабильного образования R-петли.

Чтобы рационализировать наблюдаемые дефекты обрезки и чувствительность к рассогласованию на основе структурных данных, мы тщательно проверили все доступные структуры Cas12a.Поразительно, но мы обнаружили, что длина ЧД увеличивается при образовании тройного комплекса. Примечательно, что структурные изменения в BH происходят в тандеме со структурными изменениями в соседней спирали 1 домена RuvC (Figure 6A-D). Изменение положения связывающего кармана в домене REC требует позиционного сдвига триптофана 971 на 8,7 Å, чтобы обеспечить стыковку остатка в его связывающем кармане также в тройном комплексе (рис. 6A, B). Чтобы способствовать этому перемещению W971, остаток должен высвобождаться из спирали 1, как это наблюдается в тройных комплексных структурах, которые показывают, что спираль 1 укорачивается на шесть остатков, тем самым высвобождая W971 в гибкую петлю, которая соединяет BH и спираль 1.Одновременно BH удлиняется приблизительно на два остатка и четыре остатка в FnCas12a и LbCas12a, соответственно. Следовательно, эти две спирали действуют согласованно как «подвесные спирали», чтобы компенсировать большие конформационные изменения в доменах REC при переходе в тройной комплекс. Часть BH не разрешается в структуре бинарного комплекса, указывая на то, что это гибкий регион в комплексе Cas12a-crRNA. Кроме того, консервативный остаток лизина (K978 в FnCas12a) в спирали 1 контактирует с основной цепью целевой ДНК в тройном комплексе.Из-за сдвига положения спирали 1 при переходе в тройной комплекс K978 идеально ориентирован для взаимодействия с ДНК. В то время как K978 расположен в середине спирали 1 в бинарном комплексе, он смещен к N-концу реконструированной спирали 1 и не попадает в гибкую петлю в тройном комплексе. Это указывает на то, что интеграция K978 в спираль 1 важна для функционирования в качестве основания, контактирующего с ДНК. Кажется вероятным, что некоторые мутации, введенные в BH FnCas12a, влияют на тандемное движение BH и спирали 1 и, следовательно, контакты ДНК и положение REC доменов немного изменяются.Это может включать контакты остатков спирали 1 с фосфатным остовом ДНК-мишени в R-петле (например, K978) (2). В свою очередь, это может иметь негативное влияние на процесс образования R-петли и тем самым увеличивать чувствительность FnCas12a к несоответствию. В целом эти сбои, скорее всего, являются причиной наблюдаемого дефекта обрезки. Например, образование протяженной BH в тройном комплексе может быть предотвращено вариантом I960P, который расположен в середине BH. Однако, хотя предполагается, что пролин разрывает спираль, мы не можем исключить, что введение пролина может быть приспособлено гибкой природой BH.Точно так же отсутствие всей ЧД полностью разрушает связанные события перестройки спиральной структуры. Помимо отталкивания остатков W971D или W971K из кармана гидрофобного связывания, эти замены могут также влиять на образование удлиненной BH, поскольку положение 971 перемещается в самое начало петли (рядом с концом BH). Примечательно, что расположение тандемной спирали сохраняется во всех изученных до сих пор вариантах Cas12a (дополнительный рисунок S17).

Рисунок 6.

Влияние спирали мостика на конформационную гибкость и каталитическую активность Cas12a. ( A ) и ( B ) Сравнение структурной перестройки BH и спирали 1 относительно домена REC при переходе от бинарного комплекса к тройному. (A) Структурные элементы в бинарном (PDB: 5NG6) и (B) в тройном (PDB: 6I1K) комплексе FnCas12a. Структуры были выровнены относительно области REC в качестве контрольной точки. Для наглядности показаны только мостовая спираль (BH, зеленый), спираль 1 и область REC (темно-серый).Триптофан 971 выделен красным цветом, а лизин 978 — синим. ( C и D ) Сравнение длины BH, спирали 1 и связывающего линкера в (C) бинарном (PDB: 5NG6) и (D) тройном комплексе (PDB: 6I1K). Триптофан 971 выделен красным цветом, а лизин 978 — синим. ( E ) В состоянии апо FnCas12a может принимать две конформации: закрытое (высокая популяция FRET) и открытое состояние (низкая популяция FRET). Связывание (пре-) крРНК вызывает закрытие фермента. Чтобы связать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК-мишень, Cas12a снова открывается, что приводит к образованию средней популяции FRET в измерениях FRET одной молекулы.Мостовая спираль (BH, зеленая) является центральным структурным элементом в Cas12a, который соединяет долю REC и Nuc с связывающим остатком триптофаном 971 (показан красным), который закрепляет BH в гидрофобном кармане в доле REC. Длина BH (зеленый), смежной спирали 1 (серый) и соединяющего линкера (черный), а также положение W971 повторно регулируются при переходе от бинарного комплекса к тройному (см. Вставки). Мутации в BH или замена W971 влияют на уравнивающую активность Cas12a и влияют на равновесие между открытым и закрытым состоянием Cas12a.

Рисунок 6.

Влияние мостиковой спирали на конформационную гибкость и каталитическую активность Cas12a. ( A ) и ( B ) Сравнение структурной перестройки BH и спирали 1 относительно домена REC при переходе от бинарного комплекса к тройному. (A) Структурные элементы в бинарном (PDB: 5NG6) и (B) в тройном (PDB: 6I1K) комплексе FnCas12a. Структуры были выровнены относительно области REC в качестве контрольной точки. Для наглядности показаны только мостовая спираль (BH, зеленый), спираль 1 и область REC (темно-серый).Триптофан 971 выделен красным цветом, а лизин 978 — синим. ( C и D ) Сравнение длины BH, спирали 1 и связывающего линкера в (C) бинарном (PDB: 5NG6) и (D) тройном комплексе (PDB: 6I1K). Триптофан 971 выделен красным цветом, а лизин 978 — синим. ( E ) В состоянии апо FnCas12a может принимать две конформации: закрытое (высокая популяция FRET) и открытое состояние (низкая популяция FRET). Связывание (пре-) крРНК вызывает закрытие фермента. Чтобы связать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК-мишень, Cas12a снова открывается, что приводит к образованию средней популяции FRET в измерениях FRET одной молекулы.Мостовая спираль (BH, зеленая) является центральным структурным элементом в Cas12a, который соединяет долю REC и Nuc с связывающим остатком триптофаном 971 (показан красным), который закрепляет BH в гидрофобном кармане в доле REC. Длина BH (зеленый), смежной спирали 1 (серый) и соединяющего линкера (черный), а также положение W971 повторно регулируются при переходе от бинарного комплекса к тройному (см. Вставки). Мутации в BH или замена W971 влияют на уравнивающую активность Cas12a и влияют на равновесие между открытым и закрытым состоянием Cas12a.

Кристаллические и крио-ЭМ структуры (2,17,20,21,30–32,43–48), а также исследования smFRET (20,23,59) показали, что не только сам белок, но и связанные нуклеиновые кислоты претерпевают существенные конформационные изменения. Следовательно, мы использовали измерения smFRET, чтобы проследить движение доли REC и Nuc Cas12a WT и вариантов BH. Наши данные точно воспроизводят структурные состояния бинарного и тройного комплекса, известные из кристаллических структур, и добавляют ранее отсутствующую информацию о конформационном состоянии фермента апо.Более конкретно, мы наблюдаем закрытие белка Cas12a при загрузке crRNA и небольшое повторное открытие при загрузке ДНК. Это согласуется со структурными данными для FnCas12a и AsCas12a (2,17,20,21,30–32,43–48). Донг и др. заметил, что LbCas12a является конформационно гибким в своем состоянии апо и что добавление crRNA к LbCas12a привело к определенному структурному состоянию, которое можно было проанализировать с помощью криоэлектронной микроскопии (30). Эти данные согласуются с нашими данными smFRET, которые привели к обнаружению двух конформационных состояний для апо фермента FnCas12a и определенного конформационного состояния для бинарного комплекса (отраженного высокой популяцией FRET).Наше открытие, что тройной комплекс более гибкий, чем бинарный, согласуется с недавним моделированием молекулярной динамики, которое показало повышенную гибкость REC и доли Nuc в тройном комплексе (50). Мы обнаружили, что загрузка ДНК-мишени более эффективна, когда предоставляется оцДНК-мишень, предполагая, что образование комплекса Cas12a-crRNA-dsDNA является энергетически требовательным. В соответствии с кристаллическими структурами, увеличение доли REC и Nuc при переходе в тройной комплекс не зависит от одноцепочечной или двухцепочечной природы ДНК, и загрузка TS достаточна, чтобы вызвать конформационные изменения в Cas12a ( 21).Конформационная гетерогенность была обнаружена для фермента апо. Здесь Cas12a может принимать открытое или закрытое состояние. Кристаллическая или крио-ЭМ структура апо-фермента с высоким разрешением пока недоступна. Но существование открытого состояния было предложено на основе исследований smFRET, проведенных Stella et al. В то время как мы проводили измерения smFRET на диффундирующих молекулах, Stella et al. использовал иммобилизованные белки Cas12a для отслеживания относительного расстояния между REC и долей Nuc (20). Фермент апо и все комплексы, протестированные в исследовании Stella et al. показал широкий спектр конформаций, которые нельзя было распознать как дискретные состояния. Однако в состоянии апо относительно высокая доля молекул была обнаружена в состоянии с низким FRET, что подтверждает открытие открытого состояния в этом исследовании. Учитывая центральное положение ЧД, казалось возможным, что удаление ЧД может привести к коллапсу состояния Cas12a. Однако в наших измерениях FRET одиночных молекул этого не наблюдалось. Интересно, что структурная целостность сохраняется даже в вариантах ΔBH / ΔΔBH, и эти варианты могут эффективно загружать крРНК и нацеливать ДНК.Принимая во внимание предыдущий вывод о том, что BH структурно перестраивается вместе со спиралью 1 домена RuvC I, кажется правдоподобным, что неповрежденная спираль 1 (возможно, в дополнение к структурным элементам в доменах PI и WED) отвечает за правильное расстояние между доля REC и Nuc. Следовательно, BH влияет только на равновесие между открытым и закрытым состояниями фермента апо. Дополнительные структурные данные, которые объясняют структурное состояние BH и спирали 1 в апо-ферменте, будут представлять большой интерес в этом контексте.

Следует отметить, что варианты, которые вызывают пониженную активность обрезки, дают более точную картину расщепления, поскольку расщепление происходит в основном в двух сайтах. Напротив, фермент WT производит по крайней мере пять промежуточных продуктов на пути к двум конечным продуктам. Более того, особенно варианты W971D и W971K дополнительно лучше распознают несовпадающие субстраты, делая эти варианты Cas12a более специфичными. Хотя загрузка crRNA, по-видимому, происходит с пониженной эффективностью в этих вариантах, они не влияют на конформационные изменения, необходимые для каталитического цикла Cas12a.Следовательно, эти варианты могут быть лучше подходят для приложений редактирования генов, чем WT, поскольку они могут гарантировать расщепление ДНК с повышенной специфичностью и селективностью.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

Наборы данных, созданные во время и / или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарны д-ру Саре Уиллкомм и д-ру Кевину Крамму за плодотворные обсуждения, а также Элизабет Пиехатчек и Эльке Папст за техническую помощь.

Вклад авторов : D.G. задумал исследование. E.W., L.J. и A.S. провели измерения одной молекулы. E.W., L.J. и A.S. проанализировали данные по одной молекуле. E.W., L.J., A.S. и Г.З. очистили белки и создали варианты Cas12a. E.W., L.J., A.S. и Г.З. провели EMSA и анализы расщепления. E.W. и D.G. написал газету. Все авторы прокомментировали статью.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Deutsche Forschungsgemeinschaft [SPP2141 и SFB960-TP7 — D.ГРАММ.]. Финансирование платы за открытый доступ: Deutsche Forschungsgemeinschaft [SPP2141 и SFB960-TP7 to D.G.].

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

Банкноты

Нынешний адрес: Леонард Якоб, Департамент фармакологии и токсикологии, Институт фармации, Университет Регенсбурга,

Регенсбург, Германия

СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Zetsche

B.

Gootenberg

J.S.

Abudayyeh

O.O.

Slaymaker

И.М.

Макарова

К.С.

Essletzbichler

P.

Volz

S.E.

Joung

J.

Van Der Oost

J.

Regev

A.

Cpf1 — это одиночная РНК-управляемая эндонуклеаза системы CRISPR – Cas

Ячейка

2015

163

759

771

Swarts

D.C.

van der Oost

J.

Jinek

M.

Структурная основа для обработки направляющих РНК и зависимого от семян нацеливания на ДНК с помощью CRISPR – Cas12a

Мол. Ячейка

2017

66

221

233

Макарова

К.С.

Вольф

Ю.И.

Иранзо

Дж.

Шмаков

С.А.

Алхнбаши

О.С.

Браунс

S.J.J.

Шарпантье

E.

Cheng

D.

Haft

D.H.

Horvath

P.

Эволюционная классификация систем CRISPR – Cas: выброс класса 2 и производные варианты

Nat. Rev. Microbiol.

2019

18

67

83

Нуньес

Дж.K.

Kranzusch

P.J.

Noeske

J.

Wright

A.V.

Образование комплекса Cas1 – Cas2 опосредует приобретение спейсера во время CRISPR – Cas адаптивного иммунитета

Nat. Struct. Мол. Биол.

2014

21

528

534

Amitai

G.

Sorek

R.

Адаптация CRISPR – Cas: понимание механизма действия

Nat. Rev. Microbiol.

2016

14

67

76

Mohanraju

P.

Makarova

K.S.

Zetsche

B.

Zhang

F.

Koonin

E.V.

van der Oos

J.

Различные эволюционные корни и механистические вариации систем CRISPR – Cas

Наука

2016

353

aad5147

Charpentier

E.

Richter

H.

van der Oost

J.

White

M.F.

Пути биогенеза РНК-проводников в адаптивном иммунитете CRISPR – Cas архей и бактерий

FEMS Microbiol. Ред.

2015

39

428

441

Hille

F.

Richter

H.

Wong

S.P.

Bratovič

M.

Ressel

S.

Charpentier

E.

Биология CRISPR – Cas: вперед и назад

Ячейка

2018

172

1239

1259

Jinek

M.

Chylinski

K.

Fonfara

I.

Hauer

M.

Doudna

J.A.

Charpentier

E.

Программируемая ДНК-эндонуклеаза, управляемая двойной РНК, в адаптивном бактериальном иммунитете

Наука

2012

337

816

821

Zetsche

B.

Heidenreich

M.

Mohanraju

P.

Fedorova

I.

Kneppers

J.

Degennaro

E.M.

Winblad

N.

Choudhury

S.R.

Abudayyeh

O.O.

Гутенберг

J.S.

Мультиплексное редактирование генов с помощью CRISPR-Cpf1 с использованием единого массива crRNA

Nat. Biotechnol.

2017

35

31

34

Knott

G.J.

Дудна

J.A.

CRISPR – Cas направляет будущее генной инженерии

Наука (80-.).

2018

361

866

869

Barrangou

R.

Doudna

J.A.

Применение технологий CRISPR в исследованиях и за его пределами

Nat. Biotechnol.

2016

34

933

941

Pickar-Oliver

A.

Gersbach

C.A.

Новое поколение технологий и приложений CRISPR – Cas

Nat. Rev. Mol. Cell Biol.

2019

20

490

507

Шмаков

S.

Smargon

A.

Scott

D.

Cox

D.

Pyzocha

N.

Yan

W.

Абудайе

OO

Гутенберг

J.S.

Макарова

К.С.

Вольф

Ю.I.

Разнообразие и эволюция систем CRISPR – Cas класса 2

Nat. Rev. Microbiol.

2017

15

169

182

Nishimasu

H.

Nureki

O.

Структуры и механизмы управляемых CRISPR РНК эффекторных нуклеаз

Curr. Opin. Struct. Биол.

2017

43

68

78

Фонфара

И.

Richter

H.

Bratovič

M.

Le Rhun

A.

Charpentier

E.

CRISPR-ассоциированный ДНК-расщепляющий фермент Cpf1 также обрабатывает предшественник CRISPR RNA.

Природа

2016

532

517

521

Yamano

T.

Zetsche

B.

Ishitani

R.

Zhang

F.

Nishimasu

H.

Nureki

O.

Структурная основа для распознавания канонических и неканонических PAM с помощью CRISPR-Cpf1

Мол. Ячейка

2017

67

633

645

Specht

D.A.

Xu

Y.

Lambert

G.

Массивно параллельные анализы CRISPRi выявляют скрытые термодинамические детерминанты связывания dCas12a

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2020

117

11274

11282

Strohkendl

I.

Saifuddin

F.A.

Rybarski

J.R.

Finkelstein

I.J.

Russell

R.

Кинетическая основа целевой специфичности ДНК CRISPR – Cas12a

Мол. Ячейка

2018

71

816

824

Stella

S.

Mesa

P.

Thomsen

J.

Paul

B.

Alcón

P.

Jensen

S.B.

Saligram

B.

Moses

M.E.

Hatzakis

N..S.

Montoya

G.

Конформационная активация способствует катализу CRISPR – Cas12a и сбросу активности эндонуклеазы

Ячейка

2018

175

1856

1871

Swarts

D.

Jinek

M.

Механистическое понимание цис- и транс-действующей дезоксирибонуклеазной активности Cas12a

Мол. Ячейка

2018

73

589

600

Cofsky

J.C.

Karandur

D.

Huang

C.J.

Witte

I.P.

Курьян

J.

Doudna

J.A.

CRISPR – Cas12a использует асимметрию R-петли для образования двухцепочечных разрывов

Элиф

2020

9

e55143

Jeon

Y.

Choi

Y.H.

Jang

Y.

Yu

J.

Goo

J.

Lee

G.

Jeong

Y.K.

Ли

S.H.

Kim

I.S.

Ким

J.S.

Прямое наблюдение поиска и расщепления ДНК-мишени с помощью CRISPR – Cas12a

Nat. Commun.

2018

9

2777

Singh

D.

Mallon

J.

Poddar

A.

Wang

Y.

Tippana

R.

Yang

O.

Bailey

S.

Ha

T.

Наблюдение в реальном времени за запросом ДНК-мишени и выпуском продукта с помощью RNA- управляемая эндонуклеаза CRISPR Cpf1 (Cas12a)

Proc. Natl. Акад. Sci.

2018

115

5444

5449

Chen

J.S.

Ма

E.

Харрингтон

L.B.

Да Коста

M.

Tian

X.

Palefsky

J.M.

Doudna

J.A.

Связывание мишени CRISPR – Cas12a высвобождает неизбирательную активность одноцепочечной ДНКазы

Наука (80-.).

2018

360

436

439

Li

S.Y.

Cheng

Q.X.

Li

X.Y.

Zhang

Z.L.

Gao

S.

Cao

R.B.

Zhao

G.P.

Ван

Дж.

Ван

Дж. М.

Обнаружение нуклеиновых кислот с помощью CRISPR – Cas12a

Cell Discov.

2018

4

18

21

Гутенберг

J.S.

Abudayyeh

O.O.

Kellner

M.J.

Joung

J.

Collins

J.J.

Zhang

F.

Мультиплексная и портативная платформа для обнаружения нуклеиновых кислот с Cas13, Cas12a и Csm6

Наука

2018

6387

439

444

Broughton

J.P.

Deng

X.

Yu

G.

Fasching

C.L.

Servellita

V.

Singh

J.

Miao

X.

Streithorst

J.A.

Granados

A.

Sotomayor-Gonzalez

A.

Обнаружение SARS-CoV-2 на основе CRISPR – Cas12

Nat. Biotechnol.

2020

38

870

874

Донг

Д.

Рен

К.

Qiu

X.

Zheng

J.

Guo

M.

Guan

X.

Liu

H.

Li

N.

Чжан

Б.

Ян

Д.

Кристаллическая структура Cpf1 в комплексе с CRISPR RNA

Природа

2016

532

522

526

Ямано

Т.

Nishimasu

H.

Zetsche

B.

Hirano

H.

Slaymaker

IM

Li

Y.

Fedorova

I.

Fedorova

I. Накане

т.

Макарова

кс

Кунин

Е.В.

Кристаллическая структура Cpf1 в комплексе с направляющей РНК и целевой ДНК

Ячейка

2016

165

949

962

Stella

S.

Alcón

P.

Montoya

G.

Структура комплекса R-петли эндонуклеазы Cpf1 после расщепления целевой ДНК

Природа

2017

546

559

563

Подбородок

J.W.

Санторо

S.W.

Мартин

А.Б.

King

D.S.

Wang

L.

Schultz

P.G.

Добавление п-азидо-L-фенилаланина в генетический код Escherichia coli

J. Am. Chem. Soc.

2002

124

9026

9027

Grohmann

D.

Werner

F.

Tinnefeld

P.

Создание соединений — стратегии биофизики флуоресценции одиночных молекул

Curr. Opin. Chem. Биол.

2013

17

691

698

Подбородок

J.W.

Санторо

S.W.

Мартин

А.Б.

King

D.S.

Wang

L.

Schultz

P.G.

Добавление п-азидо-L-фенилаланина в генетический код Escherichia coli

J. Am. Chem. Soc.

2002

124

9026

9027

Saxon

E.

Bertozzi

C.R.

Инженерия клеточной поверхности с помощью модифицированной реакции Штаудингера

Наука (80-.).

2000

287

2007

2010

Кройцбург

S.C.A.

Wu

W.Y.

Mohanraju

P.

Swartjes

T.

Alkan

F.

Gorodkin

J.

Хорошая направляющая, плохая направляющая: эффективность расщепления Cas12a

Nucleic Acids Res.

2020

48

3228

3243

Schrimpf

W.

Barth

A.

Hendrix

J.

Lamb

DC

PAM: платформа для интегрированного анализа визуализации, флуоресценции одиночных молекул и ансамбля данные

Biophys. J.

2018

114

1518

1528

Nir

E.

Michalet

X.

Hamadani

K.M.

Laurence

T.A.

Neuhauser

D.

Kovchegov

Y.

Weiss

S.

Гистограммы FRET одиночных молекул, ограниченные дробовым шумом: сравнение теории и экспериментов

J. Phys. Chem. В

2006

110

22103

22124

Hellenkamp

B.

Schmid

S.

Doroshenko

O.

Opanasyuk

O.

Kühnemuth

R.

Амвросий

Б.

Азнаурян

М.

Барт

А.

Биркедал

В.

Прецизионность и точность измерений FRET одиночных молекул — эталонное исследование в нескольких лабораториях

Nat. Методы

2018

15

669

676

Братович

M.

Fonfara

I.

Chylinski

K.

Gálvez

E.J.C.

Салливан

T.J.

Boerno

S.

Timmermann

B.

Boettcher

M.

Charpentier

E.

Аргинины мостиковой спирали играют решающую роль в чувствительности Cas9 к несовпадениям

Nat. Chem. Биол.

2020

16

587

595

Babu

K.

Amrani

N.

Jiang

W.

Yogesha

S.D.

Нгуен

Р.

Цинь

P.Z.

Rajan

R.

Мостиковая спираль Cas9 модулирует расщепление целевой ДНК и устойчивость к несоответствию

Биохимия

2019

58

1905

1917

Peng

R.

Li

Z.

Xu

Y.

He

S.

Peng

Q.

Wu

L.

Wu

Y.

Qi

J.

Wang

P.

Shi

Y.

Структурное понимание многоступенчатого ингибирования CRISPR – Cas12a с помощью AcrVA4

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2019

116

18928

18936

Нисимасу

Х.

Ямано

Т.

Гао

Л.

Zhang

F.

Ishitani

R.

Nureki

O.

Структурная основа для распознавания измененного PAM с помощью спроектированного CRISPR-Cpf1

Мол. Ячейка

2017

67

139

147

Zhang

H.

Li

Z.

Daczkowski

C.M.

Габель

C.

Mesecar

A.D.

Chang

L.

Структурная основа ингибирования CRISPR-Cas12a белками против CRISPR

Клеточный микроб-хозяин

2019

25

815

826

Knott

G.J.

Cress

B.F.

Liu

J.

Thornton

B.W.

Лью

R.J.

Аль-Шайеб

Б.

Розенберг

Д.J.

Hammel

M.

Adler

B.A.

Лобба

M.J.

Структурная основа ингибирования AcrVA4 специфического CRISPR – Cas12a

Элиф

2019

8

e49110

Dong

L.

Guan

X.

Li

N.

Zhang

F.

Zhu

Y.

Ren

K.

Yu

L.

Zhou

F.

Han

Z.

Gao

N.

Белок анти-CRISPR отключает Cas12a типа V путем ацетилирования

Nat. Struct. Мол. Биол.

2019

26

308

314

Гао

P.

Ян

H.

Rajashankar

K.R.

Хуанг

Z.

Patel

D.J.

Эндонуклеаза CRISPR – Cas Cpf1 типа v использует уникальный механизм опосредованного crRNA распознавания ДНК-мишени

Cell Res.

2016

26

901

913

Hendrix

J.

Lamb

D.C.

Импульсное перемежающееся возбуждение: принципы и применение

2013

Elsevier Inc

Saha

A.

Arantes

P.R.

Narkhede

Y.B.

Hsu

R.V.

Jinek

M.

Palermo

G.

ДНК-индуцированный динамический переключатель запускает активацию CRISPR – Cas12a

J. Chem. Инф. Модель.

2020

6427

6437

Yamada

M.

Watanabe

Y.

Гутенберг

J.S.

Hirano

H.

Ran

FA

Nakane

T.

Ishitani

R.

Zhang

F.

Nishimasu

H.

H. Нуреки

O.

Кристаллическая структура минимального Cas9 из Campylobacter jejuni показывает молекулярное разнообразие в системах CRISPR – Cas9

Мол.Ячейка

2017

65

1109

1121

Jiang

F.

Taylor

D.W.

Chen

J.S.

Kornfeld

J.E.

Zhou

K.

Thompson

A.J.

Ногалес

E.

Doudna

J.A.

Структуры комплекса CRISPR – Cas9 R-петля, примированного для расщепления ДНК

Наука (80-.).

2016

351

867

871

Jinek

M.

Jiang

F.

Taylor

D.W.

Штернберг

S.H.

Kaya

E.

Ma

E.

Anders

C.

Hauer

M.

Zhou

K.

Lin

S.

Структуры эндонуклеаз Cas9 обнаруживают РНК-опосредованную конформационную активацию

Наука

2014

343

1247997

Anders

C.

Niewoehner

O.

Duerst

A.

Jinek

M.

Структурные основы распознавания PAM-зависимой целевой ДНК эндонуклеазой Cas9

Природа

2014

513

569

573

Nishimasu

H.

Cong

L.

Yan

W.X.

Ран

FA

Zetsche

B.

Li

Y.

Kurabayashi

A.

Ishitani

R.

Zhang

F.

Нуреки

О.

Кристаллическая структура Staphylococcus aureus Cas9

Ячейка

2015

162

1113

1126

Nishimasu

H.

Ran

F.A.

Hsu

P.D.

Konermann

S.

Shehata

SI

Dohmae

N.

Ishitani

R.

Zhang

F.

Nureki

O.

Ячейка

2014

156

935

949

Zeng

Y.

Cui

Y.

Zhang

Y.

Zhang

Y.

Liang

M.

Chen

H.

Lan

J.

Song

G.

Lou

J.

Инициирование, распространение и динамика комплекса CRISPR-SpyCas9 R-loop

Nucleic Acids Res.

2018

46

350

361

Shams

A.

Higgins

S.A.

Fellmann

C.

Laughlin

T.J.

Lew

R.

Lukarska

M.

Arnold

M.

Staahl

B.T.

Savage

D.F.

Комплексный ландшафт делеций CRISPR-Cas9 идентифицирует минимальные РНК-управляемые ДНК-связывающие модули

2020

Zhang

L.

Sun

R.

Yang

M.

Peng

S.

Cheng

Y.

Chen

C.

Конформационная динамика и сайты расщепления cas12a модулируются комплементарностью между crRNA и ДНК

iScience

2019

19

492

503

© Автор (ы) 2021. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Замена спиральной рампы на мосту Джорджа Вашингтона

Замена спиральной рампы моста Джорджа Вашингтона

2020-01-18 06:41:44

Винтовая рампа Palisades Interstate Parkway (PIP) на мосту Джорджа Вашингтона (GWB) в Нью-Джерси является важным транспортным узлом для пассажиров северного Нью-Джерси, направляющихся в Нью-Йорк.Замена рампы спирали PIP стоимостью 80 миллионов долларов является одним из многих проектов в программе восстановления Джорджа стоимостью 1,92 миллиарда долларов для администрации порта Нью-Йорка и Нью-Джерси, которая включает в себя восстановление моста, которому более 88 лет, и его подходы. Конструкции пандусов были построены в 1940-х годах, а пандус PIP helix ежегодно используется 7,4 миллионами автомобилей.

STV подготовил окончательный проект для замены, который состоит из трех отдельных мостов, по которым осуществляется направленное движение от PIP к GWB.Новаторский подход использовал серию временных мостов, которые поддерживали существующий уровень обслуживания во время строительства и требовали от подрядчика проектирования временных конструкций.

«Этот проект уникален, потому что фирма заменила пандус спирали PIP на существующей трассе в сильно перегруженном районе, который испытывает большие объемы движения и имеет ограниченное пространство», — говорит Джордж Тауфик, старший юрист и старший менеджер проекта STV, который выполнял функции руководитель дизайн-проекта по замене пандуса спирали PIP.«Это одна из самых загруженных зон движения в регионе».

Также непросто было организовать интенсивную координацию между заинтересованными сторонами на протяжении всего проектирования и строительства. Среди других задач проекта было поддержание в рабочем состоянии существующих инженерных сетей и ИТ-служб.

В 2018 году Альянс действий Нью-Джерси удостоил замену спиральной рампы PIP наградой за ведущие инфраструктурные проекты штата Нью-Джерси.

© Engineering News Record.Просмотреть все статьи.

Замена спиральной рампы на мосту Джорджа Вашингтона
/article/Replacing+the+George+Washington+Bridge+Helix+Ramp/3581985/646654/article.html

Список проблем

27 сентября / 4 октября 2021 г.

13/20 сентября 2021 г.

30 августа / 6 сентября 2021 г.

__16/23 августа 2021 г.

16/23 августа 2021

августа 02/09, 2021

ENR 19/26 июля 2021 г.

12.05.2021

21/28 июня 2021 г.

7/14 июня 2021

24/31 мая 2021 г.

17.10.2021

26 апреля / 3 мая 2021 г.

GWIC, предварительная версия

12/19 апреля 2021

29 марта / 5 апреля 2021 г.

15/22 марта 2021 г.

1/8 марта 2021

15/22 февраля 2021

1/8 февраля 2021

18/25 января 2021 г.

4/11 января 2021 г.

21/28 декабря, 2020

14/7 декабря 2020

23/30 ноября, 2020

16 сентября

26 октября / 2 ноября 2020

12-19 октября 2020

28 сентября — 5 октября 2020

14/21 сентября 2020

31 августа / 7 сентября 2020

Национальный ежегодник и ежегодник ACE

Ежегодник ACE

17/24 августа, 2020

3/10 августа 2020

20/27 июля, 2020

6/13 июля, 2020

22/29 июня 2020

8/15 июня 2020

25 мая / 1 июня 2020

18/11 мая 2020

27 апреля / 4 мая 2020

13/20 апреля 2020

30 марта / 6 апреля 2020

16/23 марта 2020

2/9 марта 2020

17/24 февраля 2020

3/10 февраля 2020

20/27 января 2020

6/13 января 2020

23/30 декабря 2019

16 декабря 2019

2/9 декабря 2019

18/25 ноября 2019

4/11 ноября 2019

28 октября 2019

14/21 октября 2019

7 октября 2019

23/30 сентября 2019 г.

16 сентября 2019

9 сентября 2019 г.

19/26 августа 2019

5/12 августа 2019

22/29 июля, 2019

15.08.2019

24 июня / 1 июля 2019

17 июня 2019

10 июня 2019

27 мая / 3 июня 2019 г.

13/20 мая 2019

29 апреля / 6 мая 2019 г.

22 апреля 2019

15 апреля 2019

1/8 апреля 2019 г.

18/25 марта 2019

11 марта 2019 г.

18/25 февраля 2019

4/11 февраля 2019

21/28 января 2019

14.07.2019

24/31 декабря 2018 г.

17 декабря 2018

3/10 декабря 2018

19/26 ноября 2018

5/12 ноября

29 октября 2018

22 октября 2018

15 октября 2018

8 октября 2018

24 сентября / 1 октября 2018 г.

17 сентября 2018

3/10 сентября 2018

20/27 августа 2018

6/13 августа 2018

23/30 июля 2018 г.

16 июля 2018

2 июля 2018

25 июня 2018

18 июня 2018

11 июня 2018

28 мая / 4 июня 2018 г.

14/21 мая 2018

7 мая 2018

30 апреля 2018

23 апреля 2018

9/16 апреля 2018

2 апреля 2018

19/26 марта 2018

12 марта 2018

5 марта 2018

19/26 февраля 2018

12 февраля 2018

5 февраля 2018

29 января 2018

22 января 2018

8/15 января 2018

25 декабря / 1 января 2017 г.

18/11 декабря 2017

27 ноября / 4 декабря 2017 г.

20 ноября 2017

6/13 ноября 2017

30 октября 2017

23 октября 2017

16 октября 2017

9 октября 2017

25 сентября / 2 октября

18 сентября 2017

11 сентября 2017 г.

21/28 августа 2017

7-14 августа 2017

24/31 июля 2017

17 июля 2017

10 июля 2017

26 ИЮНЯ / 3 ИЮЛЯ 2017

ENR, 19 июня 2017 г.

ENR, 12 июня 2017 г.

29 мая 2017

22 мая 2017

8 мая 2017

1 мая 2017

17 апреля 2017

10 апреля 2017

3 апреля 2017

20 марта 2017

13 марта 2017

6 марта 2017

20 февраля 2017

13 февраля 2017

6 февраля 2017

30 января 2017

23 января 2017

9 января 2017

26 декабря 2016

12 декабря 2016

28 ноября 2016

21 ноября 2016

7 ноября 2016

31 октября 2016

24 октября 2016 г.

17 октября 2016

10 октября 2016

26 сентября 2016

19 сентября 2016

5 сентября 2016

22 августа 2016

8 августа 2016

25 июля 2016

18 июля, 2016

11 июля 2016

27 июня 2016

20 июня 2016

13 июня 2016

30 мая 2016

23 мая, 2016

16 мая 2016

9 мая 2016

25 апреля

18 апреля 2016

11 апреля 2016

28 марта / 4 апреля 2016

21 марта 2016

14 марта 2016

7 марта 2016

22 февраля 2016

15 февраля 2016 г.

No related posts.